抗体-药物缀合物的制作方法
【专利摘要】本发明揭示一种抗5T4抗体-药物缀合物及制备和使用方法。
【专利说明】抗体-药物缀合物
【技术领域】
[0001]本发明整体上涉及用于治疗癌的抗5T4抗体-药物缀合物。
【背景技术】
[0002]抗体-药物缀合物(ADC)兼具单克隆抗体的结合特异性及化学治疗剂的效力。与发展抗肿瘤相关性标靶分子的单克隆抗体有关的技术、更有效的细胞毒性剂的用途及共价结合这些成份的化学接头的设计，在近年来已快速进展(Ducry L., et al.BioconjugateChemistry, 21:5-13, 2010)。
[0003]极具潜力的ADC 诸如 SGN-75 (US2009/148942)和曲妥珠单抗(trastuzumab) -DMl (US2009/0226465)目前正进行临床试验。然而，因考虑以其它肿瘤相关性抗原作为标靶，仍存在许多挑战。各种单克隆抗体必须被分别特征化并设计适当的接头，并且识别在递送至肿瘤细胞时仍保留其效力的适当细胞毒性剂。必须考虑癌标靶上的抗原密度，及正常组织是否表达该标靶抗原。其它考虑包括当与标靶结合时该整个ADC是否被内化、考虑可能的正常组织暴露及/或欲治疗的癌类型及分期时以选用细胞静止剂或细胞毒性剂为较佳、及连接该抗体与该载荷药物的接头是可被切割或不可切割的连接。另外，该抗体对药物基团的缀合比必须足够，且不损害该抗体的结合活性及/或该药物的效力。很明显地，ADC是复杂的生物制剂，且发展有效ADC的挑战仍然很高。
[0004]人5T4肿瘤相关性抗原是本发明的标靶抗原。最近已有数据显示，该5T4抗原以高量表达于某些高成瘤性细胞上，这些高成瘤性细胞亦称为引发肿瘤细胞(W02010/111659)。引发肿瘤细胞显示对标准疗法的抗药性，其被认为是造成肿瘤复发及转移的原因，因此代表另一种ADC发展的障碍。
[0005]本发明的新颖的抗5T4A DC克服该些与ADC技术相关的挑战，提供能与表达5T4抗原的肿瘤细胞结合且递送足够细胞毒性药物至该等细胞的高特异性及强效的ADC，因此提供创新且有效的癌治疗。
【发明内容】
[0006]在一实施方式中，本发明的抗体-药物缀合物具有下式:Ab-(LU-D)p或其药学上可接受的盐，其中Ab是抗5T4抗体或其抗原结合部分，该抗5T4抗体或其抗原结合部分包含具有如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl区、如SEQ ID NO:6所示的VH CDR2区及如SEQ ID NO:7所示的VH⑶R3区的重链可变区，LU是选自顺丁烯二酰亚氨基己酰基(maleimidocaproyl)和顺丁烯二酰亚氨基己酰基-纟颜氨酸(Val)-瓜氨酸(Cit)-PABA的接头单元，P是约I至约8的整数，且D是选自MMAE、MMAF和MMAD的药物单元。
[0007]本发明另提供抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗5T4抗体或其抗原结合部分包含具有(a)如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl区、(b)如SEQ ID NO:6所示的VH CDR2区、及
(c)如SEQ ID NO:7所示的VH CDR3区的重链可变区。
[0008]本发明另提供抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗5T4抗体或其抗原结合部分包含具有(a)如SEQ ID NO:8所示的VL CDRl区、(b)如SEQ ID NO:9所示的VL CDR2区、及
(c)如SEQ ID NO:10所示的VL CDR3区的轻链可变区。
[0009]本发明另提供抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗5T4抗体或其抗原结合部分另包含重链可变区及轻链可变区，该重链可变区具有(a)如SEQ ID NO:5所示的VH⑶Rl区、
(b)如SEQID NO:6所示的VH CDR2区、及(c)如SEQ ID NO:7所示的VH CDR3区，且该轻链可变区具有(a)如SEQ ID NO:8所示的VL CDRl区、(b)如SEQ ID NO:9所示的VL CDR2区、及(c)如SEQ ID NO:10所示的VL CDR3区。
[0010]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗5T4抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:3的VH区及SEQ ID NO:4的VL区。
[0011]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗5T4抗体是由具有SEQ IDNO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成。
[0012]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中:(a)该抗5T4抗体是由具有SEQID NO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成、(b)该LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基、
(c)该药物是MMAF、及(d)p是大约4的整数。
