针对肾相关抗原1的抗体及其抗原结合片段的制作方法
【专利摘要】本发明披露了新颖的抗体和抗原结合片段，这些抗体和抗原结合片段特异性地结合至KAAG1上并且可以在包含表达KAAG1的细胞的癌症的治疗、检测和诊断中使用。在此还披露了表达这些抗体和抗原结合片段的细胞连同使用这些抗体和片段检测和治疗癌症的方法。可以从这样的治疗或检测受益的癌症适应症包括卵巢癌、肾癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、和前列腺癌、以及黑色素瘤。
【专利说明】针对肾相关抗原1的抗体及其抗原结合片段
发明领域
[0001]本发明涉及特异性地结合至肾相关抗原I (KAAGl)上的特异性抗体或抗原结合片段以及它们用于癌症的治疗、检测和诊断的用途。特别考虑了将治疗剂与这些抗体或抗原结合片段一起递送至细胞。
[0002]发明背景
[0003]在美国，在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌占据女性中的最高肿瘤相关死亡率(杰玛(Jemal)等人，2005)。在美国，它是女性中癌相关死亡的第四大原因(梅农(Menon)等人，
2005)。美国癌症协会估计在2005年总计22，220个新病例并且将16，210例死亡归因于该疾病(博纳姆(Bonome)等人，2005)。对于过去30年，统计数字大体上保持相同-产生卵巢癌的大多数女性将死于这种疾病(钱伯斯(Chambers)和范德尔海登(Vanderhyden),
2006)。该疾病带来1:70的寿命风险以及> 60%的死亡率(钱伯斯(Chambers)和范德尔海登(Vanderhyden)，2006)。高死亡率是由于当恶性肿瘤已经扩散在卵巢以外时卵巢癌的早期检测的困难。实际上，>80%的患者被诊断为患有晚期疾病(III期或IV期)(博纳姆(Bonome)等人，2005)。这些患者有不良的预后，这反映为< 45%的5年存活率，虽然80%至90%将最初对化疗有反应(贝雷克(Berek)等人，2000)。与较早时20%的5年存活率相比，这个增加的成就至少部分地是由于当肿瘤组织局限于卵巢时最佳地减小肿瘤组织的体积的能力，这是针对卵巢癌的重要的预后因素(布里斯托(Bristow R.E.)，2000;布朗(Brown)等人，2004)。在被诊断患有早期疾病(I期)的患者中，5年存活率范围为> 90 (钱伯斯(Chambers)和范德尔海登(Vanderhyden), 2006)。
[0004]卵巢癌包括从卵巢的表面 上皮或从表面包涵体(surface inclusion)衍生的肿瘤的多相群。它们分为浆液性、粘液性、子宫内膜样性、透明细胞、以及布伦纳(过渡)类型，对应于女性生殖道器官中的不同类型的上皮(史(Shih)和库尔曼(Kurman)，2005)。在这些类型中，浆液性肿瘤占诊断的卵巢癌病例的大约60 %。每个组织学亚类进一步分为三组:良性的、中间的(交界性肿瘤或低恶性倾向(LMP))、和恶性的，反映它们的临床行为((塞德曼)Seidman等人，2002)。LMP表示10%至15%的被诊断为浆液性的肿瘤，并且是一个难题，因为它们展现非典型的核结构以及转移行为，然而它们与高级别(high-grade)浆液性肿瘤相比具有相当低的侵袭性。在相同的时期内，与晚期高级别疾病< 45%的存活率不同，对于患有LMP肿瘤的患者的5年存活率是95% (贝雷克(Berek)等人，2000)。
[0005]目前，卵巢癌的诊断是部分地通过患者病史的常规分析、以及通过进行体格检查、超声检查和X射线检查、以及血液学筛查而完成的。已经报道用于血清生物标记的早期血液学检测的两种替代策略。一种方法是通过质谱法分析血清样品以便发现未知身份的蛋白质或蛋白质片段，从而检测癌症的存在或不存在(莫尔(Mor)等人，2005 ;科扎克(Kozak)等人，2003)。然而，这个策略是昂贵的并且不是广泛可用的。可替代地，是使用抗体微阵列、ELISA、或其他相似的方法检测在血清中的已知蛋白质/肽的存在或不存在。对于称为CA-125(癌抗原-125)的蛋白质生物标记的血清检测长期以来已被广泛地作为针对卵巢癌的标记而执行。然而，虽然卵巢癌细胞可以产生过量的这些蛋白质分子，仍有一些其他癌症(包括输卵管癌或子宫内膜癌(cancer of the lining of the uterus))、患有胰腺癌的人的60%、以及患有其他恶性肿瘤的人的20% -25%具有升高水平的CA-125。CA-125测试仅仅获得对于大约50%的I期卵巢癌患者的真实阳性结果，而具有获得来自I1、II1、和IV期卵巢癌患者的真实阳性结果的80%的可能性。其他20%的卵巢癌患者未显示CA-125浓度的任何增加。另外，升高的CA-125测试可以指示与癌症不相关的其他良性活动，例如月经、怀孕、或子宫内膜异位。因此，当早期疾病仍然是可治疗的、展现< 10%的阳性预测值(PPV)时，这种测试对于该早期疾病的检测具有非常有限的临床应用。甚至在添加针对CA-125的超声筛查的情况下，PPV仅仅提高至大约20% (科扎克(Kozak)等人，2003)。因此，这个测试不是有效的筛查测试。
[0006] 尽管疾病的病因学知识、侵袭性细胞减灭术、以及现代联合化疗的改进，但在死亡率上仅有很小的变化。不好的结果已经归因于(I)缺乏适当的用于早期疾病检测的与在这个阶段的症状的微弱表现相结合的筛查测试-诊断经常只是在进展到后期之后才作出的，在此时癌症的腹膜播散限制了有效治疗，以及(2)对标准化疗策略的抵抗的频繁产生，限制了患者的5年存活率的改进。用于卵巢癌的初始化疗方案包括卡钼(Paraplatin)和紫杉醇(taxol)的结合。多年的临床试验已经证明这种结合在有效手术之后是最有效的-减小了患有新诊断的卵巢癌的大约80%女性中的肿瘤体积，并且40%至50%将具有完全消退-但研究继续寻求改进患者反应的方法。最近的靶向难以到达的细胞的化疗剂的腹腔输注与静脉内递送结合已经增加了有效性。然而，严重的副作用常常导致不完全的疗程。一些其他的化疗剂包括多柔比星、顺钼、环磷酰胺、博来霉素、依托泊苷、长春碱、盐酸拓扑替康、异环磷酰胺、5-氟尿嘧啶以及美法仑。更为最近地，临床试验已经证明:与全身静脉化疗相比较，顺钼的腹膜内给药赋予了存活优势(卡尼斯特拉(Cannistra)和麦圭尔(McGuire),2007)。对于患有早期疾病接受化疗的女性而言，优异的存活率为开发改进卵巢癌检测的策略的研究工作提供了强的原理。此外，新的卵巢癌相关生物标记的发现将导致用于卵巢癌的未来治疗的、具有最小副作用而更有效的治疗策略的开发。
[0007]尽管这些在对于卵巢癌的理解和治疗方面的最近进展，化疗的使用常常与严重的不良反应相关，这些不良反应限制了它们的使用。因此，对于更具特异性的策略(例如，抗原组织特异性与单克隆抗体的选择性相结合)的需要将允许脱靶相关的副作用的显著减少。随着渐增数目的进行的临床试验，用于卵巢癌治疗的单克隆抗体的使用正开始出现(Oei等人,2008 ;尼哥底母(Nicodemus)和贝雷克(berek), 2005)。这些试验中的大多数已经检验了与放射性同位素(例如钇-90)结合的单克隆抗体、或者靶向已经在其他癌类型中鉴定的肿瘤抗原的抗体的用途。对此的一个实例是贝伐单抗的使用，它靶向血管内皮生长因子(伯格(Burger)，2007)。存在非常少的、当前作为用于单克隆抗体的治疗靶标而被研究的卵巢癌特异性抗原。一些实例包括称为B7-H4的蛋白质(西蒙(Simon)等人，2006)以及更近地叶酸受体-a (埃贝尔(Ebel)等人’2007)的使用，后者近来已经进入II期临床试验。
