用于生长因子的多相释放的系统和方法
用于生长因子的多相释放的系统和方法
【专利摘要】一种用于至少一种生长因子在治疗部位的多相递送的系统，包括用于以最初释放模式来释放至少一种生长因子的递送载剂，和用于以持续释放模式来释放至少一种生长因子的载体。最初释放模式在数小时至数天的时间内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子最初大量释放，剩余物以逐渐降低的量释放。持续释放模式在数天至数周的时间内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子在这样的时间段内以通常恒定的量进行释放。本发明的系统特别适合于对生物植入物的应用。本发明还包括用于至少一种生长因子的多相递送的方法和试剂盒。
【专利说明】用于生长因子的多相释放的系统和方法
[0001]在先申请的交叉引用
[0002]该申请根据巴黎公约要求2011年4月11日提交的美国申请61/474，049号的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及用于释放生物物质的系统和方法。具体地，本发明涉及与生物植入物相关的生长因子的释放。更具体地，本发明提供一种用于产生至少一种生长因子的多相释放模式以改善生物植入物的性能的系统和方法。
【背景技术】
[0004]生长因子(GF)是通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子在组织的修复和再生中起着必不可少的作用，GF的外源性应用可以用于刺激各种组织和器官的修复，所述组织和器官包括骨、软骨、皮肤和粘膜，以及用于通过在修复部位的血管再生的刺激增强组织的修复。[0005]哺乳动物中分泌的生长和分化因子的转化生长因子β (TGF β )总科有超过30个成员。这些二聚蛋白质的特征在于保守的七胱氨酸结基结构。它们调节许多细胞种类的增殖、分化和迁移，并在形态发生、器官发生、组织维护和创伤愈合方面具有重要作用。生长因子的TGFii总科可以细分为几个亚科，包括转化生长因子β亚科、骨形态发生蛋白(BMP)和生长分化因子(⑶F)科(也叫做BMP亚科)，以及抑制素和激活素亚科。
[0006]TGF β总科的BMP亚科包含至少二十种蛋白质，包括ΒΜΡ_2、ΒΜΡ-3 (也称作成骨素)、BMP-3b (也称作生长分化因子10，ffl)F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也称作成骨蛋白-1，0Ρ-1)、ΒΜΡ-8 (也称作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-1I (也称作生长分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生长抑制素)、BMP-12 (也称作生长分化因子_7，OTF-7)、BMP_13(也称作生长分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也称作生长分化因子5，⑶F-5)和BMP-15 (关于综述，参见例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs2001 ; 10:1677-1686)。
[0007]BMP已经显示出在成软骨细胞中刺激基质合成；在成骨细胞中刺激碱性磷酸酶活性和胶原蛋白合成，诱导早期间质祖细胞分化为成骨细胞(骨诱导)，调节单核细胞和间质细胞的趋化性，以及调节神经细胞的分化(关于综述，参见例如Azari等，Expert OpinInvest Drugs2001 ；10: 1677-1686 和 Hoffman 等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ；57:294-308)。
[0008]BMP蛋白质的许多功能之一是在脊椎动物中诱导软骨、骨和结缔组织的形成。BMP总科的最具有骨诱导能力的成员是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (参见例如Hoffman等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ;57_294_308 ;Yeh等,J Cellular Biochem.，2005:95-173-188 ;和 Boden，0rthopaedicNursing2005, 24:49_52)。已经长期认为 BMP 的该骨诱导的能力对于各种治疗和临床应用非常有希望，所述治疗和临床应用包括骨折修复；脊柱融合；骨骼疾病的治疗，头骨、下颌骨和骨缺损的再生；以及在口腔和牙科应用中，例如在牙周创伤再生期间的牙齿发生和牙骨质发生中，拔牙窝移植、牙槽嵴增高和上颌窦增高。目前，由美敦力(Medtronic)以INFUSE?销售的重组人类BMP-2被FDA批准用于脊柱融合手术，用于骨折不愈合的修复以及用于口腔手术，而由史赛克(Stryker)以OP-1?销售的重组人类BMP-7被批准作为顽固的长骨不愈合中自体移植的替代，以及用于翻修后外侧腰椎融合，其中自体移植和骨髓收获是不可行的，或者预期不会促进融合。
[0009]已经外源地用于增强骨修复的其他重组生长因子包括各种TGFP (参见Clokie&Bell, J.Craniofacial Surg.2003，14:268_77)、成纤维细胞生长因子总科(FGF)的成员(参见 Kawaguchi 等，(2007) J.0rthopaedic Res.25 (4):480_487)、血小板衍生的生长因子总科(PDGF)的成员(参见Hollinger等，2008JBJS90 (si):48-54)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)(参见 Street 等，2002PNAS99:9656-61 )。
[0010]为了使这些生长因子有效，当在修复部位存在适当的应答细胞的临界密度时，它们必须是活性的并且同时以足够的浓度可得。GF的短的半衰期、热不稳定性、对蛋白酶的灵敏度和/或溶解度要求它们与载体组合施用，以满足该要求。
[0011]已经对用于GF递送的大量载体进行了评价。这些载体包括纤维胶原海绵，明胶水凝胶，纤维蛋白凝胶，肝素，反相聚合物(例如泊洛沙姆)，由聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)构成的支架，肝素接合的PLGA支架和无机材料(例如磷酸钙)。例如，用于牙周再生的生物植入物(GEM-21S? )使用β -磷酸三钙(β -TCP)作为rhroGF-BB的载体(参见 http: //www.0steohealth.com/GEM21S.aspx)。
