肽组合物和用于治疗患者的方法
【专利摘要】本发明涉及肽组合物和使用肽组合物治疗前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压和代谢综合征的方法。在优选的实施方案中，本发明涉及包含由所述氨基酸序列GGL（也称为Diapin）、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽的组合物。
【专利说明】肽组合物和用于治疗患者的方法
[0001]本申请要求2011年2月11日提交的美国临时专利申请第61/441，748号的权益。该临时申请由此通过引用全部并入。
[0002]政府利益的声明
[0003]本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的HL68878和HL89544的政府资助下进行。政府对本发明具有一定权利。
【技术领域】
[0004]本发明涉及肽组合物和使用肽组合物治疗前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压和代谢综合征的方法。
[0005]发明背景
[0006]我们身体将我们摄入的食物转化为葡萄糖。血液运输葡萄糖到细胞，细胞将葡萄糖转化为能量。通常，称为胰岛素的蛋白质激素控制血液中葡萄糖水平。当胰岛素生成、胰岛素作用、或两者有缺陷时，会导致在血液中高水平的葡萄糖。糖尿病是特征为这些缺陷的
一组疾病。
[0007]糖尿病的三种最常见形式为I型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。I型糖尿病(之前称为胰岛素依赖型糖尿病或青少年型糖尿病)通常发生在儿童或青少年中。当身体的免疫系统破坏生成胰岛素的胰腺细胞时，它会出现。具有I型糖尿病的人必须一天监控它们血液中糖水平多次，并摄入胰岛素(通过注射或者泵送)以维持恰当水平。当怀孕妇女不耐受葡萄糖时，出现妊娠期糖尿病。妊娠期糖尿病也需要治疗以维持适宜的血糖水平以及避免婴儿出现并发症。具 有妊娠期糖尿病的妇女患上2型糖尿病的风险增加。
[0008]2型糖尿病(之前称为非胰岛素依赖型糖尿病或者成年型糖尿病)通常发生在成年人中。当细胞首先不能恰当使用胰岛素，然后胰腺失去生成胰岛素能力时，它会出现。许多具有2型糖尿病的人通过饮食计划、锻炼方案、减肥和服用口服药物来控制他们的血糖。一些具有2型糖尿病的人也许摄入胰岛素。
[0009]糖尿病危害性大，因为在血液中太多糖能够损害眼睛、肾脏、神经和心脏。糖尿病的并发症包括心脏病、中风、高血压、失明、其他眼部问题(例如糖尿病性视网膜病)、肾脏疾病、神经系统疾病(例如知觉受损或者脚部或手部疼痛、食物消化减缓、腕管综合征和勃起机能障碍)、截肢、牙周病、易患其他疾病(例如肺炎和流行性感冒)、活动能力受损以及抑郁。不受控制的糖尿病能够导致急性威胁生命的事件，例如糖尿病酮症酸中毒和高渗性昏迷。
[0010]糖尿病是美国成年人中肾衰竭、无损伤下肢截瘫和失明新出现病例的主要原因。糖尿病是心脏病和中风的主要原因。糖尿病在2007年美国致死主要原因中排第七。总之，具有糖尿病的人中死亡风险约为没有糖尿病同龄人的两倍。根据美国疾病控制和预防中心，截止2011年I月，糖尿病影响2580万人，占美国人总数的8.3%。另外预估7900万成年人具有前驱糖尿病，该病状是血糖水平比正常高，但未高到足以诊断为糖尿病。前驱糖尿病有时称为空腹葡萄糖降低或者葡萄糖耐量降低。前驱糖尿病本身增加人们患上2型糖尿病、心脏病和中风的风险。许多前驱糖尿病患者在十年内患上2型糖尿病。
[0011]除了生活方式干预外，通常使用药物来治疗前驱糖尿病和2型糖尿病患者以应对糖尿病的并发症。医生处方控制血压和血脂的药物来降低心血管并发症。通常，在具有正常肾功能的年轻和严重患者中，医生处方口服药物二甲双胍以更加直接应对导致糖尿病的缺陷。二甲双胍抑制肝脏葡萄糖生成、增加胰岛素敏感性、增加外周葡萄糖摄入、增加脂肪酸氧化以及降低由胃肠道吸收的葡萄糖。但是，在包括肾脏病症、肺部疾病和肝脏疾病的具有可增加乳酸性酸中毒风险病状的人中禁止使用二甲双胍。
[0012]其他最近批准的药物没有显示出比二甲双胍更加有效，并且各自均具有它们一系列的禁忌症。例如，罗格列酮是用作抗糖尿病药的第一种胰岛素敏化剂之一。它导致脂肪细胞对胰岛素更加敏感。罗格列酮的年销售量在2006年达到峰值$25亿。因为罗格列酮可能与心血管事件风险增加相关，所以欧洲药品局建议在欧洲市场上停止销售该药。美国食品药品管理局允许它仍在市场上销售，但是至2010年9月23日起它受到明显限制。
[0013]也已经研究使用称为人胰岛素原C-肽的前体、以及C-肽的片段来治疗糖尿病。参见国际公开 N0.WO 98/13384、WO 2002/022211、WO 2004/016647、WO 2006/129095 和 WO2007/015069。也参见，Ohtomo 等人，Diabetologia，41:287-291(1998) ;Sato 等人，Cell.Mol.Life Sc1.，61:727-732(2004) ;Hach 等人，Exp.Diabetes Res.:1-6(2008)和 Ido 等人，Science, 277:563-566 (1997)。
[0014]食品蛋白由二十种不同的氨基酸组成并且科学家已经研究摄入葡萄糖时个别氨基酸的作用。参见，Gannon 和 NuttalI，IUBMB life,62:660-668(2010) ;Gannon 等人，Metabolism, 37:1081-1088(1988) ；Gannon 等人，Am.J.Clin.Nutr.,76:1302-1307(2002)和 Kalogeropoulou 等人,Metabolism, 57:1747-1752 (2008)。据报道,氨基酸亮氨酸和甘氨酸降低血糖应答以及刺激另外的胰岛素分泌。该作用需要摄入大量的氨基酸，但同时伴随味道差、不均衡的氨基酸摄入以及损伤肾功能的担忧。
`[0015]胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)是肠降血糖素激素。肠降血糖素激素通过应答营养物质消化的肠细胞分泌。GLP-1的主要生理作用呈现出与糖血控制相关。GLP-1刺激胰岛素释放，抑制胰高血糖素分泌，降低胃排空和增加饱腹感。在具有2型糖尿病的患者中，肠降血糖素作用降低，导致糖血控制变差。已经报道向患者施用GLP-1能通过内源性胰岛素分泌来恢复血糖调节。也已经报道GLP-1施用通过它对延迟胃排空和增加饱腹感的作用来减少能量摄入，因此它可导致体重减轻。最近批准两种GLP-受体激动剂/类似物用于治疗2型糖尿病，艾塞那肽(exenatide) (Byetta'*)和利拉鲁肽(Iiraglutide) (Victoza?)以及其他进入临床阶段。也已经批准一周一次给药的艾塞那肽(Bydureonl制剂。参见，Barnett等人，Diabetes, Obesity and Metabolism.接受的文章在线公开(2011)。
[0016]此外，研究已经证实GLP-1受体的激动剂也作用于心血管相关的功能，例如心率和血压。参见，Grieve 等人，British J.Pharm.，157a: 1340-1351 (2009)。在特定的研究中，喂食Dahl盐敏感性(DSS)大鼠高盐饮食，并单独使用艾塞那肽模拟物(AC3174)或者联合ACE抑制剂(卡托普利)来处理。与卡托普利相比，AC3174具有抗高血压、胰岛素敏化和肾脏保护作用。参见，Liu 等人，Cardiovascular Diabetology, 9 (32):1-10(2010)。
[0017]因此，本领域对前驱糖尿病、糖尿病和它们的并发症的新疗法存在需求。本领域对肥胖、高血压和代谢综合征的新疗法也存在需求。发明概要
[0018]本发明提供用于治疗前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、和降低的胰岛素分泌的产品和方法。
[0019]本发明提供用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐，其中该病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。此外，本发明提供用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列 GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或dLGdL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐，其中该病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。