[0008]肾相关抗原I (KAAGl)是最初从衍生自组织相容性白细胞抗原-B7肾癌细胞系的cDNA文库克隆的，作为呈递至细胞毒性T淋巴细胞的抗原肽(Van den Eynde等人，1999 ；Genbank登录号Q9UBP8，SEQ ID N0.:28 ;29)。发现含有KAAGl的基因座编码转录在相对的DNA链上的两种基因。发现有义链编码一种转录物，该转录物编码称为DCDC2的蛋白质。由这些作者进行的表达研究发现，KAAGl反义转录物是肿瘤特异性的并且在正常组织中展现非常少的表达，而D⑶C2有义转录物被广泛表达(Van den Eynde等人，1999)。在公开的专利申请号PCT / CA2007 / 001134(其全部内容通过引用结合在此)中披露了在癌症中并且特别是在卵巢癌、肾癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌以及黑色素瘤中的KAAGl转录物的表达。Van den Eynde等人还观察到在肾癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、脑肿瘤、甲状腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、以及头颈肿瘤中的RNA表达。近来，通过连锁不平衡研究获得的强的遗传证据发现VMP / DCDC2 / KAAGl基因座与诵读困难相关(舒马赫(Schumacher)等人,2006 ;科普(Cope)等人,2005)。这些报道之一指向作为诵读困难患者中的罪魁祸首(culprit)的DCDC2标记，因为在皮质神经元迁移中这种蛋白质的功能与常常展现异常的神经元迁移和成熟的这些患者的症状一致(舒马赫(Schumacher)等人，
2006)。
[0009]发明概述
[0010]本发明涉及特异性抗-KAAGl抗体和抗原结合片段以及它们用于包含表达KAAGl或KAAGl变体的肿瘤细胞的癌症的治疗、检测和诊断的用途。这样的癌症的示例性实施例包括例如卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结肠直肠癌、肉瘤、白血病、脑癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及头颈癌。
[0011]抗体或抗原结合片段在靶向在肿瘤细胞的表面上表达的KAAGl或KAAGl变体方面可以是特别有效的。
[0012]事实上，与例如在PCT / CA2009 / 001586 (其全部内容通过引用结合在此)中披露的3D3和3G10抗体相比较，本发明的抗体或抗原结合片段显现出具有改进的与表达KAAGl的肿瘤细胞结合的能力。这些抗体和抗原结合片段还被内化并且可以因此在将治疗剂递送至肿瘤细胞中是有用的。我们的结果表明，具有所希望特征(例如，改进的结合和内化)的抗体和抗原结合片段通常结合至KAAGl上的由氨基酸61至84界定的C端区域。然而，虽然3A4和3G10抗体两者都结合至相同的区域上，3A4抗体显现出比3G10抗体更有效地结合至肿瘤细胞的表面上。具体而言，在流式细胞术实验(一种测量抗体与细胞表面的直接结合的方法)中，表达KAAGl抗原的癌细胞需要比3G10大致少10倍的3A4。另外，在使用表面等离子体共振的结合实验中，发现3A4对KAAGl的亲和力是在10皮摩尔以下，而抗体3D3和3G10展现出大于200纳摩尔的亲和力(低20倍的亲和力)。因此，预期3A4在结合能力方面的这些增加转化为改进的治疗活性。
[0013]本发明在其一方面提供了一种分离的或基本上纯化的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段可以能够特异性地结合至一个序列，该序列与位于KAAGl (SEQ ID N0.:29)的氨基酸61至84之间的至少10个(例如10至20个或更多个)连续氨基酸是一致的。
[0014]本发明还提供了能够与在此所述的抗体或抗原结合片段竞争的分离的抗体或抗原结合片段。
[0015]在另一个方面，本发明涉及具有在此所述的氨基酸序列的特异性抗体或抗原结合片段。这样的抗体或抗原结合片段可以处于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体(分离的)的形式，连同具有在此所述的特征的抗原结合片段。与此一道还包括这样的抗体或抗原结合片段:这些抗体或抗原结合片段包括在单克隆、嵌合、人源化或人抗体之间的轻链和/或重链的排列。
[0016]本发明的抗体或抗原结合片段可以因此包含人抗体的人恒定区和/或框架氨基酸。
[0017]术语“抗体”是指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还包括多特异性抗体，例如双特异性抗体。人抗体通常是由各自包含可变区和恒定区的两条轻链和两条重链组成。轻链可变区包含3个⑶R，在此鉴定为侧翼是框架区的⑶RLl或L1XDRL2或L2以及⑶RL3或L3。重链可变区包含3个⑶R，在此鉴定为侧翼是框架区的⑶RHl或H1、⑶RH2或H2以及⑶RH3或H3。已经使用卡巴特(Kabat)和肖蒂亚(Chotia)定义鉴定了本发明的人源化抗体的CDR(例如在SEQ ID N0.:56中列出的CDRH2)。然而，其他人(阿比南旦(Abhinandan)和马丁(Martin), 2008)已经使用了宽松地基于Kabat和Chotia的改良的方法，得到较短的CDR(例如，在SEQ ID N0.:6中列出的⑶RH2)的描述。
[0018]如在此使用的术语“抗原结合片段”是指保留与抗原(例如，KAAGl、KAAGl的分泌形式或其变体)结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。包含在术语抗体的“抗原结合片段”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由'、VH、(^和Chi结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由Vh和Cm结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的'和Vh结构域组成，(v)dAb片段(华德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature) 341:544-546)，由Vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)(例如，Vh CDR3)。