专利名称：粉防己甲素在制备大肠杆菌氟喹诺酮外排泵抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域，涉及粉防己甲素的一种制药新用途。
背景技术：
伴随着抗菌药物的广泛和不当使用，各种类型的耐药菌不断出现，抗感染治疗面临着严峻的挑战。文献报道，目前病原菌对大多数喹诺酮类药物的耐药率已达50%以上，个别地区个别药物的耐药率甚至达到100%，细菌耐药问题已经到了十分严峻的地步。对养殖业来说，细菌耐药使抗菌药物的治疗效果严重降低，治疗成本升高，养殖风险增大，养殖效益明显下降。为了增强药物的治疗效果，部分养殖场开始加大剂量使用抗菌药物，这不仅增加了药物的毒副作用，更严重的是可能导致药物残留等食品安全问题，进而危及人类健康。控制细菌耐药性的方法有:一、停止使用现有的抗菌药物；二、研发新的抗菌药物；三、提高现有抗菌药物的治疗效果，通过消除耐药质粒、配合使用外排泵抑制剂等方式控制或逆转细菌耐药。可行性分析显示，在我国完全停止使用现有的抗菌药物，将使养殖业遭受到毁灭性的打击，而新药研发需要耗费大量的人力、物力、财力且周期长，开发出的新药也可能很快产生耐药性，因此，这两种方法很难从根本上解决当前细菌耐药日益严重的问题。从近期研究成果来看，耐药质粒仅能导致喹诺酮类药物的低水平耐药，并不是细菌对喹诺酮类药物耐药的主要原因，因此，耐药质粒的消除对于逆转细菌对喹诺酮类药物的耐药实际意义不大，配合使用外排泵抑制剂可能才是现阶段行之有效的控制方案。外排泵抑制剂不但能够有效抑制细菌中药物转运蛋白(又称外排泵)的活性，阻止药物外排，恢复细菌对药物的敏感性，而且可以使细菌在药物环境中不被诱导耐药。因此，开发高效、安全的外排泵抑制剂，对于抗感染治疗来说具有重要意义和良好的市场前景。中药是我国特有的天然资源，具有资源广、毒副作用低等特点，在治疗感染、逆转(或抑制)肿瘤细胞耐药性等方面显示了独特的作用 ，可以从中药中寻找既有良好耐药消除效果又没有毒副作用或毒副作用较低的细菌外排泵抑制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于从中药中寻找高效、安全的细菌外排泵抑制剂。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
粉防己甲素在制备大肠杆菌{Escherichia coli )氟喹诺酮外排泵抑制剂中的应用。进一步，所述氟喹诺酮外排泵包括acrA外排泵。进一步，所述氟喹诺酮为氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。本发明的有益效果在于:本发明公开了粉防己甲素在制备大肠杆菌氟喹诺酮外排泵抑制剂中的应用，研究结果显示，粉防己甲素可以使耐药大肠杆菌(氟喹诺酮主动外排表型且acrA基因高表达菌株)的氟喹诺酮最低抑菌浓度明显降低、菌体内药物蓄积浓度明显增加、外排泵基因acrA表达量明显降低，从而可以提高耐药大肠杆菌对氟喹诺酮的敏感性，降低药物使用量，降低治疗成本，减少药物残留等食品安全问题；同时，粉防己甲素为植物中存在的天然化合物，无致畸、致癌等副作用，安全无毒。从市场应用前景来看，以生猪养殖为例，按全国生猪存栏量56000万头、发病率为30%计算，有16800万头需要使用抗菌药物，按每次使用抗菌药物8mL、每天使用2次、连用2 3天计算，抗菌药物需要量为537600^806400万毫升，按每IOmL售价I元、平均耐药率为50%计算，因为细菌耐药造成的直接经济损失高达2.69^4.03亿元，而根据本发明，将粉防己甲素与氟喹诺酮类药物配合使用，可以较大幅度地挽回上述经济损失。因此，本发明不仅拓宽了粉防己甲素的应用领域，提高了粉防己甲素的市场价值，并且为抗感染治疗提供了一种高效、安全的细菌外排泵抑制剂，具有重要的社会意义和良好的市场前景。
图1为环丙沙星在大肠杆菌ATCC 25922和大肠杆菌73_2体内的蓄积浓度随时间变化曲线图，其中CIP表示环丙沙星，Tet表示粉防己甲素。图2为acrA基因和gapA基因的标准曲线。图3为acrA基因和gapA基因的溶解曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行详细的描述。实施例中使用的大肠杆菌ATCC 25922为非耐药大肠杆菌，购自中国兽医药品监察所。 实施例中使用的大肠杆菌73-2为耐药大肠杆菌(氟喹诺酮主动外排表型且acrA基因高表达)，由发明人所在研究室分离鉴定与保存，已在文献(张静等.中药提取物对耐药大肠杆菌MIC及acrA基因表达量的影响.中国兽医学报.2012，32(5): 728- 732)中公开，公众可以通过西南大学荣昌校区动物医学系药学教研室获得该菌株。其具体分离鉴定方法如下:
a.多重耐药大肠杆菌的筛选
