包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法

包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法
【专利摘要】本发明涉及用于保护免患破伤风的疫苗的领域，并且具体涉及包含吸附在铝盐上的破伤风类毒素的疫苗的生产方法。提供方法，由此将破伤风类毒素吸附至具有用于最佳结果的确定特征的铝盐佐剂上。
【专利说明】包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于保护免患破伤风的疫苗的领域，并且具体是包含吸附在铝盐上的破伤风类毒素的疫苗的生产方法。
【背景技术】
[0002]已知可以预防通常组合有百日咳博德特氏菌{Bordetella pertussis)、白喉棒杆菌(Porynebacteriumdiphtheriae)的破伤风梭菌 ipiostridiumtetani)的疫苗。此类疫苗可以包含一种或多种吸附在铝盐上的源于破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌和/或白喉棒杆菌的抗原。本发明人已经惊奇地发现铝盐的蛋白吸附和/或如通过X射线衍射测定的晶体大小对吸附至所述铝盐上的抗原并且具体为源于破伤风梭菌的类毒素([例如]破伤风类毒素)的免疫原性是重要的。
[0003]发明概述
因此，本发明提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗 粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.5 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力。
[0004]在本发明的进一步方面，提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小。
[0005]在进一步的方面，本发明提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。
[0006]附图简述
图1 ζ电势pH 7.0 (mV)相比于蛋白吸附(mg BSA/mg Al3+)。
[0007]图2辐射对蛋白吸附和表面电荷(ZP)的作用。
[0008]发明详述
本发明人已经发现其上吸附有破伤风类毒素的铝盐的蛋白吸附、ζ电势和/或晶体大小对于破伤风类毒素疫苗的免疫学特征非常重要。因此，本发明提供了包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述招盐颗粒具有2.5-3.5 mg蛋白/mg招盐的蛋白吸附能力。
[0009]破伤风类毒素(TT)及其制备方法在本领域是众所周知的。在一个实施方案中，通过从破伤风梭菌的培养物纯化毒素随后通过化学解毒作用来生产TT，但或者通过纯化重组的或遗传解毒的毒素类似物来制备它(例如，如EP 209281中描述)。解毒作用的优选方法如下。发酵后，在硅藻土作为助滤剂存在的情况下，将培养液在0.l_0.3Mffl滤器上过滤。将收获物经0.22ΜΠ1滤器澄清，浓缩并在30kD平板膜上对10体积的磷酸盐缓冲液(20mM -pH 7.3)渗滤。随后在37°C下将渗滤后的毒素在以下条件下解毒4周:甲醛20mM -赖氨酸3mM -磷酸钾IOOmM -起始pH 7.3 - 500 Lf/ml。将所获的类毒素通过硫酸铵分级纯化，浓缩并对WFI渗滤(30kD)以去除硫酸铵。加入NaCl至终浓度为0.9%，将pH调节至7.3并将纯化的破伤风类毒素无菌过滤。
[0010]可以使用任何合适的破伤风类毒素。‘破伤风类毒素’可以包含全长蛋白的免疫原性片段(例如片段C 一见EP 478602)。
[0011]将本发明的破伤风类毒素吸附至铝盐上。在本发明的一个具体实施方案中，铝盐是氢氧化铝。在另一个实施方案中，可以将本发明的破伤风类毒素吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在进一步的实施方案中，可以将破伤风类毒素吸附至氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。
[0012]将蛋白包括破伤风类毒素吸附至铝盐上的方法对于技术人员是熟知的(例如疫苗制备通常描述于Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach” (eds PowellM.F.& Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York 中)。
[0013]在本发明的一个具体实施方案中，铝盐具有2.5-3.5,2.6-3.4,2.7-3.3或
2.9-3.2 mg 蛋白 /mg铝盐的蛋白吸附能力，例如 2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3、