此外，虽然Fv片段的两个结构域'和Vh由独立的基因编码，可以使用重组方法通过使它们能够被制造为单一多肽链的合成接头而将它们结合，该单一多肽链中的\和Vh区配对以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv));参见例如伯德(Bird)等人(1988)《自然》(Science) 242:423-426 ;以及赫斯顿(Huston)等人(1988)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)85:5879-5883)。这样的单链抗体还旨在被包含在术语抗体的“抗原结合片段”之内。此外，抗原结合`片段包括结合域免疫球蛋白融合蛋白，这些结合域免疫球蛋白融合蛋白包含⑴与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合域多肽(例如重链可变区、轻链可变区、或经由接头肽而与轻链可变区融合的重链可变区)，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。铰链区可以通过将一个或多个半胱氨酸残基用丝氨酸残基替换而被修饰，从而防止二聚化。这样的结合域免疫球蛋白融合蛋白进一步披露于US2003 / 0118592和US2003 / 0133939中。这些抗体片段是使用对于本领域的技术人员而言已知的常规技术而获得的，并且按照与完整抗体相同的方式对这些片段的效用进行了筛选。
[0019]术语“人源化抗体”包括全人源化抗体(即，框架是100%人源化的)以及部分人源化抗体(例如，至少一个可变结构域含有来自人抗体的一个或多个氨基酸，同时其他氨基酸是非人亲本抗体的氨基酸)。典型地，“人源化抗体”含有非人亲本抗体(例如，小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类，等等)的CDR、以及与天然人抗体或人抗体共有序列的那些一致的框架。在这种情况下，那些“人源化抗体”表征为全人源化。“人源化抗体”还可以含有一种或多种氨基酸置换，这些置换不对应于人抗体或人抗体共有序列的那些。这样的置换包括例如可以保留抗体特征(例如，亲和力、特异性，等等)的回复突变(例如，非人氨基酸的再引入)。这样的置换通常是在框架区。“人源化抗体”任选地还包含:典型地为人抗体的恒定区(Fe)的至少一部分。典型地，“人源化抗体”的恒定区与人抗体的恒定区是一致的。
[0020]术语“天然人抗体”是指由人抗体谱(即，种系序列)编码的(可编码的)抗体。
[0021]术语“嵌合抗体”是指具有非人可变区和人恒定区的抗体。
[0022]术语“杂交抗体”是指这样一种抗体:包含来自某些类型的抗体(例如,人源化的)的它的重链或轻链可变区(它的重链或轻链)之一，而另一个重链或轻链可变区(重链或轻链)是来自另一种类型(例如，鼠，嵌合的)。
[0023]在一些实施例中，人源化抗体的重链和/或轻链框架区可以包含来自非人抗体(旨在被人源化)的从一至三十个氨基酸以及来自天然人抗体或人抗体共有序列的剩余部分。在一些情况下，人源化抗体可以包含从I至6个非人⑶R并且六个⑶R常常是非人的。
[0024]被选择用于非人亲本抗体的人源化的天然人抗体可以包含一个可变区，该可变区具有与非人亲本抗体的(模式化)可变区的三维结构(可重叠的)相似的三维结构。像这样，人源化抗体具有更大的具有与非人亲本抗体的三维结构相似的三维结构的可能性。
[0025]被选择用于人源化目的的天然人抗体的轻链可变区可以具有例如在整体上(在整个轻链可变区上)与非人亲本抗体的轻链可变区至少70^^75^^80%等的一致性。可替代地，被选择用于人源化目的的天然人抗体的轻链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的轻链框架区至少70%、75 %、80 %、85 %等的序列一致性。在一些实施例中，被选择用于人源化目的的天然人抗体在其轻链互补决定区中可以具有与非人亲本抗体的轻链互补决定区相同或基本上相同数目的氨基酸。
[0026]被选择用于人源化目的的天然人抗体的重链可变区可以具有例如在整体上(在整个重链可变区上)与非人亲本抗体的重链可变区至少60%、70%、75%、80%等的一致性。同样，根据本发明，人源化抗体重链的人框架区氨基酸残基可以来自天然人抗体重链框架区，该天然人抗体重链框架区具有与非人亲本抗体的重链框架区至少70^^75^^89%等的一致性。在一些实施例中，被选择用于人源化目的的天然人抗体在其重链互补决定区可以具有与非人亲本抗体的重链互补决定区相同或基本上相同数目的氨基酸。
[0027]被选择用于非人亲本抗体的人源化的天然人抗体可以包含一个可变区，该可变区具有与非人亲本抗体的(模式化)可变区的三维结构(可重叠的)相似的三维结构。像这样，人源化或杂交抗体具有更大的具有与非人亲本抗体的三维结构相似的三维结构的可能性。
[0028]例如，可以被选择用于人源化目的的天然人抗体重链可变区可以具有以下特征:
a)与非人抗体重链的三维结构相似或相同的(可重叠的)三维结构，和/或b)具有与非人抗体的重链框架区至少70% —致的氨基酸序列的框架区。任选地，在重链CDR(例如，所有三个CDR)中的(许多个)氨基酸残基与非人重链CDR氨基酸残基相同或基本上相同。
[0029]可替代地，可以被选择用于人源化目的的天然人抗体轻链可变区可以具有以下特征:a)与非人抗体轻链的三维结构相似或相同的(可重叠的)三维结构，和/或b)具有与非人抗体的轻链框架区至少70% —致的氨基酸序列的框架区。任选地，在轻链CDR(例如，所有三个CDR)中的(许多个)氨基酸残基与非人轻链CDR氨基酸残基相同或基本上相同。
[0030]典型的抗原结合部位包含由轻链免疫球蛋白与重链免疫球蛋白配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并且展现非常相似的结构。这些可变区典型地包含相对同源的框架区(FR)，这些框架区被三个称为互补决定区(CDR)的超变区间隔开。抗原结合片段的整体结合活性常常由CDR的序列决定。FR对于最优的抗原结合而言常常起着CDR的三维上的正确定位和比对的作用。
[0031]本发明的抗体和/或抗原结合片段可以例如源于小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或源于其他来源(例如，通过重组DNA技术)。
[0032]根据下文所给出的非限制性详细说明，本发明的进一步的范围、适用性和优势将变得清楚。然而，应当理解的是，这个详细说明在指示本发明的示例性实施例时仅仅是以举例的方式并参考附图而给出的。
[0033]附图简要说明
[0034]图1显示了来自ELISA的结果，ELISA将当与渐增浓度的重组人KAAGl —起孵育时3A4嵌合抗-KAAGl抗体的结合与对照抗体的结合进行了比较。3A4的结合曲线由较浅颜色的线显示。
[0035]图2显不了一个直方图，该直方图描述了来自ELISA分析的结果从而映射3A4抗-KAAGl抗体的表位特异性。结果显示3A4与包含在氨基酸61-84之间的KAAGl羧基端之内的氨基酸序列相互作用。将3A4与3C4、3D3、和3G10抗-KAAGl抗体的结合进行了比较，已知这些抗体分别与KAAGl的区域1-35、36-60、以及61-84相互作用。