[0020]也提供在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐，其中与糖尿病相关的并发症是心血管疾病、慢性肾脏病、肾衰竭、膀胱问题、勃起机能障碍、胃轻瘫、眼部疾病、糖尿病性神经病、足或皮肤溃疡、或者下肢截肢。此外，本发明提供在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 组成的至少一种肽或者肽的药学上可接受的盐，其中与糖尿病相关的并发症是心血管疾病、慢性肾脏病、肾衰竭、膀胱问题、勃起机能障碍、胃轻瘫、眼部疾病、糖尿病性神经病、足或皮肤溃疡、或者下肢截肢。
[0021]在所有上述方法中，能够将肽在N-末端处乙酰化、在C-末端处酰胺化、或者两者兼有。能够通过口服、腹膜内、眼睛、皮内、鼻内、皮下、肌肉内或静脉内途径来施用组合物。
[0022]通过本发明提供的药物组合物包括组合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, Gd LdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐、和药学上可接受的赋形剂。它们也包括组合物，其中药物组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐、和药学上可接受的赋形剂。在组合物中，能够将肽在N-末端乙酰化、在C-末端处酰胺化、或者两者兼有。
[0023]本发明提供用于施用药物组合物的试剂盒，该药物组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂，其中试剂盒包括组合物、施用组合物的说明书以及用于向患者施用组合物的装置。此外，本发明提供试剂盒，其中药物组合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽。在试剂盒中，能够将肽在N-末端处乙酰化、在C-末端处酰胺化、或者两者兼有。
[0024]心血管疾病(CVD)是糖尿病患者中致死的主要原因，占约三分之二的死亡数。因此，将CVD风险最小化是管理前驱糖尿病和糖尿病患者的主要临床目标。本发明提供改善血糖控制以及同时降低心血管事件和其他糖尿病相关并发症的风险。
[0025]附图简述[0026]图1显示在C57BL/6J小鼠中口服负荷甘氨酸和葡萄糖之后甘氨酸对血糖的作用。
[0027]图2显示在C57BL/6J小鼠中口服负荷亮氨酸和葡萄糖之后亮氨酸对血糖的作用。
[0028]图3显示在KKay糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖之后Diapin抑制血糖的增加。
[0029]图4显示在KKay糖尿病小鼠中口服负荷淀粉之后Diapin抑制血糖的增加。
[0030]图5显示在KKay糖尿病小鼠中Diapin降低随机血糖。
[0031]图6显示在KKay糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖和Diapin 30min之后Diapin刺
激胰岛素分泌。
[0032]图7显示在KKay糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖和Diapin 30min之后Diapin刺激GLP-1分泌。
[0033]图8显示Diapin以时间和剂量依赖性方式降低KKay糖尿病小鼠的血糖水平。
[0034]图9显示在C57BL/6J小鼠中Diapin对空腹血糖没有作用。
[0035]图10显示ip注射葡萄糖至C57B/6J小鼠之后Diapin抑制血糖的增加。
[0036]图11显示ip注射葡萄糖至C57BL/6J小鼠之后另一种肽GGH对血糖没有作用。
[0037]图12显示ip注射葡萄糖至C57BL/6J小鼠之后两种其他肽(LGG和LGL)对血糖的作用。
[0038]图13显示在C57BL/6J小鼠中口服负荷葡萄糖之后肽LLG对血糖的作用。
[0039]图14显示在C57BL/6J小鼠中口服负荷葡萄糖之后肽GLG和GLL对血糖的作用。
[0040]图15显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和具有酰胺化的C-末端的Diapin对血糖的作用。
[0041]图16显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和具有乙酰化的N-末端的Diapin对血糖的作用。
[0042]图17显示在C57BL/6J小鼠中血糖口服施用葡萄糖之后具有酰胺化的C-末端和乙酰化的N-末端的Diapin对血糖的作用。
[0043]图18显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖30min之前给予的Diapin对血糖的作用。
[0044]图19显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之前I小时给予的Diapin对血糖的作用。
[0045]图20显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和二肽对血糖的作用。
[0046]图21显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和二肽对血糖水平的作用。
[0047]图22显示在ob/ob小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin的作用。
[0048]图23显示在db/db小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin对血糖水平的作用。
[0049]图24显示在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin对血糖水平的作用。
[0050]图25显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后D-Diapin(由D-异构体氨基酸组成)对降低血糖水平的作用。
[0051]图26显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后和ip施用Diapin之后Diapin对血糖水平的作用。
[0052]图27显示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后修饰的二肽对血糖水平的作用。
[0053]发明详述
[0054]在一方面中，本发明提供待向前驱糖尿病或糖尿病患者施用的肽。本发明的肽的例子为GGL (本文称为“Diapin”)、GLG、LGL、LLG、LGG和GLL。本发明的肽的其他例子为GL和LG。本发明还提供肽GGL、GLG、LGL、LLG、LGG和GLL，其中每种亮氨酸独立地为L-异构体或者D-异构体的形式。本发明的肽的其他例子为LG和GL，其中亮氨酸为D-异构体形式。通过本领域已知的方法化学合成或通过蛋白消化衍生得到本发明的肽。
[0055]如本文所使用，除非文本中另有明确指出，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数参照物。
[0056]本领域已知，在没有不利地影响肽或蛋白的活性下，可以替代肽或蛋白中氨基酸为化学上类似的氨基酸。因此，据具体推算，在本发明的肽中甘氨酸或亮氨酸残基可被化学上类似的氨基酸残基取代，例如不同的脂肪族氨基酸残基或者氨基酸异构体。其他脂肪族氨基酸为丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。也据具体推算，在没有不利地影响肽的活性下，可将化学上类似的氨基酸加入本发明的肽的一个或多个末端。
[0057]除了甘氨酸之外，相同的氨基酸全部包含至少一个手性碳原子。因此，这些氨基酸作为成对的立体异构体存在，分别称为L-异构体和D-异构体。大部分天然存在的蛋白质和肽全部由L-异构体形式组成。D-异构体氨基酸可影响肽或蛋白的构象以及可导致增加稳定性或改变活性。