[0013]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中:(a)该抗5T4抗体是由具有SEQ ID NO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成、(b)该LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit-PABA、(c)该药物是MMAE、及(d)p是大约4的整数。
[0014]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中:(a)该抗5T4抗体是由具有SEQ ID NO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成、(b)该LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit-PABA、(c)该药物是`MMAD、及(d)p是约I至约8的整数。
[0015]本发明另提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中:(a)该抗5T4抗体是由具有SEQ ID NO: 15的重链及具有SEQ ID NO: 2的轻链组成、(b)该LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit-PABA、(c)该药物是MMAE、及(d)p是约I至约8的整数。
[0016]本发明提供一种抗5T4抗体-药物缀合物，其中该抗体识别人5T4抗原上的表位，其中该表位包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的氨基酸残基173至258及282至361。
[0017]本发明提供一种药物组合物，其包含上述的抗体-药物缀合物及药学上可接受的载体。
[0018]本发明另提供一种治疗有需要治疗的患者的5T4阳性癌的方法，该方法包含对该患者施用上述的抗体-药物缀合物。
[0019]本发明另提供一种治疗5T4阳性癌的方法，其中该癌选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮肤癌、胃癌和
睪丸癌。
[0020]更佳地，本发明提供一种治疗5T4阳性癌的方法，其中该癌选自结直肠癌、乳腺癌、胰癌和非小细胞肺癌。
[0021]本发明另提供一种用于治疗的上述的抗体-药物缀合物。
[0022]本发明另提供一种上述的抗体-药物缀合物于制造药物的用途。
[0023]本发明另提供上述的用途，其中该用途是治疗5T4阳性癌，且其中该癌选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、皮肤癌、胃癌和睪丸癌。[0024]更佳地，本发明另提供上述的用途，其中该用途是治疗5T4阳性癌，且其中该癌选自结直肠癌、乳腺癌、胰癌和非小细胞肺癌。
[0025]本发明另提供编码抗5T4抗体的核酸、包含该核酸的载体及包含该载体的宿主细胞。
[0026]本发明另提供一种制备抗5T4抗体的方法，该方法包含培养包含该上述的载体的宿主细胞及自该细胞培养物回收该抗体。
[0027]本发明另提供一种制备抗5T4抗体-药物缀合物的方法，该方法包含:(a)取得自该细胞培养物回收的抗体，(b)使该抗体经由选自顺丁烯二酰亚氨基己酰基或顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit的接头单元与选自MMAE、MMAD和MMAF的药物单元化学连接，及(c)纯化该抗体-药物缀合物。
【具体实施方式】
[0028]本发明提供用于治疗癌的抗5T4抗体-药物缀合物。为了更清楚地了解本发明，首先定义一些术语。[0029]本揭示内容中使用的所有氨基酸缩写是那些于37C.F.R.§ 1.822(B) (I)阐述的美国专利商标局接受的缩写。
[0030]“5T4”是指5T4肿瘤胎儿抗原，其为72kDa的高度糖基化的跨膜糖蛋白，该跨膜糖蛋白包含42kDa的非糖基化核心(见US5，869，053)。人5T4是表达于多种癌类型，包括膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮肤癌、胃癌及睪丸癌。闻成瘤性细胞(又称为癌干细胞或引发肿瘤细胞)已经显不具有高量的5T4表达(W02010/111659)。本发明的抗5T4抗体包括与该人5T4抗原特异性结合的抗体(见US2007/0231333)。
[0031]“抗体”是免疫球蛋白分子，其可透过位于该免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原辨认区特异性地与目标结合，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此处所使用的“抗体”不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，亦包含其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链、包含抗体的融合蛋白及包含抗原辨认区的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构象，包括例如但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、由VH和CHl结构域组成的Fd片段、由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、经分离的互补决定区(OTR)、scFv、单结构域抗体(例如S鱼抗体(shark antibodies)及胳骑抗体(camelid antibodies))、大型抗体(maxibodies)、迷你抗体(minibodies)、细胞内抗体(intrabodies)、双价抗体、三价抗体、四价抗体、v-NAR及bis-scFv。