[0036]图3A显示了用3A4抗-KAAGl抗体(颜色较深的线)与用对照IgG (颜色较浅的线)对SK0V-3和T0V-21G卵巢癌细胞进行的流式细胞术的比较结果。
[0037]图3B显示了用3A4抗-KAAGl抗体(颜色较深的线)与用对照IgG (颜色较浅的线)对293E人肾细胞进行的流式细胞术的比较结果。
[0038]图4表示通过流式细胞术用3A4抗-KAAGl抗体对SK0V-3细胞表面上的KAAGl抗原的检测。当细胞在37C被孵育时， 荧光信号随着时间降低，表明当细胞与3A4—起孵育时，KAAGl /抗体复合物在孵育期间被内化。
[0039]图5显示了 3A4抗-KAAGl的内化和它与LAMPl的共定位，LAMPl是一种与内体和溶酶体膜相关的蛋白质。
[0040]图6A和6B是表示暴露至不同的抗-KAAGl抗体的肿瘤细胞的FAC分析的图。
[0041]图7是代表在细胞膜中的KAAGl取向的2种可能的图示的原理图。
[0042]图8是鼠3A4可变结构域的分子模型(带状图)。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。
[0043]图9a是3A4可变结构域的人源化抗体LhlHhl (即，人源化轻链I和人源化重链I)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lhl指定变体I的人源化轻链，而Hhl指定变体I的重链。
[0044]图9b是3A4可变结构域的人源化抗体LhlHh2 (即，人源化轻链I和人源化重链2)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lhl指定变体I的人源化轻链，而Hh2指定变体2的重链。
[0045]图9c是3A4可变结构域的人源化抗体LhlHh3 (即，人源化轻链I和人源化重链3)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lhl指定变体I的人源化轻链，而Hh3指定变体3的重链。
[0046]图9d是3A4可变结构域的人源化抗体LhlHh4 (即，人源化轻链I和人源化重链4)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lhl指定变体I的人源化轻链，而Hh4指定变体4的重链。
[0047]图9e是3A4可变结构域的人源化抗体Lh2Hhl (即，人源化轻链2和人源化重链I)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lh2指定变体2的人源化轻链，而Hhl指定变体I的重链。
[0048]图9f是3A4可变结构域的人源化抗体Lh2Hh2 (即，人源化轻链2和人源化重链2)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用111、112和113标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lh2指定变体2的人源化轻链，而Hh2指定变体2的重链。
[0049]图9g是3A4可变结构域的人源化抗体Lh2Hh3 (即，人源化轻链2和人源化重链3)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lh2指定变体2的人源化轻链，而Hh3指定变体3的重链。
[0050]图9h是3A4可变结构域的人源化抗体Lh2Hh4 (即，人源化轻链2和人源化重链4)的分子模型。⑶R环着黑色，并且在轻链中用L1、L2和L3标记，而在重链中用H1、H2和H3标记。框架区显示为灰色。从鼠框架突变为人框架的残基的侧链描绘为球-和-棍图示。Lh2指定变体2的人源化轻链，而Hh4指定变体4的重链。
[0051]图1Oa是鼠和人源化轻链的3A4可变结构域的氨基酸序列比对。轻链具有两种人源化变体(Lhl和Lh2)。⑶R显示为粗体，并且由⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架区内的回复突变加有下划线。
[0052]图1Ob是鼠和人源化重链的3A4可变结构域的氨基酸序列比对。重链具有四种人源化变体(Hhl至Hh4)。⑶R显示为粗体，并且由⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架区内的回复突变加有下划线。
[0053]图1lA 是使用 ClustalW2 程序(拉金(Larkin M.A.),等人,(2007) ClustalW 和ClustalX 版本 2.《生物信息学》(Bioinformatics) 200723 (21):2947-2948)的鼠 3A4 轻链可变区(SEQ ID N0.:4)与轻链可变区变体(SEQ ID N0.:33)的比对，其中(星号)指示具有单个完全保守的残基的位置，其中“:”(冒号)指示在具有强相似特性的组之间的保守性(强相似特性即在Gonnet PAM250矩阵中的得分> 0.5)，并且其中“。”(句点)指示在具有弱相似特性的组之间的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩阵中的得分=< 0.5)。
[0054]图1lB 是使用 ClustalW2 程序(拉金(Larkin M.A.),等人,(2007) ClustalW 和ClustalX 版本 2.《生物信息学》(Bioinformatics) 200723 (21):2947-2948)的鼠 3A4 重链可变区(SEQ ID N0.:2)与轻链可变区变体(SEQ ID N0.:38)的比对，其中(星号)指示具有单个完全保守的残基的位置，其中“:”(冒号)指示在具有强相似特性的组之间的保守性(强相似特性即在Gonnet PAM250矩阵中的得分> 0.5)，并且其中”(句点)指示在具有弱相似特性的组之间的保守性(弱相似特性即在Gonnet PAM250矩阵中的得分=< 0.5)。
[0055]图12a表示pKCR5-3A4_HC-变体I的质粒图谱。人源化3A4变体的重链以相同方式被克隆到PK-CR5的HindIII位点中。因此，所得质粒与pKCR5-3A4_HC变体I相同，除了重链免疫球蛋白可变结构域的序列之外。
[0056]图12b表示pMPG-CR5-3A4-LC-变体I的质粒图谱。3A4抗体的人源化变体I和2的轻链以相同方式被克隆到pMPG-CR5的BamHI位点中。因此，所得质粒与PMPG-CR5-3A4-LC-变体I相同，除了轻链免疫球蛋白可变结构域的序列之外。
[0057]图13表示在瞬时转染到CHO细胞之后抗体产生的分析。通过蛋白质印迹法来分析用人源化3A4抗体的轻链和重链的不同组合转染的CHOcTA细胞的上清液(转染后13天)。在上清液中产生的抗体的定量是在针对已知标准品(纯化的人类IgG抗体)的稀释物的蛋白质印迹的带扫描之后确定的。Mr分子量标记(kDa)。
[0058]图14是重组KAAGl样品的Superdex G75凝胶过滤的曲线图。将KAAGl注入经过凝胶过滤，并且以0.4ml / min进行分离。最大的峰在15-19部分之间。