[0058]在肽的一些实施方案中，亮氨酸被D-亮氨酸替代。例如在一些实施方案中，肽是甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸(GGL)、或者是甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸(GGdL)、或者是甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GLG)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(GdLG)、或者是亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)、或者是D-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(dLLG)、或者是亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(LdLG)、或者是D -亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(dLdLG)、或者是亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)、或者是D-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(dLLG)、或者是亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(LdLG)、或者是D-亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(dLdLG)、或者是亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸(LGG)、或者是D-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸(dLGG)、或者是甘氨酸-亮氨酸_亮氨酸(GLL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-亮氨酸(GdLL)、或者是甘氨酸-亮氨酸-D-亮氨酸(GLdL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-D-亮氨酸(GdLdL)、或者是亮氨酸-甘氨酸(LG)、或者是D-亮氨酸-甘氨酸(dLG)、或者是甘氨酸-亮氨酸(GL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸(GdL)。本发明的肽可单独使用或者用作两种或多种肽的混合物。就混合物而言，肽的每个可能亚组合均被本发明具体涵盖。
[0059]在一些实施方案中，本发明的肽经化学修饰。在一些实施方案中，将本发明的肽在N-末端处乙酰化。在一些实施方案中,将本发明的肽在C-末端处酰胺化。在一些实施方案中，将本发明的肽在N-末端处乙酰化和在C-末端处酰胺化。通过本领域已知的方法将肽乙酰化和酰胺化。在本公开的一些实施方案中，将肽糖基化、羧化、磷酸化、酯化、或转化为酸式加成盐和/或任选二聚化、多聚化、聚乙二醇化或另外缀合。
[0060]在一些实施方案中，肽包含替代肽键的一个或多个非肽键。例如，肽包含替代肽键的酯键、醚键、硫醚键或者酰胺键。
[0061]在另一方面中，提供本发明的肽的至少一种组合物。本发明的组合物的例子是包含肽GGL、GLG、LGL, LLG, LGG和GLL、或其药学上可接受的盐的一种或多种的组合物。本发明的组合物的其他例子是包含肽GL和LG、或其药学上可接受的盐的一种或多种的组合物。本发明的组合物的其他例子是包含GGL、GLG、GLL、LLG、LGG、LGL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL, dLGdL、或其药学上可接受的盐的组合物。本发明的组合物可包括其他组分，其包括其他氨基酸。就组合物而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
[0062]如本文所使用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内适于接触人和低级动物组织而不会造成不适当毒性、刺激、过敏反应等、并且具有合理的益处/危险比率的那些盐。“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何非毒性盐或者酯的盐，一旦向接受者施用即能够提供直接或间接本发明的化合物。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，Berge等人在Pharmaceutical Sciences, 66:1-19 (1977)中详细描述的药学上可接受的盐。
[0063]据预估，本发明的肽、或其混合物可用作组合物中唯一活性产物成分。因此，在本发明的一方面中，提供一种或多种本发明的肽的组合物，其中本发明的一种或多种肽是唯一活性成分。因此，本公开的实施方案是基本上由至少一种肽、或其药学上可接受的盐组成的组合物，该至少一种肽由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成。另一实施方案是基本上由至少一种肽、或其药学上可接受的盐组成的组合物，该至少一种肽由氨基酸序列GL或LG组成。又一实施方案是基本上由至少一种肽、或其药学上可接受的盐组成的组合物，该至少一种肽由氨基酸序列 GGL、GLG、GLL、LLG、LGG、LGL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL, dLGdL组成。就组合物而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
[0064]在又进一步的方面中，本发明提供包含本发明的至少一种肽和药学上可接受的赋形剂的组合物。
[0065]在一些实施方案中，药物`组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG,GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 组成的至少一种肽、或者
肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含由氨基酸序列GGL组成的肽、或者肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂。就药物组合物而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
[0066]取决于施用的特定方式和剂型，使用例如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等的药学上可接受的赋形剂来配制本发明的药物组合物。取决于配制和施用途径，通常配制组合物以得到生理上相容的pH、以及范围为约3的pH至约11的pH、约pH 3至约pH 7。在可选择的实施方案中，将pH调整至约pH 5.0至约pH 8的范围。在各方面中，组合物包含如本文所述的治疗有效量的至少一种肽、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。组合物可包括用于治疗或预防细菌生长的次要活性成分(例如但不限于，抗菌或抗微生物试剂)。
[0067]合适的赋形剂包括例如载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、和无活性病毒粒子。其他示例性赋形剂包括抗氧化剂(例如但不限于，抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟基烷基纤维素、和羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油类、水、盐水、甘油和乙醇)润湿或乳化剂、PH缓冲物质等。
[0068]适合递送本发明的肽的药物组合物以及制备它们的方法对于本领域技术人员显而易见。这些组合物和制备它们的方法可在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,The Science and Practice of Pharmacy,第二十版，Lippincott Williams & White,Baltimore, Md.(2000)中找到。可将本发明的肽配制为立即和/或缓慢释放。