[0032]抗体包括任何类型的抗体,诸如IgG、IgA或IgM (或其亚型)，且该抗体不需要是任何特定类型。根据其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同类型。有五种主要的免疫球蛋白类型:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些类型可进一步分成亚型(同型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、Y和μ。不同类型的免疫球蛋白的次单位结构及三维构象是广为周知。
[0033]抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(不论单独或组合)。如该领域所知，重链及轻链的可变区各由四个架构区(FR)及连接该四个架构区的三个互补决定区(CDR)(亦称为超变异区)组成，以形成该抗体的抗原结合部分。若希望主体可变区的变异体，特别是具有CDR区以外(即架构区)的氨基酸残基取代，适当的氨基酸取代(较佳地保守性氨基酸取代)可通过比较该主体可变区与其它包含和该主体可变区相同的典范类型(canonical class)的⑶Rl及⑶R2序列的抗体的可变区加以识别(Chothiaand Lesk, J Mol Biol 196 (4):901-917, 1987)。当选择 FR 以于旁侧连接主体 CDR 时，例如当人源化或最佳化抗体时，源自包含该相同典范类型的CDRl及CDR2序列的抗体的FR是较佳。
[0034]可变结构域的“CDR”是位于可变区内的氨基酸残基，其是根据卡巴(Kabat)定义、柯西亚(Chothia)定义、卡巴及柯西亚二者的累积定义、AbM定义、接触定义、及/或构形定义、或该领域广为周知的任何CDR测定方法加以识别。抗体CDR可能被识别为原本由卡巴等人所定义的超变异区。见例如Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th ed.，Public Health Service, NIH, Washington, D.C.。该等CDR的位置亦可能被识别为最初由柯西亚等人所描述的结构环状结构。参见例如Chothiaet al.，1989，Nature342:877-883。其它其它识别CDR的方法包括“AbM定义”(其是卡巴法及柯西亚法的综合，源自利用牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗体模式软件(现为AaxiIrys^ ))，或如MacCalIum et al., 1996，J.Mol.Biol.，262:732-745所述以观察到的
抗原接触为基础的CDR的“接触定义”。在此处称为CDR的“构形定义”的另一方法中，CDR的位置可能被鉴别为对抗原结合造成洽贡献的残基。参见例如Makabe et al., 2008, Journalof Biological Chemistry, 283:1156-1166。其它CDR边界定义可能不严格遵守上述方法中的一者，但将与至少部分的卡巴CDR重叠，虽然它们可能根据特定残基或残基群或甚至整个CDR不显着影响抗原结合的预测或实验结果被缩短或延长。此处所使用的CDR可能指由该领域已知的任何方法(包括多种方法的组合)所定义的CDR。此处所使用的方法可利用根据这些方法中任一者所定义的CDR。以包含超过一种CDR的任何给定实施方式而言，该CDR可根据卡巴、柯西亚、延长、AbM、接触及/或构形定义中任一者加以定义。
[0035]术语“单克隆抗体”(Mab`)是指源自单一细胞或细胞株的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，并不是指其制备方法。较佳地，本发明的单克隆抗体存在于均质或实质上均质的族群。
[0036]
人源化抗体是指離入如說)抗体的形式，其为包含源自.#人免疫球蛋『I的敁少序列的嵌合性免疫球蛋η、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2)或抗体的其它抗原结合子序列)。较佳地，人源化抗体是其中源自接受者的互补决定区(CDR)的残基被源自诸如具有该所希望的特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔等非人物种(捐赠者抗体)的CDR的残基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。
[0037]术语“嵌合抗体”是用来指其中该可变区序列是源自一物种且该恒定区序列是源自另一物种的抗体，诸如其中该可变区序列是源自小鼠抗体且该恒定区序列是源自人抗体的抗体。
[0038]本发明的抗体可利用该领域广为周知的技术制备，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或该等技术的组合、或该领域已知的其它技术(见例如Jayasena, S.D.，Clin.Chem.，45:1628-50 (1999)及Fellouse, F.A.，et al, J.Mol.Biol.，373 (4): 924-40 (2007))。