[0059]图15是列出了鼠3A4抗体和3A4抗体的人源化变体的速率常数和亲和常数的表格。
[0060]图16A是展示了人源化抗体的缔合速率(Ka)的直方图。
[0061]图16B是展示了人源化抗体的解离速率(Kd)的直方图。
[0062]图16C是展示了人源化抗体的亲和常数(Kd)的直方图。
[0063]图17a展示了在ELISA中结合至KAAGl上的人源化3A4变体。这个图显示了 3A4人源化抗体变体和鼠3A4的对比结合。与Lhl轻链变体组装的人源化重链(Hhl、Hh2、Hh3和Hh4)的浓度依赖性结合曲线。
[0064]图17b展示了在ELISA中结合至KAAGl上的人源化3A4变体。这个图显示了 3A4人源化抗体变体和鼠3A4的对比结合。与Lh2轻链变体组装的人源化重链(Hhl、Hh2、Hh3和Hh4)的浓度依赖性结合曲线。
[0065]图18展示了结合至癌细胞表面上的KAAGl的人源化3A4变体。这个图解显示了人源化和鼠3A4抗体在未透性化的SK0V-3卵巢癌细胞上的对比结合活性。
[0066]发明详细说明
[0067]KAAGl在癌细朐中的表汰和牛物活件
[0068]本发明涉及抗体的用途，这些抗体靶向在不同癌类型(特别是卵巢癌)中发现的肿瘤。为了将抗体导向肿瘤，在癌细胞细胞表面表达的肿瘤特异性抗原的鉴定是必须进行的。有若干可供使用以鉴定肿瘤特异性抗原的技术，并且用于鉴定在卵巢肿瘤中的KAAGl的方法(即称为mRNA的基于转录的消减扩增(STAR)的创新发现平台)描述于公开的专利申请号 PCT / CA2007 / 001134 中，该申请号在 2007 年 12 月 27 日在 WO / 2007 / 147265号之下公开。
[0069]卵巢癌STAR文库的分析产生了许多编码分泌的和细胞表面的蛋白质的基因。这些中的之一，称为AB-0447,含有一个开放阅读框，该开放阅读框编码一种相应于SEQ IDN0.:29的84个氨基酸的多肽，SEQ ID N0.:29由一种885个碱基对的cDNA编码，该cDNA具有在SEQ ID N0.:28中显示的核苷酸序列。公开可用的数据库的研究揭示了 AB-0447核苷酸序列与称为KAAGl的基因的核苷酸序列一致。生物信息学分析预测了将其功能结构域呈递至细胞外室的膜锚定蛋白。KAAGl是最初从肾癌文库作为细胞表面抗原而被克隆的，这是证实它的膜定位的一个结果。另外，我们的研究显示该蛋白质是在其氨基端被加工，这个结果与功能性信号肽在氨基酸30和34上或它们之间的裂解一致。此外，全长cDNA的瞬时表达导致在培养基中裂解的KAAGl的检测。这个最终发现指示这种膜锚定蛋白可以在以高水平表达时从细胞脱落。相比之下，KAAGl的氨基截短突变体的表达导致该蛋白质的细胞内保留。当前没有任何阐明它的功能的公开报道，并且如由本发明披露的卵巢癌中KAAGl的过度表达在以前从未有文件记录过。
[0070]因此我们已经研究了 KAAGl是否可以用于基于抗体的诊断和治疗。
[0071]已经建立了若干基于卵巢癌细胞的模型，例如T0V-21G、T0V-112D, 0V-90以及其他，并且这些模型对于本领域的技术人员来说是熟悉的。这些细胞是人卵巢癌细胞系的集合的一部分，这些人卵巢癌细胞系衍生自具有卵巢肿瘤或腹水液的患者。这些细胞系已经经历深入分析，包括在微阵列上的全基因表达谱，这些微阵列使这些细胞系成为优异的用于人卵巢癌的基于细胞的模型。生长特性、基因表达谱以及对化学治疗药的反应指示这些细胞系对于卵巢肿瘤体内行为是非常具有代表性的(贝诺特(Benoit)等人，2007)。从这些卵巢癌细胞系分离的总RNA的RT-PCR分析显示KAAGl转录物弱表达于从原发性肿瘤衍生的细胞系中。相比之下，源于腹水液的细胞系包含高水平的KAAGl表达。在来自腹水液的细胞中KAAGl的增加的表达表明细胞的环境影响KAAGl基因的调节。腹水细胞与晚期疾病相关，并且这种表达模式意味着增加的KAAGl水平与锚定非依赖性生长(anchorage-1ndependent growth)相关。与这个后者的表明一致，发现当将这些细胞在3D培养下培养为球状体细胞时，在从原发性肿瘤衍生的细胞系中KAAGl表达显著增加。这些球状体细胞已经被广泛表征，并且发现其展示出许多与体内肿瘤相关的特性(科迪(Cody)等人，2008)。因此，发现在模拟肿瘤进展(特别是在卵巢癌的演化过程中)的模型中KAAGl的表达显著增加。
[0072]随着在卵巢癌细胞中KAAGl表达被调节的证明，在基于细胞的测定中检验了这种基因在卵巢癌细胞行为中的功能。为此目的，使用RNA干扰(RNAi)来敲低卵巢癌细胞系中的内源性KAAGl基因的表达，并且发现KAAGl的降低的表达导致如在标准细胞运动性测定中所确定的细胞迁移的显著减少，如由伤口愈合(或擦伤)分析所举例说明的。这种类型的分析测量了细胞填充一个融合单层中的裸露区的速度。KAAGl的表达降低导致卵巢癌细胞系的存活的降低，如通过克隆生成测定(例如集落存活分析)所测量的。本领域的技术人员可以使用其他方法来评估KAAGl在癌细胞(特别是卵巢癌细胞)的行为中的需要。
[0073]基于在大比例的卵巢肿瘤中KAAGl的表达、它在正常组织中的有限表达、以及在表达水平和增加的恶性之间的一致性、以及KAAGl在卵巢癌细胞系的行为中的假定的生物作用，将KAAGl选择作为治疗靶标，以用于开发用于卵巢癌的检测、预防、和治疗的抗体。KAAGl在除了卵巢癌之外的癌症中的表达还引导 申请人:对用于其他癌症适应症的治疗性或诊断性抗体进行评估。
[0074]因此本发明提供了抗-KAAGl抗体和其抗原结合片段，它们特异性地靶向KAAGl并且可以例如用作抗体-药物结合物。
[0075]这样的抗体和抗原结合片段包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段、单链抗体、域抗体、以及具有抗原结合区的多肽。
[0076]结合至KAAGl上的抗体和抗原结合片段
[0077]最初将抗体针对它们对感兴趣抗原的特异性而从Fab文库分离。
[0078]在此所述的抗体或抗原结合片段的可变区可以与所希望的物种的恒定区融合，由此允许抗体由所希望的物种的效应细胞识别。恒定区可以例如源于IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4亚型。克隆或合成框内恒定区与可变区在本领域的技术人员的范围之内，并且可以例如通过重组DNA技术来进行。因此，包含人抗体恒定区的抗体以及包含人抗体框架氨基酸的抗体或抗原结合片段也被本发明包括。
[0079]本发明因此提供了示例性实施例，包含一个轻链可变区的一种分离的抗体或抗原结合片段，该轻链可变区具有；
[0080] a.一个 CDRLl 序列，该 CDRLl 序列包含 SEQ ID N0.:8 或如在 SEQID N0.:8 中所列出的；
[0081]b.一个 CDRL2 序列，该 CDRL2 序列包含 SEQ ID N0.:9 或如在 SEQID N0.:9 中所列出的，或；
[0082]c.一个 CDRL3 序列，该 CDRL3 序列包含 SEQ ID N0.: 10 或如在 SEQID N0.:10 中所列出的。