[0069]在又一方面中，本发明提供用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐，其中病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。本发明也提供用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或dLGdL组成的至少一种肽、或者肽的药学上可接受的盐，其中该病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。就方法而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
[0070]在一些实施方案中，本发明提供用于治疗前驱糖尿病或糖尿病患者的方法，其包括向患者施用包含肽GGL、GLG、LGL、LLG和GLL的至少一种的组合物。在一些实施方案中，本发明也提供用于治疗前驱糖尿病或糖尿病患者的方法，其包括向患者施用包含肽GL或LG的至少一种的组合物。在一些实施方案中,糖尿病是I型糖尿病。在一些实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。待施用的组合物的量是治疗有效的，从而达到以下至少之一:降低血糖水平；刺激胰岛素分泌；刺激GLP-1分泌；降低胰岛素抵抗；以及改善糖血控制。
[0071]术语“治疗(treating) ” (或者此词的其他形式，例如“疗法(treatment) ”或“治疗(treat)”)本文中用于表示施用本发明的组合物减轻患者的症状和/或减少、抑制、或消除与病状相关的特定症状或事件。因此，术语“疗法(treantment)”包括防止病状在患者中发生，特别是当患者容易患上病状 时；减少或抑制病状；和/或改善或逆转病状。在这种情况下，本发明的方法涉及预防病状，理解，术语“预防”并不要求病状被完全阻止。而且，如本文所使用，术语预防是指熟练技术人员识别易感病状的人群，使得在病状发作之前可进行本发明的组合物的施用的能力。此术语并不意味着病状必须完全消除。
[0072]如本文所使用的“有效量”是指本发明的肽足够表现出可检测治疗效果的量。通过例如临床症状的改善、或者预防、减轻或改善并发症来测定效果。患者的精确有效量取决于患者的体重、尺寸、和健康；病状的性质和程度；以及施用选择的治疗剂或者治疗剂的组合。通过在医生的技术和判断内的常规实验来测定给定情况的治疗有效量。
[0073]在一些实施方案中，本发明提供治疗肥胖、高血压或代谢综合征的方法。相应地，本发明的一个实施方案是治疗肥胖的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包括由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL组成的至少一种肽、或其药学上可接受的盐。另一实施方案是治疗高血压的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包括由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL组成的至少一种肽、或其药学上可接受的盐。另一实施方案是治疗代谢综合征的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL组成的至少一种肽、或其药学上可接受的盐。在任一上述实施方案中，在肽中一个或多个亮氨酸被亮氨酸的D-异构体独立地取代。就方法而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
[0074]在又一方面中，本发明提供在前驱糖尿病或糖尿病患者中治疗、减少和/或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用组合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽。本发明也提供在前驱糖尿病或糖尿病患者中预防、减少和/或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用组合物，其包含由氨基酸序列GL或LG组成的至少一种肽。它也提供在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐。它也提供在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，该组合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG,dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐。就方法而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。在一些实施方案中，糖尿病是I型糖尿病。在一些实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。施用预防、减少或改善至少一种与糖尿病相关的并发症的治疗有效量的组合物，这些并发症包括但不限于以下:心血管疾病[例如，冠状动脉病(有时称为缺血性心脏病)、脑血管疾病(例如中风或者短暂性缺血发作)、心力衰竭、粥样硬化、或者动脉末梢疾病];慢性肾脏病；肾衰竭；膀胱问题；勃起机能障碍；胃轻瘫；眼部疾病(例如糖尿病性视网膜病、白内障或青光眼)；糖尿病性神经病(外周、自主、近侧或病灶)；足或皮肤溃疡；或下肢截肢。
[0075]可通过任何合适的途径来施用本发明的化合物。例如，能够通过口服、眼睛、皮内、腹膜内(“ip”)、鼻内、皮下、肌肉内或静脉内途径来施用本发明的组合物。
[0076]适合于口服施用的配制物包括例如固体、半固体和液体体系，例如，片剂；含有多种或纳米粒子、液体或粉末的软和硬胶囊；锭剂(包括填充液体型)；咀嚼剂；凝胶；快速消化剂型；膜；胚珠；喷雾剂。在一些实施方案中，施用本领域已知的递送媒介物来配制口服施用的本发明的肽，其包括但 不限于微球体、脂质体、肠包衣干燥乳剂或者纳米粒子。
[0077]口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性肽之外，液体剂型可含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯酸苄酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别地，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、和芳香剂。
[0078]口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂、和颗粒剂。在这些固体剂型中，使活性肽与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体，例如柠檬酸钠或者磷酸二钙和/或以下混合:a)填料或填充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯胶；c)湿润剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；e)溶液阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸十二烷基酯钠、及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包括缓冲剂。活性化合物与如上所示一种或多种赋形剂也可在微胶囊剂型中。使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的这些赋形剂也可将类似类型的固体组合物采用为在软和硬填充明胶胶囊中的填料。使用药物配制领域众所周知的诸如肠溶衣和其他涂料的涂料和壳料可制备片剂、包衣片剂(dragees)、胶囊剂、丸剂、和颗粒剂的固体剂型。使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，根据已知技术可配制可注射制剂，例如，无菌可注射水性或油质混悬剂。无菌可注射制剂也可为在无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂中无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂，例如在1，3_ 丁二醇中的溶液。可利用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等张氯化钠溶液。此外，无菌、固定油是通常可采用的溶剂或悬浮介质。用于该目的，可采用任何温和固定油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸用于制备注射剂。例如，通过过滤透过细菌阻隔过滤器、或者通过在使用之前能够溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物中并入杀菌剂能够消毒可注射配制物。