3.4或3.5 mg蛋白/mg铝盐的蛋白吸附能力。铝盐可以具有2.5-3.7,2.6-3.6,2.7-3.5或2.8-3.4 mg蛋白(BSA)/mg招盐的蛋白吸附能力，例如3.6 mg蛋白(BSA)/mg招盐的蛋白吸附能力。铝盐的蛋白吸附能力可以通过技术人员已知的任何方法来测定。在本发明的一个具体实施方案中，使用如实施例1中 描述的方法(其利用BSA)或其变化测定铝盐的蛋白吸附能力。在本发明的一个具体实施方案中，铝盐的蛋白吸附能力为2.9-3.2 mg BSA/mg铝盐。
[0014]在本发明进一步的实施方案中，本发明的铝盐具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm 的晶体大小，例如 2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.9-3.4nm 或 3.4-5.6nm。X 射线衍射对于技术人员是熟知的。在本发明的一个具体实施方案中，使用实施例1中描述的方法测定晶体大小。
[0015]在本发明进一步的实施方案中，铝盐在pH 7具有约17-23 mV、18_22 mV或19-21mV的ζ电位，例如17、18、19、20、21、22或23 mV的ζ电位。铝盐在pH 7可以具有14-22mV、15-21 mV或16-20 mV的ζ电位，例如14、15或16 mV的ζ电位。可以通过技术人员已知的任何方法例如通过数字光散射(DLS)测定ζ电位。在本发明的一个具体实施方案中，使用如实施例1中描述的方法测定?电位。
[0016]已经发现具有至少在以上范围内的蛋白吸附能力并任选具有在以上范围内的晶体大小和/或?电位的铝盐对于配制包含破伤风类毒素的组合疫苗、在破伤风类毒素效价以及共配制抗原的免疫原性方面是最佳的。抗原诸如破伤风类毒素效价的提高提供了使用更低量的抗原来实现相同水平的免疫应答的可能性，从而利于节约抗原。
[0017]可以通过技术人员已知的任何方法制备本发明的铝盐(例如见，疫苗制备通常描述于 Vaccine Design “The subunit and adjuvant approach，，(eds Powell M.F.&Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York、US4882140A 和 US4826606A 中)。技术人员知道如何改变蛋白吸附、晶体大小和/或表面电荷(在PH 7的ζ电位)，并且因此如何使铝盐展示出在确定参数内的这些特征。
[0018]或者，用于本发明的方法中的铝盐可以是商业来源的，例如Rehydragel? HS (在水中 3% 的氧氧化招[General Chemical])或 Alhydrogel? 85 (Brenntag BioSector[Denmark])。
[0019]在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述的铝盐(例如Rehydragel? HS或Alhydrogel? 85)在购买后尚未进行高压灭菌。(Alhydrogel? 85由制造商高压灭菌(即，在购买前)，而Rehydragel? HS改为由制造商通过照射灭菌。)为了产生本发明的无菌招盐，将铝盐通过其他方法具体为通过照射进行灭菌。可以使用紫外线(UV)、来自放射性同位素源(例如钴-60)的Y (λ)辐射、β (β)辐射、电子束或X射线照射将铝盐照射以产生无菌铝盐。在一个具体实施方案中，将本发明的铝盐通过Y辐射灭菌。在另一个实施方案中，提供铝盐佐剂的灭菌方法，其包括将所述佐剂仅高压灭菌一次。在该实施方案中，可以以实现灭菌所需的最少时间将佐剂高压灭菌，例如从高压灭菌循环开始至结束不超过约90分钟。任选地，一次高压灭菌的佐剂还可以通过照射灭菌。
[0020]本发明人已经显示高压灭菌本发明的铝盐可以降低吸附至所述铝盐上的蛋白(尤其是破伤风类毒素)的免疫原性。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。
[0021]在进一步的实施方案中，本发明提供了包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒如本文描述。
[0022]白喉类毒素(DT)及其制备方法广泛记载。可以使用任何合适的白喉类毒素。例如，可以通过从白喉棒杆菌的培养物纯化毒素随后通过化学解毒作用来生产DT，但或者通过纯化重组的或遗传解毒的毒素类似物来制备(例如，CRM197,或如US 4，709，017、US5，843，711、US 5，601，827和US 5，917，017中描述的其他突变体)。解毒作用的优选方法如下。发酵后，将白喉类毒素通过TFF 0.45Mffl收获，经0.22Mffl滤器澄清，浓缩并在IOkD平板膜上对10体积的磷酸盐缓冲液(20mM - pH 7.2)渗滤。随后在37°C下将渗滤后的毒素在以下条件下解毒6周:甲醛50mM -赖氨酸25mM -磷酸钾50mM -起始pH 7.2 -300 Lf/ml ο将所获的类毒素通过硫酸铵分级纯化，浓缩并对WFI渗滤(30kD)以去除硫酸铵。加入NaCl至终浓度为0.9%，将pH调节至7.3并将纯化的白喉类毒素无菌过滤。
`[0023]在一个具体的实施方案中，提供本发明的方法，其中将破伤风和白喉类毒素单独或者共同吸附至铝盐上。在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其中将本发明的破伤风类毒素吸附至本发明的铝盐上，并且其中将白喉类毒素吸附至不同的铝盐上，所述铝盐可以是本发明的铝盐或任何其他铝盐。