[0083]分离的抗体或抗原结合片段还可以包含一个重链可变区，该重链可变区具有；
[0084]a.一个 CDRHl 序列，该 CDRHl 序列包含 SEQ ID N0.:5 或如在 SEQID N0.:5 中所列出的；
[0085]b.一个 CDRH2 序列，该 CDRH2 序列包含 SEQ ID N0.:6 或如在 SEQID N0.:6 中所列出的，或；
[0086]c.一个 CDRH3 序列，该 CDRH3 序列包含 SEQ ID N0.:7 或如在 SEQID N0.:7 中所列出的。
[0087]在一个示例性实施例中，抗体或抗原结合片段可以包含轻链可变区的任何单独的⑶R或者⑶R1、⑶R2和/或⑶R3的组合。可以更具体地选择⑶R3。组合可以包括例如CDRLl 和 CDRL3, CDRLl 和 CDRL2, CDRL2 和 CDRL3 以及，CDRLl、CDRL2 和 CDRL3。
[0088]在另一个示例性实施例中，抗体或抗原结合片段可以包含重链可变区的任何单独的⑶R或者⑶R1XDR2和/或⑶R3的组合。可以更具体地选择⑶R3。组合可以包括例如CDRHl 和 CDRH3，CDRHl 和 CDRH2，CDRH2 和 CDRH3 以及，CDRHl、CDRH2 和 CDRH3。
[0089]根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3中的至少两个CDR。
[0090]同样，根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含一个⑶RL1、一个⑶RL2和一个CDRL3。
[0091]进一步根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含:
[0092]a.⑶RLl、⑶RL2或⑶RL3中的至少两个⑶R以及；
[0093]b.一个⑶RHl、一个⑶RH2或一个⑶RH3中的至少两个⑶R。
[0094]抗体或抗原结合片段可以更优选地包含一个⑶RLl、一个⑶RL2和一个⑶RL3。
[0095]抗体或抗原结合片段也可以更优选地包含一个⑶RHl、一个⑶RH2和一个⑶RH3。
[0096]根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含一个⑶RHl、一个⑶RH2或一个⑶RH3。[0097]根据本发明，抗体或抗原结合片段也可以包含一个⑶RH1、一个⑶RH2和一个CDRH3。
[0098]当轻链可变区或重链可变区仅有一者可获得时，可以使用在本领域中已知的方法通过筛选互补可变区文库而重建抗体或抗原结合片段(波尔托拉诺(Portolano)等人《免疫学杂志》(The Journal of Immunology) (1993) 150:880-887,克拉克森(Clarkson)等人,《自然》(Nature) (1991)352:624-628)。
[0099]本发明还包括含有在此处所述的⑶R的至少一者中具有至少一个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0100]本发明还包括含有在至少两个⑶R中具有至少一个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0101]本发明还包括含有在3个⑶R中具有至少一个保守性氨基酸置换(与原始⑶R相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0102]本发明还包括含有在至少一个⑶R中具有至少两个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0103]本发明还包括含有在至少两个⑶R中具有至少两个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0104]本发明还包括含有在3个⑶R中具有至少两个保守性氨基酸置换(与原始⑶R相比较)的可变链的多肽或抗体。
[0105]在另一个方面，本发明涉及一种多肽、抗体或抗原结合片段，它们包含(在单一多肽链上或在多个分开的多肽链上`)在此所述的抗体或抗原结合片段之一的轻链可变区的至少一个互补决定区以及重链可变区的至少一个互补决定区。
[0106]本发明在其另一个方面涉及抗-KAAGl抗体，这些抗-KAAGl抗体可以包含(在单一多肽链上或在多个分开的多肽链上)在此所述的抗体或抗原结合片段的所有六个互补决定区(⑶幻。
[0107]变体抗体和抗原结合片段
[0108]本发明还包括在此所述的抗体或抗原结合片段的变体。所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有在氨基酸序列中的变异的那些。例如，所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有至少一个变体⑶R(两个、三个、四个、五个或六个变体⑶R或甚至12个变体OTR)、一个变体轻链可变区、一个变体重链可变区、一个变体轻链和/或一个变体重链的那些。包括在本发明中的变体抗体或抗原结合片段是具有例如与原始抗体或抗原结合片段相比较相似的或改进的结合亲和力的那些。
[0109]如在此使用的术语“变体”适用于在此所述的任何序列，并且包括例如变体CDR (CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2和/或CDRH3)、变体轻链可变区、变体重链可变区、变体轻链、变体重链、变体抗体、变体抗原片段以及KAAGl变体。
[0110]被本发明包括的变体抗体或抗原结合片段是可以包含插入、缺失或氨基酸置换(保守性或非保守性)的那些。这些变体在其氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基可以被去除并且在其位置中插入一个不同的残基。
[0111]本发明的抗体或抗原结合片段可以具有如上所述的轻链可变区和/或重链可变区，并且可以进一步包含恒定区的氨基酸，例如人抗体恒定区的氨基酸。[0112]在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可以包含例如人IgGl恒定区。
[0113]根据本发明的另一个示例性实施例，抗原结合片段可以是例如scFv、Fab、Fab'或(Fab' )2。
[0114]用于置换诱变的感兴趣位点包括高变区(CDR)，但是还考虑了在框架区中或甚至在恒定区中的修饰。可以通过将来自以下列出的组(I至6组)中之一的(⑶R、可变链、抗体等的)氨基酸用相同组的另一个氨基酸交换而产生保守性置换。
[0115]保守性置换的其他示例性实施例示于表格IA中“优选的置换”标题之下。如果这样的置换导致所不希望的特性，则可以将在表1A中命名为“示例性置换”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性改变引入，并且筛选产物。