[0079]具体涵盖使用本发明的组合物联合本领域已知的其他糖尿病药物来治疗前驱糖尿病或者糖尿病患者。在一些实施方案中，使用本发明的组合物治疗使得可降低一种或多种其他糖尿病药物的剂量，因而减少与一种或多种其他药物相关的副作用。在一些实施方案中，其他糖尿病药物是胰岛素。在一些实施方案中，其他糖尿病药物是双胍(例如二甲双胍)。在一些实施方案中，其他糖尿病药物是噻唑烷二酮(例如吡格列酮)。在一些实施方案中，其他糖尿病药物是DPP-4抑制剂(例如西他列汀)。换而言之，能够联合诸如用于待治疗病状的监护标准所使用的那些其他药物来使用本发明的组合物。在一些实施方案中，药物是他汀(statin)(包括但不限于阿伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀罗苏伐他汀、氟伐他汀、和匹伐他汀)。在一些实施方案中，药物是降低血压药物[包括但不限于，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂 ，例如卡托普利、赖诺普利、和雷米普利；血管紧张肽II受体阻断剂，例如氯沙坦、奥美沙坦和缬沙坦；β阻断剂，例如美托洛尔、纳多洛尔和喷布洛尔；以及钙通道阻断剂，例如氨氯地平、地尔硫卓和硝苯地平]。
[0080]在又另一方面中，本发明提供用于向需要其的患者施用本发明的组合物的试剂盒，其中试剂盒包括本发明的组合物、使用组合物的说明书以及用于向患者施用组合物的装置。在一些实施方案中，使用试剂盒施用药物组合物，该药物组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、LGG、GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL组成的至少一种肽、或肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂，其中试剂盒包括组合物、施用组合物的说明书以及用于向患者施用组合物的装置。在一些实施方案中，试剂盒包括药物组合物，该药物组合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽。就试剂盒而言，肽的每个可能亚组合被本发明具体涵盖。
实施例
[0081]通过参照详细描述本发明的示例性实施方案的以下实施例来更加完整理解本发明。
[0082]实施例1
[0083]测定氨基酸甘氨酸和亮氨酸对血糖的作用。
[0084]在口服负荷甘氨酸和葡萄糖之后甘氨酸对血二糖的作用[0085]在由Jackson Lab (Bar Harbor, Maine)中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖(2mg/g体重，在图1中菱形线，η = 10)或者甘氨酸(0.35mg/g bw,在图1中方形线，η = 10)和葡萄糖。测定给予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min时血糖。
[0086]与对照组相比，在甘氨酸组中任何时间点下血糖水平均未显著改变。
_7] 在口服负荷亮氨酸和葡萄糖之后亮氨酸对血糖的作用
[0088]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖(2mg/g体重，在图2中菱形线，η = 10)或者亮氨酸(0.35mg/g bw，在图2中方形线，η = 10)和葡萄糖。测定给予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min时血糖。
[0089]实施例2
[0090]当在糖尿病小鼠中口服摄入葡萄糖或淀粉时，Diapin(本发明的肽GGL)强有力地降低血糖水平。而且，在KKay糖尿病小鼠中在未禁食条件下Diapin也降低血糖水平[Yamauchi 等人，Nat.Med.，7 (8):971-946 (2001)]。参见图 3。
[0091]在糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖之后Diapin抑制血糖的增加
[0092]在Diapin组中在30、60、90和120min处血糖水平显著低于对照组中那些。
[0093]在糖尿病小鼠中在口服负荷淀粉之后Diapin抑制血糖的增加
[0094]在由Jackson Lab中购买的成年雄性KKay糖尿病小鼠中进行试验。在对照组中(在图4中菱形线，η = 10), 口服施用2mg/g bw的剂量的淀粉。在Diapin组(在图4中方形线，η = 9),分别口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的剂量下的淀粉和Diapin。在灌胃淀粉和Diapin之后测定在0、30、60、90和120min处血糖。
[0095]在Diapin组中在30、60、90和120min处血糖显著低于对照组中那些。
[0096]Diapin降低在糖尿病小鼠中随机血糖
[0097]在由Jackson Lab中购买的成年雄性KKay糖尿病小鼠中进行试验。在未禁食条件下，在对照组(在图5中菱形线，η = 9)中，口服给予蒸馏水以及在Diapin组(在图5中方形线，η = 9)中，口服给予在lmg/g bw下Diapin。在灌胃Diapin之后测定在0、30、60、90、120、150 和 180min 处血糖。
[0098]在Diapin组中在60、90、120、150和180min处血糖水平显著低于对照组中那些。
[0099]实施例3
[0100]Diapin本身刺激在KKay糖尿病小鼠中胰岛素分泌。而且，Diapin也增加在糖尿病小鼠中GLP-1分泌。
[0101]Diapin刺激在糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖和Diapin之后胰岛素分泌
[0102]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中进行试验。在禁食条件下，在对照组(在图6中白色柱子，η =11)中，口服施用1.5mg/g bw剂量的葡萄糖。在Diapin组(在图6中黑色柱子，η = 11)中，分别口服施用lmg/g bw和1.5mg/g bw的Diapin和葡萄糖。收集口服施用葡萄糖和Diapin之后30min的血样样品。使用FreeStyle葡萄糖计来监控血糖以及通过 ELISA(Alpco，Cat#80-1NSMS-E01)来测定胰岛素。
[0103]Diapin刺激在KKay糖尿病小鼠中胰岛素分泌。
[0104]Diapin刺激在糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖和DiaDin之后GLP-1分泌
[0105]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中进行试验。在禁食条件下，在对照组(在图7中白色柱子，η = 11)中，口服施用1.5mg/g bw的剂量下葡萄糖以及在Diapin组(在图7中黑色柱子，η = 11)中，分别口服施用lmg/g bw和1.5mg/g bw的Diapin和葡萄糖。收集口服施用葡萄糖和Diapin之后30min的血样样品。通过ELISA(Alpco, Cat#43-GP1HU_E01)来测定GLP-1。
[0106]Diapin也增加在糖尿病小鼠中GLP-1分泌。
[0107]实施例4
[0108]由饮食摄入的Diapin以时间和剂量依赖性方式降低在KKay糖尿病小鼠中随机血糖水平。
[0109]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中进行试验。将小鼠分为三组，各组10只动物，并在试验期间禁食、和无限制规律喂食(对照)、喂食、与6g Diapin/kg混合喂食、或者与12gDiapin/kg混合喂食。在开始(O周)、以及4周内此后每周清晨测定血糖水平。结果显示在图8中。
[0110]在使用与Diapin混合喂食的两组中血糖水平均显著低于对照组中那些。
[0111]实施例5
[0112]当血糖水平在正常水平时，Diapin没有降低在非糖尿病C57BL/6J小鼠中血糖水平。