于2007年7月至2008年5月，从重庆市荣昌、大足、铜梁、合川、北碚、长寿、涪陵、武隆、黔江、綦江、江津共11个区县的规模化养猪场采集了 157份仔猪黄白痢病料，从中分离鉴定出138株大肠杆菌，对其中96株致病性大肠杆菌进行了 34种常用抗菌药物(利福平、链霉素、庆大霉素、呋喃唑酮、阿米卡星、卡那霉素、壮观霉素、四环素、米诺环素、妥布霉素、呋喃妥因、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、复方新诺明、多粘菌素B、环丙沙星、氧氟沙星、左氟沙星、氟哌酸、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢克洛、氨曲南、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西丁、亚胺培南、头孢呋肟)的耐药性分析，药敏试验按照2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)出版的药敏试验手指南M100-S15中推荐的Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法进行，以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株，并按照CLSI推荐的耐药(R)、中介(I)、敏感(S)分界点判断结果，最终从96株致病性大肠杆菌中筛选出80株多重耐药菌株。b.靶位基因突变的耐药大肠杆菌的排除文献报道，大肠杆菌对抗菌药物产生高度耐药的主要原因包括靶位基因突变和外排基因高水平表达。为此，对筛选出的80株多重耐药大肠杆菌进行靶位基因测序，以排除存在靶位基因突变的菌株。设计并委托上海生工生物工程技术有限公司合成以下 2 对引物:GyrA_F:5，-gagggatagcggttagatgagc-3’ (SEQ ID N0.1), GyrA-R:5，-ccgttcaccagcaggttagg-3J (SEQ ID N0.2)；ParC-F:5，-aatgagcgatatggcagagcg-3，(SEQ ID N0.3),ParC_R:5，-ttggcagacg-ggcaggtag-3，(SEQ ID N0.4)。提取耐喹诺酮类大肠杆菌的染色体DNA作为模板，分别用上述2对引物PCR扩增GyrA基因和ParC基因，反应程序如下:95°C预变性10分钟，然后94°C变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物纯化后委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序，并将测序结果与GenBank公开的GyrA基因序列和ParC基因序列进行比较，最终从80株多重耐药大肠杆菌中筛选出5株不存在靶位基因突变的菌株。c.大肠杆菌氟喹诺酮主动外排表型阳性菌的筛选
文献报道，细菌对喹诺酮类药物蓄积浓度减少的主要影响因素包括细菌膜通透性降低和细菌膜上药物主动外排泵激活。为此，以碳酰氰氯苯腙(CCCP)为外排泵抑制剂，以氧氟沙星、环丙沙星为氟喹诺酮类药物模型，对筛选出的5株不存在靶位基因突变的耐药大肠杆菌进行CCCP加入前后氧氟沙星、环丙沙星摄入量的比较研究，以进一步筛选出氟喹诺酮主动外排表型阳性菌。菌体内氧氟沙星摄入量的测定采用高效液相色谱-荧光检测法，色谱条件如下:色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mmX4.6mm, 5 μ m),流动相为0.05mol/L枸橼酸水溶液与乙腈的混合液(体积比为79:21)并用乙醇胺调节pH至4.0，流速为1.0ml/min，进样量为20 μ L，激发波长为295nm，发射波长为505nm，柱温为40°C。将氧氟沙星用0.lmol/L、pH3.0的盐酸甘氨酸缓冲液溶解制成浓度分别为IX 10_5、5 X 10_5、2 X 10_4、I X 10'2 X 10'IX 10_2、2X 10_2、1X KTmg/L的溶液，采用上述高效液相色谱_荧光检测法测定氧氟沙星的峰面积，绘制峰面积与氧氟沙星浓度的标准曲线；然后设置对照组和实验组，并以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株，两组分别将待检菌株接种于20mL LB肉汤培养基中，37°C摇床培养至指数生长中期(0D650= 0.7 0.8)，4°C、4000rpm离心10分钟，收集菌体，称重，用50mmol/L、pH7.0的PBS洗涤两次并重悬至细菌浓度为40mg/mL，37°C温浴10分钟，实验组加入CCCP至终浓度为40 μ g/mL,对照组不加入任何试剂,然后两组分别加入氧氟沙星至终浓度为10mg/L，在氧氟沙星加入后第30、60、120、180、300、600、900、1500秒分别取样