[0024]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与灭活脊髓灰质炎疫苗配制的步骤。灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)可以包含I型IPV或2型IPV或3型IPV、或I型和2型IPV、或I型和3型IPV、或2型和3型IPV、或I型、2型和3型 IPV。
[0025]灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的制备方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，如同疫苗领域中普遍的，IPV应该包含I型、2型和3型，并且可以是用甲醛灭活的索尔克脊髓灰质炎疫苗(例如见 Sutter 等，2000，Pediatr.Clin.North Am.47:287; Zimmerman和 Spann 1999, Am Fam Physician 59:113; Salk 等，1954， Official MonthlyPublication of the American Public Health Association 44(5):563; Hennesen,1981, Develop.Biol.Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv.Virus Res.39:255)。或者，IPV可以使用 Sabin菌株制成(Sabin-1PV; Kersten等(1999)，Vaccine 17:2059)。
[0026]在一个实施方案中，(例如，在与其他组分混合之前)IPV不吸附。在另一个实施方案中，(例如，在与其他组分混合之前或之后)可以将本发明的IPV组分吸附至铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，可以将本发明的IPV组分吸附至铝盐诸如磷酸铝上。在进一步的实施方案中，可以将IPV组分吸附至氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物上。如果吸附的话，可以将一种或多种IPV组分单独吸附或作为混合物共同吸附。在进一步的实施方案中，如本文描述将IPV吸附至铝盐/颗粒上。
[0027]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与百日咳杆菌粘附素配制的步骤。百日咳杆菌粘附素(百日咳的69 kDa抗原)是外膜蛋白，其是热稳定的并且能通过本领域已知的方法制备(见EP0162639)。任选将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳杆菌粘附素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳杆菌粘附素吸附至铝盐上。[0028]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与丝状血细胞凝集素(FHA)配制的步骤。可以以本领域熟知的方法制备FHA(见W0/1990/013313 (US7479283)中公开且引用的方法)。任选将FHA吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将FHA吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将FHA吸附至铝盐上。
[0029]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与百日咳类毒素配制的步骤。百日咳类毒素的生产方法对于技术人员是熟知的。可以通过甲醛处理的熟知方法或通过突变方法(PT衍生物)将百日咳毒素解毒。已经发现蛋白的SI亚基内的残基替换产生保留百日咳毒素的免疫学和保护特性但具有降低的或没有毒性的蛋白(EP 322533)。在EP322533的权利要求中讨论的解毒突变是本发明的PT解毒突变体的实例。任选将百日咳类毒素吸附至铝盐颗粒上。在本发明的一个实施方案中，将百日咳类毒素吸附至氢氧化铝上。在本发明的一个具体实施方案中，如本文描述将百日咳类毒素吸附至铝盐上。
[0030]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与来自b型流感嗜血杆菌Qlaemophilus influenzae) (Hib)的荚膜糖配制的步骤,其任选吸附至铝盐颗粒上。
[0031]来自b型流感嗜血杆菌的多核糖基核糖醇磷酸荚膜糖(PRP)可以与载体蛋白缀合。糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物。如W097/00697中描述可以任选将Hib抗原吸附至磷酸铝上，或者如W002/00249中描述可以不吸附或者可以不进行具体的吸附处理。