[0116]本领域中已知的是变体可以通过置换诱变而产生，并且保留本发明的多肽的生物活性。这些变体在其氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被去除并且在其位置中插入一个不同的残基。例如，用于置换诱变的感兴趣的一个位点可以包括这样一个位点:在该位点中从不同物种获得的特定残基是相同的。被鉴定为“保守性置换”的置换的实例示于表1A中。如果这样的置换导致所不希望的改变，则可以将在表1A中命名为“示例性置换”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的其他类型的置换引入，并且筛选产物。
[0117]通过选择置换而完成在功能或免疫身份方面的实质性修饰，这些置换在它们对维持以下项的作用方面显著不同:(a)在置换区域中的多肽主链的结构，例如，如片层或螺旋构象。(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组:
[0118](I组)疏水性的:正亮氨酸 、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)
[0119](2组)中性亲水性的:半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
[0120](3组)酸性的:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
[0121](4组)碱性的:天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
[0122](5组)影响链取向的残基:甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro);以及
[0123](6组)芳香族的:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
[0124]非保守性置换将需要将这些类别之一的一个成员用另一个交换。
[0125]表1A.氨基酸置换
【权利要求】
1.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至肾相关抗原I (KAAGl)上，这种肾相关抗原I具有与SEQ ID N0.:4至少70%—致的一个轻链可变区和/或与SEQ ID N0.:2至少70%—致的一个重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段与SEQ ID N0.:4或SEQ ID N0.:2相比包含至少一个氨基酸置换，并且其中所述氨基酸置换是在一个互补决定区(OTR)之外。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区与SEQID N0.:4是至少80% —致的。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区与SEQID N0.:4是至少90% —致的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区与SEQID N0.:2是至少80% —致的。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区与SEQID N0.:2是至少90% —致的。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该至少一个氨基酸置换是在该轻链可变区之内。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该至少一个氨基酸置换是在该重链可变区之内。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中这些重链⑶R包含在SEQ ID N0.:5、SEQ ID N0.:6 和 SEQ ID N0.:7 中列出的这些氨基酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中这些轻链⑶R包含在SEQ ID N0.:8、SEQ ID N0.:9 和 SEQ ID N0.:10 中列出的这些氨基酸。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是一种单克隆抗体、一种嵌合抗体、一种杂交抗体、一种人源化抗体或一种人抗体、或它们的一种抗原结合片段。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID N0.:30中所列出的。
12.如权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQIDN0.:32中所列出的。
13.如权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQIDN0.:33中或在SEQ ID N0.:34中所列出的。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQ ID N0.:35中所列出的。
15.如权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQIDN0.:36中所列出的。
16.如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQIDN0.:37中所列出的。
17.如权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQIDN0.:38, SEQ ID N0.:39, SEQ ID N0.:40 或 SEQ ID N0.:41 中所列出的 。
18.一种抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段能够与如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争并且具有少InM的亲和力。
19.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与一种治疗部分相结合。
20.如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与一种可检测部分相结合。
21.一种核酸，该核酸编码如权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段的一个轻链可变区和/或一个重链可变区。
22.—种载体，该载体包含如权利要求21所述的核酸。
23.如权利要求22所述的载体，其中所述载体是一种表达载体。
24.一种分离的细胞，这种分离的细胞包含如权利要求21所述的核酸。
25.如权利要求24所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变区的一种核酸、以及编码一个重链可变区的一种核酸。
26.如权利要求25所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
