专利名称：b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感嗜血杆菌疫苗，尤其涉及b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用。
背景技术：
流感嗜血杆菌根据荚膜的性质分为a，b，c，d，e, f型及不可分型，其中b型流感嗜血杆菌的侵袭力最强。由b型流感嗜血杆菌(Hib)引起的化脓性脑膜炎、肺炎、关节炎、会厌炎等疾病，已成为全球一个重要的公共卫生问题。而研制成功的Hib多糖疫苗及Hib结合疫苗，可有效预防由b型流感嗜血杆菌引起的感染。对于5对以下儿童，尤其是2周岁以下的婴幼儿，Hib多糖疫苗的保护效果不佳。
优良方法。蛋白载体具有T细胞依赖的特性，在荚膜多糖特异性抗原上加上蛋白载体可将非T细胞依赖性的多糖抗原转变为T细胞依赖性抗原，激发机体的T辅助细胞产生的一系列的免疫增强效应。对于免疫系统尚未发育成熟的婴幼儿，尤其是2周岁以下的婴幼儿而言，结合疫苗大大增强了其免疫效果。现有技术广泛采用溴化氰活化，己二酰肼衍生，并在碳二亚胺存在下，与蛋白载体例如破伤风类毒素进行结合制备Hib结合疫苗，获得多糖蛋白结合物。多糖蛋白结合物溶液是一个十分复杂的混合物体系，结合物中残留未结合的多糖和载体蛋白质等。在对多糖蛋白结合物进行纯化的过程中，多采用O. 2mol/L的氯化钠溶液作为流动相。但是，采用O. 2mol/L的氯化钠溶液作为流动相，多糖蛋白结合物回收率低。而且多糖蛋白结合物的纯化采用O. 2mol/L的氯化钠溶液，不利于后续工序包括分装后产品的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用于提高多糖蛋白结合物的稳定性。本发明另一目的是提供b型流感嗜血杆菌结合疫苗的剂型。本发明再一目的是提供疫苗在制备预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎感染性疾病的药物中的应用。本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗，包括如下组分和含量b型流感嗜血杆菌多糖 20-30 μ g/ml ；破伤风类毒素40-100 μ g/ml;pH 7.2-7. 5。所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其制备方法包括以下步骤I)制备b型流感嗜血杆菌多糖；2)制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液；3)纯化以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化步骤2)中的混合液，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。其中，所述TRIS-HCl缓冲液，浓度为20-100mmol/L，pH值为7. 2-7. 5，优选所述TRIS-HCl 缓冲液浓度为 20-50mmol/L。具体地，步骤如下I)发酵培养b型流感嗜血杆菌采用b型流感嗜血杆菌生产用菌株，菌株复壮、培养、发酵，发酵液通过甲醛杀菌后收获培养物；2)制备b型流感嗜血杆菌多糖收集的培养物经过离心去除菌体,加入沉淀剂沉淀上清液中的多糖，经过研磨、乙醇沉淀去除核酸，并经过冷酚溶液抽提去除杂蛋白，并通过超滤方法去除残留小分子物质，通过乙醇沉淀制备精制多糖；3)制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物精制多糖经过溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亚胺作用下与破伤风类毒素结合； 4)以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。本发明所述疫苗还包括赋形剂，所述赋形剂为TRIS-HCl缓冲液和氯化钠或TRIS-HCl缓冲液和乳糖。其中，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为8-12mmol/L、氯化钠7. 5-9. 5mg/ml、乳糖20_30mg/ml。本发明还提供含有上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制剂，包括液体剂和冻干制剂。本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的液体剂的组分为b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、TRIS-HCl缓冲液和氯化钠组成，其中，各组分的浓度为b型流感嗜血杆菌多糖 20-30 μ g/ml ；破伤风类毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 缓冲液8_12mmol/L ；氯化钠7. 5-9. 5mg/ml。上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗液体剂的制备方法，包括如下步骤I)制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗；2)半成品配制及分装步骤I)中加入TRIS-HCl缓冲液，氯化钠溶液稀释，余量为注射用水，进行分装。本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的冻干制剂的组分为b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、TRIS-HCl缓冲液和乳糖，其中，各组分的浓度为b型流感嗜血杆菌多糖 20-30 μ g/ml ；破伤风类毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 缓冲液8_12mmol/L ；乳糖20_30mg/ml。上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的冻干剂型的制备方法，包括如下步骤I)制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗；2)半成品配制及分装步骤I)中加入TRIS-HCl缓冲液，氯化钠溶液稀释，余量为注射用水，进行分装；