[0032]本文的抗原‘未吸附至铝佐剂盐上’(“未吸附(unadsorbed)”或“未吸附(notadsorbed)”)表示例如在组合物的配制方法中不涉及明确的或专门的抗原在新的铝佐剂盐上的吸附步骤。
[0033]Hib可以与任何载体缀合，所述载体可以提供至少一种辅助T细胞表位，并且可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197(白喉类毒素突变体)或来自非分型流感嗜血杆菌的蛋白 D(EP0594610)。
[0034]在进一步的实施方案中，提供本发明的方法，其进一步包括将免疫原性组合物与乙肝表面抗原配制的步骤。
[0035]乙肝表面抗原(HBsAg)的制备广泛记载。例如见Hartford等，1983，Develop.Biol.Standard 54:125; Gregg 等，1987，Biotechnology 5:479; EP0226846;EP0299108。它可以如下制备。由于在HBV感染过程中，大量HBsAg在肝脏中合成并释放至血流中，因此一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆中纯化微粒形式的抗原。另一种方法涉及通过重组DNA方法表达蛋白。可以通过在酿酒酵母cererisiae)酵母、毕赤酵母、昆虫细胞(例如Hi5)或哺乳动物细胞中表达来制备HBsAg。可以将HBsAg插入至质粒中，并且可以通过启动子诸如“GAPDH”启动子(来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)来控制它从质粒的表达。酵母可以培养在合成培养基中。可以随后通过包括步骤诸如沉淀、离子交换层析和超滤的方法来纯化HBsAg。纯化后，HBsAg可以进行透析(例如用半胱氨酸)。HBsAg可以以微粒形式使用。
[0036]如本文所用，表达方式“乙肝表面抗原”或“HBsAg”包括展示出HBV表面抗原的抗原性的任何HBsAg抗原或其片段。将理解除了 HBsAg S抗原的226个氨基酸的序列之外(见Tiollais等，1985，Nature 317:489和其中的参考文献)，如需要，如本文描述的HBsAg可以包括如以上参考文献中和EP0278940中描述的前S序列的全部或部分。具体而言，HBsAg可以包含含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含相对于ad血清型的乙肝病毒的L-蛋白的可读框(该多肽称为L*;见EP0414374)，HBsAg的L-蛋白的残基133-145和随后的残基175-400。在本发明的范围内，HBsAg还可以包括EP0198474 (Endotronics)中描述的前S1-前S2-S多肽或者其类似物诸如EP0304578 (McCormick and Jones)中描述的那些。如本文使用的HBsAg还可以指突变体，例如WO 91/14703或EP0511855A1中描述的“逃逸突变体”，尤其是其中在145位上的氨基酸替换为甘氨酸至精氨酸的HBsAg。
[0037]HBsAg可以是颗粒形式。颗粒可以包含例如单独S蛋白或者可以是复合颗粒，例如L*，S)，其中L*如上文定义并且S表示HBsAg的S蛋白。所述颗粒有利地为它在酵母中表达所处于的形式。
[0038]在一个实施方案中，H BsAg是用于 EngerixB ? (GlaxoSmithKline Biologicals
S.A.)中的抗原，其还描述于W093/24148中。
[0039]可以将乙肝表面抗原任选吸附至铝盐具体为磷酸铝上，其可以在与其他组分混合前完成(描述于W093/24148)。乙肝组分应该基本上不含硫柳汞(不含硫柳汞的HBsAg的制备方法之前已在EP1307473中公开)。
[0040]在本发明进一步的实施方案中，提供了铝盐佐剂的灭菌方法，其包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤。通过照射灭菌可以以技术人员已知的任何方法并且具体通过本文描述的任何照射方法来进行。
[0041]在本发明的进一步的实施方案中，提供了这样的方法，其中铝盐为氢氧化铝，其中，单位晶体大小为如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm,例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、
2.7-3.4nm或3.4-5.6nm，并且其中照射选自紫外线(UV)、来自放射性同位素源(例如钴-60)的Y (λ)辐射、β (β)辐射、电子束或X射线照射。
[0042]在本发明的进一步的实施方案中，提供了包含白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种的疫苗的制备方法，其中将白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。
[0043]在本发明的一个具体实施方案中，提供如本文描述的方法，其中破伤风类毒素和/或白喉类毒素存在并且吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。