0.25mL,立即加入1.25mL预冷的50mmol/L、pH7.0的PBS, 4°C>8000rpm离心5分钟，收集菌体，用0.lmol/L、pH3.0的盐酸甘氨酸缓冲液洗涤后，加入0.lmol/L、pH3.0的盐酸甘氨酸缓冲液ImL重悬，26°C水浴2小时，离心取上清，用上述高效液相色谱-荧光检测法测定氧氟沙星的峰面积，再根据上述峰面积与氧氟沙星浓度的标准曲线计算出氧氟沙星的浓度。菌体内环丙沙星摄入量的测定也采用高效液相色谱-荧光检测法，色谱条件如下:色谱柱为Welch ultimate poIar-RP C18 柱(250mmX 4.6mm, 5 μ m),流动相为 0.025mol/L 憐酸溶液与乙腈的混合液(体积比为79:21)并用三乙胺调节pH至3.5，流速为1.0mL/min，进样量为20 μ L，激发波长为280nm，发射波长为450nm，柱温为30°C。测定方法与上述氧氟沙星摄入量的测定方法相同，只是用环丙沙星替代氧氟沙星。根据上述实验结果，最终从5株不存在靶位基因突变的耐药大肠杆菌中筛选出3株氟喹诺酮主动外排表型阳性菌。d.外排泵基因acrA高表达大肠杆菌的筛选文献报道，acrA外排泵是大肠杆菌最主要的外排泵之一，且该外排泵底物广泛，可以外排吖啶橙、结晶紫、溴乙啶、镰孢菌酸、四环素、氯霉素、新霉素、红霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氯比西林、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、利福平等多种药物。当acrA基因高水平表达时，大肠杆菌往往会产生高水平耐药。为此，对筛选出的3株氟喹诺酮主动外排表型阳性菌进行acrA基因表达量检测，以进一步筛选出acrA基因高表达菌株。实验以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株。根据GenBank中登录的大肠杆菌acrA基因的保守序列，合成其特异性引物:acrA_F:5’ -acgttgatgtgacccagtcc-3’ (SEQ ID N0.5), acrA-R:5’-gctttgccgttctcttgtttc-3’ (SEQ ID N0.6);同时，以大肠杆菌看家基因 gapA 作为内参基因，合成其特异性引物:gapA_F:5’ -cagaacatcatcccgtcctctac-3’ (SEQ ID N0.7),gapA-R:5，-taccagtcagtttgccattcagtt-3，(SEQ ID N0.8)。用总 RNA 提取试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)提取待检菌株的总RNA，用TaKaRa反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，分别采用上述特异性引物，荧光定量PCR扩增acrA基因和gapA基因，计算acrA基因表达量。PCR反应体系如下:SYBR Premix EXXTaq II (2X)12.5μ ,上下游引物(10 μ mol/L)各 μ ，cDNA模板2μ ，DH2O (灭菌双蒸水)8.5μ ,总体积为25μ ;反应程序如下:95°C预变性30秒，95°C变性5秒，60°C退火30秒，共40个循环。根据上述实验结果，最终从3株氟喹诺酮主动外排表型阳性菌中筛选出I株acrA基因高表达的菌株，将其命名为大肠杆菌73-2。一、粉防己甲素降低耐药大肠杆菌73-2的氟喹诺酮最低抑菌浓度(MIC)
1、氟喹诺酮和粉防己甲素分别对大肠杆菌73-2的MIC的测定
米用试管二倍稀释法:取10支无菌试管,标记1-10后，I至7号管各加入灭菌肉汤2mL,然后1号管加入药液2mL，混匀，再吸取2mL至2号管中，混匀，再从2号管中吸取2mL至3号管中，如此依次倍比稀释至7号管，混匀后吸取2mL弃去，最后各管加入100 μ L菌液，震荡混匀 ’另8号管加入灭菌肉汤2mL作为空白对照，9号管加入药液2mL作为药液对照，10号管加入菌 液100 μ L作为菌液对照；37°C培养16-18小时，无菌生长的最低浓度即为MIC。实验以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。结果见表I。表1氟喹诺酮和粉防己甲素分别对大肠杆菌的MIC ( μ g/mL)
权利要求
1.粉防己甲素在制备大肠杆菌co7i)氟喹诺酮外排泵抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氟喹诺酮外排泵包括acrA外排泵。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氟喹诺酮为氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。 ·
全文摘要
本发明公开了粉防己甲素在制备大肠杆菌氟喹诺酮外排泵抑制剂中的应用，研究结果显示，粉防己甲素可以使耐药大肠杆菌(氟喹诺酮主动外排表型且acrA基因高表达菌株)的氟喹诺酮最低抑菌浓度明显降低、菌体内药物蓄积浓度明显增加、外排泵基因acrA表达量明显降低，从而可以提高耐药大肠杆菌对氟喹诺酮的敏感性，降低药物使用量，降低治疗成本，减少药物残留等食品安全问题；同时，粉防己甲素为植物中存在的天然化合物，无致畸、致癌等副作用，安全无毒；本发明不仅拓宽了粉防己甲素的应用领域，提高了粉防己甲素的市场价值，而且为抗感染治疗提供了一种高效、安全的细菌外排泵抑制剂。
文档编号A61P31/04GK103202841SQ20121058215
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者吴俊伟, 张静, 刘三侠, 宋小红, 林永乐, 马保瑞, 曾杨梅, 乐小丽, 杨成竹, 刘晴晴 申请人:重庆布尔动物药业有限公司, 西南大学