27.一种分离的细胞，这种分离的细胞包含或表达如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
28.如权利要求27所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变区的一种核酸、以及编码一个重链可变区的一种核酸。
29.如权利要求28所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
30.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段、以及一种药学上可接受的载体。
31.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段、以及一种载体。
32.—种治疗癌症的方法，该癌症包含表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞，该方法包括将如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段给予至有需要的受试者。
33.如权利要求32所述的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成:卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结肠直肠癌、肉瘤、白血病、脑肿瘤、甲状腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、食管肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤以及头颈部肿瘤。
34.如权利要求33所述的方法，其中该癌症是卵巢癌。
35.如权利要求34所述的方法，其中该癌症是复发性卵巢癌。
36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中该癌症是转移性的。
37.一种检测肿瘤的方法，该肿瘤包含表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞，该方法包括将如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段给予至有需要的受试者。
38.如权利要求37所述的方法，其中有需要的受试者患有一种选自下组的癌症，该组由以下各项组成:卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结肠直肠癌、肉瘤、白血病、脑癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及头颈癌。
39.一种用于检测KAAGl或KAAGl变体的方法，该方法包括使一种表达KAAGl或KAAGl变体的细胞或一种包含或疑似包含KAAGl或该KAAGl变体的样品与如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，并且对结合进行测量。
40.如权利要求39所述的方法，其中受试者患有或疑似患有癌症。
41.如权利要求40所述的方法，其中该癌症是转移性的。
42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中该样品是从一种哺乳动物获得的一种血清样品、一种血浆样品或一种血液样品。
43.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中该样品是从一种哺乳动物获得的一种组织样品。
44.如权利要求39至41所述的方法，其中该样品是一种细胞培养物或一种上清液。
45.如权利要求39至44中任一项所述的方法，该方法包括将结合至KAAGl或该KAAGl变体上的抗体的量进行定量。
46.—种试剂盒,该试剂盒包含如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
47.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段在一种药剂的制造中的用途，该药剂用于治疗癌症，该癌症包含表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞。
48.如权利要求47所述的用途，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成:卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结肠直肠癌、肉瘤、白血病、脑癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及头颈癌。
49.如权利要求48所述的用途，其中该癌症是卵巢癌。
50.如权利要求49所述的用途，其中该癌症是复发性卵巢癌。
51.如权利要求47至50中任一项所述的用途，其中该癌症是转移性的。
52.如权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段在包含表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞的癌症的诊断中的用途，或在表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞的检测中的用途。
53.如权利要求52所述的用途，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成:卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结肠直肠癌、肉瘤、白血病、脑癌、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌、肺癌以及头颈癌。
54.如权利要求53所述的用途,其中该癌症是卵巢癌。
55.如权利要求54所述的用途，其中该癌症是复发性卵巢癌。
56.如权利要求52至55中任一项所述的用途，其中该癌症是转移性的。
57.一种用于获得抗体或其抗原结合片段的方法，该抗体或其抗原结合片段适合于用作一种治疗癌症的抗体-药物结合物，该癌症包含表达KAAGl或一种KAAGl变体的细胞，该方法包括: a.提供特异性地结合至一种表位的一种抗体或一种抗原结合片段，该表位被包含在KAAGl或一种KAAGl变体的氨基酸61与84之间； b.对该抗体或抗原结合片段在表达KAAGl或一种KAAGl变体的一种细胞之内的内化进行测试；并且 c.对被内化的一种抗体或一种抗原结合片段进行分离。
【文档编号】A61P35/04GK103492418SQ201280015597
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年3月31日
【发明者】G·B·特雷姆勃雷, A·N·莫莱提斯, T·舒利亚, M·菲利昂 申请人:阿莱斯亚生物疗法股份有限公司