[0113]在C57BL/6J小鼠中Diapin对空腹血糖水平没有作用
[0114]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予小鼠水(在图9中菱形线，η = 6)或者Diapin(2mg/g bw,在图9中方形线，η = 6)。测定在口服施用Diapin 之后在 0、30、60、90、120、150 和 180min 处血糖。
[0115]在各组之间血糖水平没有显著差异。
[0116]实施例6
[0117]Diapin、LGL、LGG降低在非糖尿病C57BL/6J小鼠中在腹膜内负荷葡萄糖之后血糖水平。相比之下，肽GGH不能降低。
[0118]Diapin抑制在ip注射葡萄糖之后血糖的增加
[0119]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。口服给予禁食小鼠水(在图10中菱形线,η = 10)或者Diapin(lmg/gbw,在图10中方形线,η = 10)。在口服施用Diapin之后10分钟ip注射来给予葡萄糖。测定给予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min时血糖。
[0120]在Diapin组中在30、60、90和120min处血糖水平显著低于对照组中那些。
[0121]肽GGH对在ip注射葡萄糖之后血糖没有显著作用
[0122]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠水(在图11中菱形线，η = 10)或者GGH(lmg/g bw,在图11中方形线,η = 10)。在口服施用GGH之后10分钟通过ip注射来给予葡萄糖。测定给予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min时血糖。
[0123]相比对照小鼠，在GGH组中在任意时间点下血糖水平均未显著改变。
[0124]在ip注射葡萄糖之后肽LGG和LGL抑制血糖增加
[0125]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠水(在图12中菱形线,η = 10)或者LGL(lmg/g bw,在图12中方形线,η = 10)、或者LGG(lmg/g bw，在图12中三角线，η = 10)。在口服施用LGG或LGL之后10分钟通过ip注射来给予葡萄糖。测定给予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min时血糖。
[0126]在LGL组中在30、60、90和120min处血糖水平显著低于对照组中那些。肽LGG降低在30和60min处血糖水平。
[0127]实施例7
[0128]在负荷甸甸糖的非糖尿病C57BL/6J小鼠中妝LGL、GLG、LLG、和GLL显者降低血糖水平。
[0129]在口服负荷葡萄糖之后LLG对血 糖的作用
[0130]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。在对照组(在图13中菱形线,η =10)中，口服施用2mg/g bw的剂量的葡萄糖。在Diapin和LLG组(方形线或三角线，η = 9)中，分别口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的剂量下葡萄糖和Diapin或者葡萄糖和LLG。在灌胃葡萄糖和Diapin之后测定在0、30、60、90和120min处血糖。
[0131]LLG显示与Diapin类似的作用。
[0132]在口服负荷葡萄糖之后肽GLG和GLL对血糖的作用
[0133]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。在对照组(在图14中菱形线，η = 10)中，口服施用2mg/gbw的剂量的葡萄糖。在GLG和GLL组(在图14中三角线或圆点线，η = 9)中，分别口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的剂量下的葡萄糖和GLG或GLL。测定在灌胃葡萄糖和GLG或GLL之后在0、30、60、90和120min处血糖。
[0134]肽GLG和GLL分别显示D`iapin的类似作用。
[0135]实施例8
[0136]酰胺化和乙酰化没有使Diapin降低葡萄糖作用下降。通过在Bergstrom等人，J.Biol.Chem.，280:23114-23121 (2005)中描述的方法酰胺化Diapin和/或通过在John等人，Eur.J.Med.Res.，13:73-78 (2008)中描述的方法来乙酰化。
[0137]酰胺化对Diapin的作用
[0138]在由Jackson Lab购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。在对照组(在图15中菱形线，η = 10)中，口服施用2mg/g bw的剂量的葡萄糖。在Diapin组(在图15中三角线，η = 9)中，分别口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的剂量下葡萄糖和Diapin。在酰胺化Diapin组(在图15中方形线，η = 9)中，分别口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的剂量下葡萄糖和酰胺化Diapin。在灌胃葡萄糖、Diapin和酰胺化Diapin之后测定在O、
0.5、1、1.5和2小时下血糖。
[0139]在Diapin组和酰胺化Diapin组中在0、0.5、1、1.5和2小时下血糖水平显著低于
对照中那些。
[0140]Diapin乙酿化的作用
[0141]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。在Diapin组(在图16中菱形线,η = 10)中，分别口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的剂量下葡萄糖和Diapin。在乙酰化Diapin组(在图16中方形线,η = 10)中，分别口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的剂量下葡萄糖和乙酰化Diapin。在灌胃葡萄糖、Diapin、和乙酰化Diapin之后测定在0、0.5、1、1.5和2小时处血糖。
[0142]在Diapin组中在0、0.5、1、1.5和2小时处血糖水平显著不同于在乙酰化Diapin组中那些。
[0143]双重修饰对Diapin的作用
[0144]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。在Diapin组(在图17中三角线，η = 9)中，分别口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的剂量下葡萄糖和Diapin。在酰胺化/乙酰化Diapin组(方形线，η = 9)中，分别口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的剂量下葡萄糖和酰胺化/乙酰化Diapin。在灌胃葡萄糖、Diapin和酰胺化/乙酰化Diapin之后测定在0、0.5、1、1.5和2小时处血糖。
[0145]在Diapin组中在0、0.5、1、1.5和2小时处血糖水平显著不同于在酰胺化/乙酰化Diapin组中那些。
[0146]实施例9
[0147]当在葡萄糖施用之前口服施用时，Diapin降低血糖水平。
[0148]在口服施用葡萄糖之前30min给予Diapin的作用
[0149]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠水(在图18中菱形线，η = 10)或者Diapin(lmg/g bw,在图18中方形线，η = 10),然后在30min之后口服灌胃葡萄糖2g/kgbw。在给予葡萄糖之后测定在0、30、60和120min处血糖。
[0150]在Diapin组中在30、60和120min处血糖水平显著低于对照组中那些。
[0151]在口服施用葡萄糖之前I小时下给予的Diapin的作用
[0152]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠水(在图19中菱形线,η = 10)或者Diapin(lmg/g bw,在图19中方形线,η = 10),然后在I小时之后灌胃葡萄糖2g/kg bw。在给予葡萄糖之后测定在0、30、60和120min处血糖。