[0044]在本发明进一步的实施方案中，提供如本文描述的方法，其中白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素均存在并且吸附至通过任何铝盐佐剂的灭菌方法制备的铝佐剂上，所述灭菌方法包括照射步骤并且不包括本文描述的高压灭菌步骤。
[0045]在每一种情况下，发明人意在本文的术语“包含(comprising) ”、“包含(comprise) ”和“包含(comprises) ”可以分别由术语“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consist of)”和“由…组成(consists of)”所替换。
[0046]术语“免疫原性组合物”任选由术语“疫苗”所替换，并且反之亦然。
[0047]以下实施例说明但不限制本发明的范围。
实施例
[0048]与以下实施例相关的注释:如上讨论,Alhydrogel? 85 (和Alhydrogel?)在购买前高压灭菌，同时ReHydragel? HS和其他“ReHydragel?”表示的铝盐没有高压灭菌。因此，当说明“Alhydrogel?”产品已经高压灭菌或再高压灭菌时，这表示在购买后高压灭菌(即第二次)。当说明“ReHydragel?”产品已经高压灭菌时，这表示购买后进行的第一次高压灭菌。
[0049]实施例1:铝盐的表征
对多种氢氧化铝测定蛋白吸附能力、表面电荷“电位；ZP)和晶体大小。
[0050]1.1氢氧化铝的BSA吸附能力
制备牛血清白蛋白(BSA)的贮存液，其包含在MilliQ水中6mg/ml的BSA和在MilliQ水中ImgAl3+Ail的氢氧化铝。
[0051]通过原子分光光度测定用亚硝火焰测定铝含量。使用在盐酸(HCl)中制备的一定范围的铝标准溶液建立标准曲线。将HCl用作空白。将已知量的铝样品用作阳性对照。将测试样品和阳性对照在HCl中稀释以获得在标准曲线范围内的铝的终浓度。通过加热矿化后，将样品冷却至室温并用纯水加至所需体积。随后用一氧化二氮-乙炔火焰测定铝浓度。从标准曲线测定测试溶液中的铝含量。
[0052]用不同比例的BSA/铝制备样品，例如:
【权利要求】
1.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.5,2.6-3.4,2.7-3.3或2.9-3.2的蛋白吸附能力。
2.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.7,2.6-3.6,2.7-3.5或2.8-3.4的蛋白吸附能力。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述铝盐具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm 的晶体大小，例如 2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.9-3.4nm 或 3.4-5.6nm 的晶体大小。
4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述铝盐具有如通过X射线衍射测定的3.3-5.7nm的晶体大小。
5.权利要求1或权利要求3的方法，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.6的蛋白吸附能力和2.9-5.6nm的晶体大小。
6.包含破伤风类毒素的免疫原性组合物的生产方法，其包括将所述破伤风类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如 2.9-5.6nm>2.8-3.5nm>2.7-3.4nm 或 3.4-5.6nm 的晶体大小。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其用于生产包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物，包括将所述白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒(所述白喉类毒素吸附在其上)具有2.5-3.5,2.6-3.4,2.7-3.3或2.9-3.2的蛋白吸附能力。
8.权利要求7的方法，其中所述铝盐颗粒(所述白喉类毒素吸附在其上)具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其用于生产包含破伤风类毒素和白喉类毒素的免疫原性组合物，包括将所述白喉类毒素吸附至铝盐颗粒上的步骤，其中所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒在pH7具有约17-23 mV、18_22mV或19-21 mV的ζ电位。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒在pH7具有约14-22 mV、15_21mV或16-20 mV的ζ电位。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述白喉类毒素和破伤风类毒素单独吸附或共同吸附至所述铝盐颗粒上。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中已经通过将破伤风毒素化学解毒而生产所述破伤风类毒素。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中已经通过将破伤风毒素遗传解毒而生产所述破伤风类毒素。
