专利名称：一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡及制备方法和应用的制作方法
一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡及制备方法和应用
技术领域：
本发明属于纳米超分子材料制备，特别是一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡及制备方法和应用。
背景技术：
刺激响应囊泡因其在化学、生物和材料科学等领域有着诸多重要的应用价值而在近年受到广泛的关注，参见1) G. Fuks, R. M. Talom, F. Gauffre. Chem. Soc.Rev. 2011, 40, 2475-2493 ； 2 ) D. M. Vriezema, M. C. Aragones, J. A. A. ff. Elemans,J. J. L. M. Cornelissen, A. E. Rowan, R. J. M. Nolte. Chem. Rev. 2005, 105,1445 - 1489 ；3)X. Guo, F. C. SzokaJr. Acc. Chem. Res. 2003，36，335 - 341。利用刺激响应囊泡对药物进行负载而后将负载的药物在特定信号响应的位点靶向地进行释放成为其中的一个研究热点，这是因为靶向药物传递在提高负载药物药效的同时还可以降低药物的毒副作用。目前报道的刺激响应囊泡大多是对外界光、电、热和PH等刺激信号进行响应的体系，参见1)C. Wang, Q. Chen, H. Xu, Z. Wang, X. Zhang. Adv. Mater. 2010, 22, 2553-2555 ；2) A. Napoli,M. Valentini,N. Tirelli,M. Muller, J. A. HubbelI. Nat. Mater. 2004，3，183-189 ；3)K. Wang,D. -S. Guo, Y. Liu. Chem. Eur. J. 2010, 16, 8006-8011 ；4)M. Lee, S. -J. Lee, L. -H. Jiang. J. Am.Chem. Soc. 2004, 126，12724-12725，而对于生物体内存在的酶进行响应的囊泡体系还并不多见，参见D. -S. Guo, K. Wang, Y. -X. Wang, Y. Liu. J. Am. Chem. Soc. 2012，134，10244-10250。酶响应信号不但是生物相容的，而且具有高的灵敏度和选择性，此外许多疾病都与酶的非正常表达有关，例如，在病变的胰腺组织中胰蛋白酶就会过表达从而导致其含量高于正常值，参见1) P. K. Buamah, A. ff. Skillen. Clin. Chem. 1985，31，876-877 ；2) A. F. Paszcuk,N. L. M. Quintao, E. S. Fernandes, L. Juliano, K. Chapman, P. Andrade-Gordon, Μ. Μ. Campos,N. Vergnolle, J. B. Calixto. Eur. J. Pharmacol. 2008, 581, 204-215 ；3) Z. Lu, F. Wu, X. Miao,ff. Yu. Clin. J. Med. Offic. 2008, 36，488-490，因而设计包括胰蛋白酶在内的酶响应囊泡对相关药物进行负载并将其在特定酶位点靶向地进行释放具有重大的理论意义和在生物医药领域广阔的现实应用前景。然而，将酶响应位点引入到囊泡体系中通常需要复杂和耗时的共价键合成，这不 但提高了制备成本，而且还会将有机溶剂和毒性试剂在合成过程中引入到囊泡体系中从而降低了其生物兼容性和酶反应的活性。除共价键合成的方法外，利用非共价键相互作用的超分子手段也可以智能地构筑刺激响应囊泡，参见l)Y.Wang，H. Xu, X. Zhang. Adv.Mater. 2009, 21，2849 - 2864 ；2) X. Zhang, C. Wang. Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 94 - 101 ；3)C. Wang, Z. Wang, X. Zhang. Acc. Chem. Res. 2012, 45, 608-618。刺激响应基团可以通过非共价键相互作用的方式引入到囊泡体系中来，从而避免了共价键的合成。
发明内容本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡及制备方法和应用，该超分子囊泡系基于磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白二元超分子组装的胰蛋白酶调控的囊泡，鱼精蛋白的存在可以诱导磺化杯[4]芳烃发生两亲聚集；该超分子囊泡是生物相容的且在室温下具有很好的稳定性，此外该超分子囊泡对胰蛋白酶具有良好的选择响应性；该超分子囊泡可以负载亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素，负载后的阿霉素可以高选择性的释放于胰蛋白酶的靶向位点。
本发明的技术方案
一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡，其构筑单元以磺化杯[4]芳烃(SC4A)为主体，以鱼精蛋白(Protamine)为客体，通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体。
—种所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，将磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液目标物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。
所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白的浓度分别为O. 02mmol/L和 50 μ g/mL0
所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的浓度为O. 2mg/mL。
一种所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的应用，将亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素负载到超分子囊泡的空腔内。
本发明的优点是基于磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白二元超分子组装构筑的纳米超分子囊泡，制备方法简便，主、客体原料用量少；该纳米超分子囊泡生物相容且具有很好的稳定性；该纳米超分子囊泡对胰蛋白酶具有良好的选择响应性；该超分子囊泡可以负载亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素，负载后的阿霉素可以高选择性的释放于胰蛋白酶的靶向位点，其在靶向药物传递治疗胰腺癌领域具有广阔的应用前景。
图I为通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体示意图。
图2为鱼精蛋白存在下磺化杯[4]芳烃的临界聚集浓度图。
图3为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡的动态光散射图。
图4为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡的高分辨透射电子显微镜图像。
图5为构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。
图6为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和NIT-I细胞 (小鼠胰岛β细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞数量图。
图7为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和NIT-I细胞 (小鼠胰岛β细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞形态图。
图8为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入胰蛋白酶五小时后导致体系透光率的变化图。
图9为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入胰蛋白酶五小时后的高分辨透射电子显微镜图像。
图10为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/ mL碱性磷酸酯酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。
图11为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/ mL核酸外切酶I导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。