[0153]在Diapin组中在30、60min处血糖水平显著低于对照组中那些。
[0154]实施例10
[0155]在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后二肽GG没有显著降低血糖水平。
[0156]Diapin和二肽GG和GL对口服施用葡萄糖之后血 糖水平的作用
[0157]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠葡萄糖200mg/kg bw(在图20中菱形线,η = 10)或者葡萄糖200mg/kg bw加上Diapin (在图20 中方形线，lmg/g bw,n = 10)、GG(在图 20 中圆点线,0.67mg/g bw,n = 10)或者 GL (在图20中三角线,0.67mg/g bw, η = 10)。在给予葡萄糖之后测定在30、60、90和120min处血糖。Diapin用作试验的阳性对照。
[0158]Diapin显著降低在30、60、90和120min处血糖水平。肽GL降低在30min处血糖水平，而与Diapin相比,肽GG不会显著降低血糖水平。
[0159]Diapin和二肽LG对口服施用葡萄糖之后血.糖水平的作用
[0160]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。给予禁食小鼠葡萄糖200mg/kg bw(在图21中三角线，η = 10)、葡萄糖200mg/kg bw加上Diapin (在图21中方形线，lmg/g bw,n = 10)、或者LG(在图21中三角线,0.67mg/g bw,n = 10)。在给予葡萄糖之后测定在30、60、90和120min处血糖。Diapin用作试验的阳性对照。
[0161]在降低血糖水平上二肽LG显示比Diapin更短暂的作用。在所有测定时间点下Diapin降低血糖水平,而二肽LG仅在30和60min处降低血糖水平。[0162]实施例η
[0163]Diapin 降低在 ob/ob 小鼠[Liu 等人，Diabetes，52 (6):1409-16(2003)]中口服施
用葡萄糖之后的血糖水平。
[0164]在由Jackson Lab中购买的成年雄性B6.V-Lepob/J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖2mg/g(n = 10)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在给予葡萄糖和Diapin之后测定在30、60、90和120min处血糖水平。
[0165]如在图22中所示，Diapin抑制在ob/ob小鼠中口服负荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0166]实施例12
[0167]Diapin 也降低在 db/db 小鼠中[Chen 等人，Cell, (3):491-495 (1996) and Hummel等人，Science，153 (740):1127-1128(1966)] 口服施用葡萄糖之后血糖水平。
[0168]在由Jackson Lab中购买的成年雄性BKS.Cg_m+/+Leprdb/J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n = 10)或葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,η = 10) ο测定在给予 葡萄糖和Diapin之后30、60、90和120min处血糖水平。
[0169]如在图23中所示，Diapin抑制在db/db小鼠中口服负荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0170]实施例13
[0171]Diapin降低在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠中[Tomas等人，Diabetes Obes.Metab.，13(1):26-33(2011)和 Dezaki 等人，Diabetes，55 (12):3486-93(2006)] 口服施用葡萄糖之后的血糖水平。
[0172]喂食由Jackson Lab中购买的野生型雄性C57BL/6J小鼠高脂肪饮食[具有来自脂肪的60%卡路里的啮齿类食物(Research Diets Inc.Cat#:D12492)]八周以诱导胰岛素抵抗小鼠模型的肥胖。然后，通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n= 10)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在给予葡萄糖和Diapin之后测定在30、60、90和120min处血糖水平。
[0173]如在图24中所显示，Diapin抑制在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠中口服负荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0174]实施例14
[0175]在C57BL/6J小鼠中甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸(D-Diapin)对口服施用葡萄糖之后降低血糖水平具有延长作用。
[0176]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖 2mg/g bw (η = 10)或葡萄糖 2mg/g bw 加上 D-Diapin (lmg/g bw,n = 10)或Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在给予葡萄糖之后测定在30、60、90、120、和180min处血糖水平。
[0177]如在图25中所显示，在C57BL/6J小鼠中口服负荷葡萄糖之后降低血糖水平D-Diapin比Diapin更加有效。
[0178]实施例15
[0179]Diapin降低在C57BL6J小鼠中口服施用葡萄糖和ip Diapin施用之后血糖水平。
[0180]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖 2mg/g bw(n = 14)或者葡萄糖 2mg/g bw 加上 Diapin (lmg/g bw, ip, η = 14)或者Diapin (lmg/g bw,n = 14)。在给予葡萄糖和Diapin之后测定在30、60、90和120min处血糖。结果显示在图26中。
[0181]实施例16
[0182]修饰的二肽对在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后血糖水平具有不同的作用。测定的修饰的二肽是酰胺化GL 二肽和二肽LG的D-异构体。
[0183]在由Jackson Lab中购买的成年雄性C57BL/6J小鼠中进行试验。通过灌胃给予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n = 12)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw, ip, η =12)、或者二肽(0.67mg/g bw，n = 12)。在给予葡萄糖和肽之后测定在30、60、90和120min处血糖。结果显示在图27中。
[0184]尽管依据具体实施方案已经描述本发明，但理解，可由本领域技术人员更改和修改。因此，应当仅将权利要求中出现的那些限制放置在本发明中。
[0185]在本申请中所引用 的所有文件均通过引用方式以描述它们的公开全部并入本文中。
【权利要求】
1.一种用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，所述组合物包含由氣基Ife序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种妝、或者所述妝的药学上可接受的盐， 其中所述病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。