15.权利要求7-14中任一项的方法，其中已经通过将白喉毒素化学解毒而生产所述白喉类毒素。
16.权利要求7-14中任一项的方法，其中已经通过将白喉毒素(具体为CRM197)遗传解毒而生产所述白喉类毒素。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与灭活脊髓灰质炎疫苗配制的步骤，任选所述灭活脊髓灰质炎疫苗已吸附至铝盐颗粒上。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与百日咳杆菌粘附素配制的步骤，任选所述百日咳杆菌粘附素已吸附至铝盐颗粒上。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与丝状血细胞凝集素配制的步骤，任选所述丝状血细胞凝集素已吸附至铝盐颗粒上。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与百日咳类毒素配制的步骤，任选所述百日咳类毒素已吸附至铝盐颗粒上。
21.权利要求17-20中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒在pH7 具有约 17-23 mV、18-22 mV 或 19-21 mV 的 ζ 电位。
22.权利要求17-21中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒具有2.5-3.5,2.6-3.4,2.7-3.3 或 2.9-3.2 的蛋白吸附能力。
23.权利要求17-22中任一项的方法，其中(所述进一步步骤的)所述铝盐颗粒具有如通过X射线衍射测定的2.8-5.7nm的晶体大小，例如2.9-5.6nm、2.8-3.5nm、2.7-3.4nm或3.4-5.6nm的晶体大小。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述铝盐是氢氧化铝。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述铝盐尚未进行高压灭菌。
26.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述铝盐已经进行仅一次的高压灭菌。
27.权利要求26的方法，其中以实现灭菌所需的最少时间将所述铝盐高压灭菌，例如从高压灭菌循环开始至结束不超过约90分钟。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述铝盐通过照射灭菌。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖配制的步骤，任选所述来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖已吸附至铝盐颗粒上。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其进一步包括将所述免疫原性组合物与乙肝表面抗原配制的步骤，任选所述乙肝表面抗原已吸附至铝盐颗粒上。
31.权利要求29或30的方法，其中所述铝颗粒是磷酸铝。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述铝盐颗粒具有2.5-3.7,2.5-3.5、2.6-3.6,2.6-3.4,2.7-3.5,2.7-3.3,2.8-3.4或2.9-3.2 mg BSA/mg铝盐的蛋白吸附能力。
33.疫苗生产方法，所述疫苗包含白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种，其中将白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素中的一种或多种吸附至铝佐剂上，其中通过包括照射步骤并且不包括高压灭菌步骤的方法将所述佐剂灭菌。
34.权利要求33的方法，其中破伤风类毒素和/或白喉类毒素存在并且吸附至所述铝佐剂上。
35.权利要求33或34的方法,其中白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素和百日咳杆菌粘附素均存在并且吸附至所述铝佐剂上。
36.通过权利要求1-35中任一项的方法制备的免疫原性组合物。
【文档编号】A61K39/39GK103458925SQ201280017179
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年4月5日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】K.德-海德, O.施陶特 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司