图12为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入O. 5U/ mL葡萄糖氧化酶导致体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图。
图13为阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和ifepG-2细胞(人的肝癌细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞数量图。
图14为阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和ifepG-2细胞(人的肝癌细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞形态图。
图15为阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和PANC-1细胞(人的胰腺癌细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞数量图。
图16为阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和PANC-1细胞(人的胰腺癌细胞)进行孵化二十四小时后记录的和空白对照组对比的活细胞形态图。
具体实施方式
实施例
一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，将磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白溶解于水中并均匀混合即可制得超分子囊泡溶液目标物，所述磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白的浓度分别为O. 02mmol/L和50 μ g/mL，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚，所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的浓度为O. 2mg/mL。图I为通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体示意图。
在没有鱼精蛋白存在下横化杯[4]芳经在水溶液中不能自聚集，参见M. Rehm, M. Frank, J. Schatz. Tetrahedron Lett. 2009, 50, 93-96 ;如图 2 所不，鱼精蛋白的存在可以诱导磺化杯[4]芳烃在水溶液中进行两亲聚集，固定鱼精蛋白的浓度为50yg/mL时,磺化杯[4]芳烃的临界聚集浓度为.O. 012mmol/Lo
1)该超分子囊泡的粒径和形貌
分别通过动态光散射和高分辨透射电子显微镜所表征，图3为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡的动态光散射图；图4为磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡的高分辨透射电子显微镜图像。图5为构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系450nm波长处透光率随时间变化的曲线图，图中显示该超分子囊泡在450nm波长处的透光率随时间不发生变化，表明该超分子囊泡具有很好的稳定性。
如图6所示，磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和NIT-1细胞(小鼠胰岛β细胞)进行孵化二十四小时后记录的活细胞数量和空白对照组对比无统计学差异。如图7所示，磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和NIT-I细胞(小鼠胰岛β细胞)进行孵化二十四小时后记录的活细胞形态和空白对照组对比也无明显变化。图6和图7表明该超分子囊泡是生物相容的。2)该超分子囊泡的胰蛋白酶高选择响应性的实验验证图8为往构筑的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白组装的超分子囊泡体系中加入胰蛋白酶五小时后导致体系透光率的变化图，图中表明在超分子囊泡溶液中加入胰蛋白酶五小时后，导致其在450nm波长处透光率升高到大约95%，证明了加入胰蛋白酶(O. 2mg/mL)五小时即可使囊泡几乎完全解聚；往构筑的磺化杯[4]芳烃和胰蛋白酶组装的超分子囊泡体系中加入胰蛋白酶五小时后体系光散射强度会剧烈下降，同样证实了囊泡的解聚。体系加入胰蛋白酶五小时后的高分辨透射电子显微镜图像，如图9所示，也证实了囊泡的完全解聚。对比试验在超分子囊泡溶液中加入碱性磷酸酯酶、核酸外切酶I以及葡萄糖氧化酶，体系在450nm波长处的透光率随时间不发生变化，如图10、图11、图12所示，表明加 入其它类型的酶不能像加入胰蛋白酶一样可以使囊泡解聚。—种上述制备的胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的应用，将亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素负载到超分子囊泡的空腔内，方法如下I)将阿霉素、磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白溶解于水中后混合均匀得到溶液，将该溶液离心和透析后即可制得阿霉素负载的超分子囊泡，所述阿霉素、磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白的浓度分别为O. 002mmol/L, O. 02mmol/L和50 μ g/mL。2)将阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和IfepG-2细胞(人的肝癌细胞)进行孵化二十四小时后记录各组活细胞的数量和形态并和空白对照组进行对比，如图13、图14所示，图中表明，被超分子囊泡负载的阿霉素由于囊泡的保护作用对肝癌细胞的杀伤作用较之单纯的阿霉素有所下降。将阿霉素以及负载阿霉素的磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白超分子组装的胰蛋白酶响应囊泡和PANC-I细胞(人的胰腺癌细胞)进行孵化二十四小时后记录各组活细胞的数量和形态并和空白对照组进行对比，如图15、图16所示，图中表明，被超分子囊泡负载的阿霉素对胰腺癌细胞的杀伤作用较之单纯的阿霉素并没有改变，这是由于在胰腺癌细胞溶液中的胰蛋白酶将会使该超分子囊泡几乎完全解聚从而将负载的阿霉素靶向性的完全释放出去。
权利要求
1.一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡，其特征在于构筑单元以磺化杯[4]芳烃(SC4A)为主体，以鱼精蛋白(Protamine)为客体,通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体。
2.一种如权利要求I所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于将磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液目标物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。
3.根据权利要求2所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白的浓度分别为O. 02mmol/L和50 μ g/mL。
4.根据权利要求2所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的浓度为O. 2mg/mL。
5.一种如权利要求I所述胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡的应用，其特征在于将亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素负载到超分子囊泡的空腔内。
全文摘要
一种胰蛋白酶调控的纳米超分子囊泡，其构筑单元以磺化杯[4]芳烃为主体，以鱼精蛋白为客体，通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体，其制备方法是将磺化杯[4]芳烃和鱼精蛋白溶解于水中，均匀混合后得到超分子囊泡溶液目标物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。本发明的优点是该纳米超分子囊泡的制备方法简便，主、客体原料用量少；该纳米超分子囊泡生物相容且具有很好的稳定性，对胰蛋白酶具有良好的选择响应性；该超分子囊泡可以负载亲水的广谱抗癌药物分子阿霉素，负载后的阿霉素可以高选择性的释放于胰蛋白酶的靶向位点，其在靶向药物传递治疗胰腺癌领域具有广阔的应用前景。
文档编号A61K47/42GK102973945SQ201210538680
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者刘育, 王魁, 郭东升, 赵梦尧 申请人:南开大学