[0039]下表1及2说明用于本发明的抗体的较佳⑶R。
[0040]表1
[0041]
【权利要求】
1.一种下式的抗体-药物缀合物:
Ab-(LU-D) P 或其药学上可接受的盐，其中 (a)Ab是抗5T4抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有下列的重链可变区: ⑴如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl区， (ii)如SEQ ID NO:6 所示的 VH CDR2 区，及
(iii)如SEQ ID NO:7 所示的 VH CDR3 区， (b)LU是选自顺丁烯二酰亚氨基己酰基和顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit的接头单元， (C)P是约I至约8的整数，且 (d) D是选自MMAE、MMAD和MMAF的药物单元。
2.如权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合部分包含具有下列的轻链可变区:
(a)如SEQ ID NO:8 所示的 VL CDRl 区， (b)如SEQ ID NO:9 所示的 VL CDR2 区，及
(c)如SEQ ID NO:10 所示的 VL CDR3 区。
3.如权利要求1或2的抗体-药物缀合物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合部分还包含: 1)重链可变区，所述重链可变区具有:
(a)如SEQ ID NO:5 所示的 VH CDRl 区， (b)如SEQ ID NO:6 所示的 VH CDR2 区，及
(c)如SEQ ID NO:7 所示的 VH CDR3 区， 2)轻链可变区，所述轻链可变区具有:
(a)如SEQ ID NO:8 所示的 VL CDRl 区， (b)如SEQ ID NO:9 所示的 VL CDR2 区，及
(c)如SEQ ID NO:10 所示的 VL CDR3 区。
4.如权利要求1至3中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:3的VH区及SEQ ID NO:4的VL区。
5.如权利要求1至4中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗5T4抗体或其抗原结合部分由具有SEQ ID NO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成。
6.如权利要求1至5中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其抗原结合部分识别人5T4抗原上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的氨基酸残基173 至 258 及 282 至 361。
7.如权利要求1至6中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基。
8.如权利要求1至7中任一项的抗体-药物缀合物,其中所述药物是MMAF。
9.如权利要求1至8中任一项的抗体-药物缀合物,其中P是约I至约4的整数。
10.如权利要求1的抗体-药物缀合物，其中:(a)所述抗5T4抗体由具有SEQID NO:1的重链及具有SEQ ID NO:2的轻链组成， (b)所述LU是顺丁烯二酰亚氨基己酰基， (c)所述药物是MMAF，且
(d)P 是 4。
11.一种药物组合物,其包含如权利要求1至10中任一项的抗体-药物缀合物及药学上可接受的载体。
12.—种治疗需要该治疗的患者中5T4阳性癌的方法，包括对所述患者施用权利要求1至11中任一项的抗体-药物缀合物。
13.如权利要求12的方法，其中所述癌选自结直肠癌、乳腺癌、胰癌和非小细胞肺癌。
14.一种如权利要求1至11中任一项的抗体-药物缀合物，用于治疗。
15.一种如权利要求1至11中任一项的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途。
16.如权利要求14或15的用途，其中所述用途是用于治疗5T4阳性癌。
17.—种核酸,其编码如权利要求1至6中任一项的抗5T4抗体。
18.—种载体，其包含如权利要求17的核酸。
19.一种宿主细胞,其包含如权 利要求18的载体。
20.—种用于制备抗体的方法,其包括培养如权利要求19的宿主细胞及从培养物回收抗体。
21.一种用于制备抗5T4抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括: (a)化学连接选自顺丁烯二酰亚氨基己酰基或顺丁烯二酰亚氨基己酰基-Val-Cit的接头单元与选自MMAE、MMAD或MMAF的药物单元， (b)将所述接头-药物与从权利要求20的细胞培养物回收的抗体缀合，及 (c)纯化所述抗体-药物缀合物。
【文档编号】A61P35/00GK103517719SQ201280015379
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年3月19日 优先权日:2011年4月1日
【发明者】H-P·格贝尔, J·F·迪约瑟夫, K·M·汉多克, K·A·马凯特, P·萨普拉, L·G·奇思蒂亚科娃 申请人:惠氏有限责任公司