3)冻干-50'40 V预冻3_4h，然后在真空度5 15Pa下，温度缓慢升温至-20°C ±2°C，温度维持5 7h，再阶梯式升温至30°C，温度维持6 8h，冻干结束。所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗可预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等感染性疾病。本发明有益效果在多糖蛋白结合物进行纯化的过程中采用缓冲液体系TRIS-HCl缓冲液体系，不仅能够显著地提高多糖蛋白结合物纯化过程的回收率，而且可增加后续工序产品的稳定性，维持产品的pH值在中性范围内，避免因为pH值的变化导致产品的质量的潜在变化。 概念的阐释多糖含量b型流感嗜血杆菌结合疫苗的抗原为b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖，抗原含量以多糖的含量进行表征，无论是在原液制备还是在半成品配制过程中。多糖蛋白结合物混合液指在进行多糖与蛋白结合试验后尚未经过柱层析进行分离，包含有多糖与蛋白结合物大分子及未结合的多糖、蛋白小分子物质。多糖回收率本专利中多糖回收率指的是在进行多糖与蛋白结合后回收的符合《中华人民共和国药典》三部(2010年版)“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”规程规定的原液质量的Hib结合物原液中多糖质量与多糖投料量的比值。高分子结合物多糖蛋白结合物的混合物已经过柱层析纯化收集的大分子物质。高分子结合物含量是在经过柱层析纯化后收集的大分子物质中，按照《中华人民共和国药典》三部(2010年版)中高分子结合物含量测定方法测得的以百分数表示的大分子含量。Kd < O. 2的回收率指采用排阻色谱进行测定结合物分子的分配系数时，以Kd< O. 2峰面积与总峰面积的比值。效力试验用以表征Hib结合疫苗在动物体内产生抗体的水平。按照《中华人民共和国药典》三部(2010年版)中效力试验方法检测.以高于阴性对照组小鼠血清的Cutoff值的百分比表示。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液的制备I)采用《中华人民共和国药典》三部(2010年版)中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”规程规定的菌种培养、发酵及精制多糖制备工艺步骤，制备b型流感嗜血杆菌精制多糖。采用b型流感嗜血杆菌生产用菌株(MH200201，北京民海生物科技有限公司自主分离)，菌株复壮、培养、发酵，发酵液通过甲醛杀菌后收获培养物；2)收集的培养物经过离心去除菌体，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀上清液中的多糖，离心收集多糖，经过研磨、乙醇沉淀去除核酸，并经过冷酚溶液抽提去除杂蛋白，并通过超滤方法去除残留小分子物质，通过乙醇沉淀制备精制多糖；3)精制多糖经过溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亚胺作用下与破伤风类毒素结合，多糖与破伤风类毒素的质量比为1: 1，制得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液；参考杨耀、黄镇等人发表的《b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的研制》(中国生物制品学杂志，2002，Vol. 15, No. 3)；4)混合液分别用 O. 02mol/L 的 TRIS-HC1 缓冲液、pH7. 2-7. 5,0. 2mol/L 的氯化钠溶液作为流动相，按不高于层析柱体积10%的上样量上样，两种介质的上样量相同。收集V。附近的洗脱液，除菌过滤。表I同一批结合物不同纯化介质的检定结果
权利要求
1.一种b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，包括如下组分和含量 b型流感嗜血杆菌多糖 20-30 u g/ml ； 破伤风类毒素40-100 u g/ml ；pH 值 7. 2-7. 5。
2.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，其制备方法包括以下步骤 1)制备b型流感嗜血杆菌多糖； 2)制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液； 3)纯化以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化步骤2)中的混合液，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
3.根据权利要求2所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液，浓度为 20-100mmol/L，pH 值为1. 2-7. 5。
4.根据权利要求3所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为20_50mmol/L。
5.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，还包括赋形剂。
6.根据权利要求5所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述赋形剂为TRIS-HCl缓冲液和氯化钠； 或TRIS-HCl缓冲液和乳糖。
7.根据权利要求6所述的结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为8_12mmol/L、氯化钠浓度为 7. 5-9. 5mg/ml、乳糖浓度为 20-30mg/ml。
8.根据权利要求1-7任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述结合疫苗进一步制备得到百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗。
9.权利要求1-8任一项所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗在制备用于预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎感染性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用。所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物，pH 7.2-7.5。本发明在b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合物进行纯化的过程中采用TRIS-HCl缓冲液体系，不仅能够显著地提高多糖蛋白结合物纯化过程的回收率，而且可增加后续工序产品的稳定性，维持产品的pH值在中性范围内，避免因为pH值的变化导致产品的质量的潜在变化。
文档编号A61K39/102GK103007264SQ20121054627
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者孙晓东, 刘建凯 申请人:北京民海生物科技有限公司