2.一种用于治疗病状的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，所述组合物包含由氨基酸序列 GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或 dLGdL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐， 其中所述病状是前驱糖尿病、糖尿病、肥胖、高血压、代谢综合征、糖血控制差、或降低的胰岛素分泌。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病状是前驱糖尿病。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病状是糖尿病。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病状是肥胖。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病状是高血压。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病状是代谢综合征。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GGL组成的肽。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GLG组成的肽。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列LGL组成的肽。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列LLG组成的肽。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列LGG组成的肽。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GLL组成的肽。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GGdL组成的肽。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GdLG组成的肽。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GdLL组成的肽。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GLdL组成的肽。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列GdLdL组成的肽。
19.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列dLLG组成的肽。
20.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列LdLG组成的肽。
21.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列dLdLG组成的肽。
22.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列dLGG组成的肽。
23.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列dLGL组成的肽。
24.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列LGdL组成的肽。
25.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物至少包含由所述氨基酸序列dLGdL组成的肽。
26.一种在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，所述组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐。
27.一种在糖尿病患者中预防、减少、或改善与糖尿病相关的并发症的方法，其包括向患者施用有效量的组合物，所述组合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL,dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐。
28.根据权利要 求26或权利要求27所述的方法，其中所述与糖尿病相关的并发症是心血管疾病、慢性肾脏病、肾衰竭、膀胱问题、勃起机能障碍、胃轻瘫、眼部疾病、糖尿病性神经病、足或皮肤溃疡、或者下肢截肢。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中将所述肽在N-末端处乙酰化。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中将所述肽在C-末端处酰胺化。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中将所述肽在N-末端处乙酰化和在C-末端处酰胺化。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中通过口服、腹膜内、眼睛、皮内、鼻内、皮下、肌肉内或静脉内途径来施用所述组合物。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中通过口服途径来施用所述组合物。
34.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中通过腹膜内途径来施用所述组合物。
35.一种药物组合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含由所述氨基酸序列GGL组成的肽。
38.一种药物组合物，其基本上由至少一种肽、和一种或多种药学上可接受的赋形剂组成，所述至少一种肽由氨基酸序列 GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、LGG、GGdL, GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 组成。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述肽是由所述氨基酸序列GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、或 LGG 组成的肽。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的药物组合物，其中将所述肽在N-末端处乙酰化。
41.根据权利要求35-39中任一项所述的药物组合物，其中将所述肽在C-末端处酰胺化。
42.根据权利要求35-39中任一项所述的药物组合物，其中将所述肽在N-末端处乙酰化或者在C-末端处酰胺化。
43.一种用于施用药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG、GdLL、LLG、LGL、LGG、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或dLGdL组成的至少一种肽、或者所述肽的药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂， 其中所述试剂盒包括所述组合物、施用所述组合物的说明书以及用于向患者施用所述组合物的装置。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述药物组合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL组成的至少一种肽。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的试剂盒，其中将所述肽在N-末端处乙酰化。
46.根据权利要求43 或权利要求44所述的试剂盒，其中将所述肽在C-末端处酰胺化。
47.根据权利要求43或权利要求44所述的试剂盒，其中将所述肽在N-末端处乙酰化和在C-末端处酰胺化。
【文档编号】A61P3/10GK103458911SQ201280008561
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月10日 优先权日:2011年2月11日
【发明者】Y·E·陈, C·薛, J·张 申请人:密歇根大学董事会