[0012]然而，这些载体具有有限的有效性，这是由于当与载体结合时生长因子活性的损失，GF在植入部位无效率的释放，和/或对蛋白质水解和降解差的防护。例如，生物植入物Infuse?使用I型胶原海绵作为rhBMP-2的载体。rhBMP-2从载体突然释放，BMP在创伤部位内的半衰期为 I 至 3 天(Winn 等，1998, Adv.Drug Del.Rev.31:303 ；Friess 等，1999，Intl.J.Pharm.，187:91 )。到使骨再生的间充质干细胞已经迁移进入创伤部位的时候，仅装载的初始量百分比的BMP的一 部分存在以刺激这些细胞制造骨。目前用于确保在这之后的时间内保持有效水平的BMP的解决方案是明显地增加最初装载的BMP的量。这些增加的剂量增加并发症的风险，包括超越移植部位的骨形成、自身免疫应答和可能的癌症。另外，这急剧地增加了移植的成本。
[0013]因此，本领域中存在对以一定模式释放生长因子的材料和方法的需求，所述模式最小化需要装载以实现要求的治疗效果的生长因子的量。
[0014]一种策略是在生物可降解的聚合物基体中包封GF，所述生物可降解的聚合物基体以持续的释放模式释放GF许多天。例如，BMP已经与聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)组合以产生持续的释放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP能使BMP变性，降低其活性，并且难以控制释放模式以优化生物植入物的有效性。另外，这些载体的降解速率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。
[0015]另一种策略是将GF直接化学固定到载体上，保持其在移植部位。然而，这也可能导致部分或全部的GF活性的损失，并且限制GF活性使得仅直接与载体接触的那些细胞能够与 GF 相互作用并应答(参见 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials, 2006, 27:4547-56)，因为效果限于与载体的直接界面处而不遍及创伤部位，这是不期望的。
[0016]实际上，在创伤愈合期间，多重GF在不同的时间以变化的浓度存在于创伤部位和周围组织中。例如，骨折之后即刻，在受伤部位的血小板最初会在接下来的日子里在骨折部位内随着蛋白质水平的急剧下降释放大量的F1DGF (参见Tyndall等，ClinicalOrthopaedics and Related Research, 2003,408:319 - 330)。相反地，BMP-2 在骨折愈合过程的所有阶段表达(参见 Rasubala 等，British Journal of Oral and MaxillofacialSurgery, 2003, 41:173 - 178)。估计这些生长因子的浓度在低于外源性GF的治疗应用期间所使用的那些的数量级，这是由于浓度与细胞要求的匹配以及多重生长因子的协同效应。产生允许具有多相释放模式的生长因子的递送和具有不同的释放模式的多重生长因子的释放的系统将允许使用具有GF释放模式的生物植入物，所述GF释放模式比目前以突然释放或持续释放来释放单一生长因子的生物植入物更接近地模拟在自然愈合过程中的GF释放。
[0017]该背景信息是为了使本 申请人:认为的已知信息能够与本发明相关联而提供的。既不必意欲承认也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
【发明内容】
[0018]在一个方面，本发明提供一种用于至少一种生长因子在例如治疗部位的多相释放的系统、方法和 试剂盒。为此目的，本发明的系统可以提供为生物植入物等。在一个方面，本发明的方法以最初释放来递送至少一种生长因子，随后以“持续释放模式”递送至少一种生长因子。本发明利用一种用于最初释放的递送系统和一种用于持续释放的载体。
[0019]在一个方面，相同的生长因子以最初释放模式和持续释放模式进行释放。在一个方面，释放不同的生长因子，其中第一生长因子以最初模式释放，第二生长因子以持续释放模式释放。如会被本领域技术人员所知的，认为两种不同的生长因子以这种不同的方式的释放更接近地模拟在治疗部位自然的生长因子释放系统。
[0020]根据本发明的一个方面，提供一种提供至少一种生长因子的持续释放的载体，其与提供至少一种生长因子的最初释放的递送载剂组合。载体和递送载剂的组合产生生长因子的多相释放模式。
[0021]在优选实施方案中，生长因子(“GF”)是转化生长因子β (TGFii)总科的成员。在特别优选的实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白(BMP)。
[0022]在本发明的一个方面，载体(“CAR”)由分散在聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体进一步用羟磷灰石包覆。
[0023]在一个实施方案中，至少一种的生长因子以液态施用到钙颗粒，然后在与聚合物基体组合前被冻干到颗粒上。
[0024]在本发明的另一个方面，载体通过混合一种或更多种磷酸钙粉末与含有至少一种生长因子的液态溶液以产生磷酸钙粘合剂来形成。在一个方面，然后粘合剂被研磨成颗粒。
[0025]在优选实施方案中，递送载剂是反相聚合物。在特别优选的实施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具体地是泊洛沙姆407 (也叫做PluronicTMF127)。
[0026]如上文所指出的，在一个方面，载体和递送载剂适合于释放相同的生长因子，而在另一个方面，载体和递送载剂适合于释放不同的生长因子。在本发明的再一方面，载体和递送载剂各自适合于释放两种或更多种生长因子的组合，其中各自所释放的组合是相同或不同的。[0027]因此，在一个方面，本发明提供一种用于生长因子在治疗部位的多相释放的系统，所述系统包括:
[0028]-递送载剂，其包含至少一种第一生长因子；和
[0029]-载体，其包含至少一种第二生长因子；
[0030]-其中:
[0031]-所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式来释放至少一种第一生长因子;
[0032]-所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式来释放至少一种第二生长因子。
[0033]在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相释放的方法，所述方法包括:
[0034]-以最初释放模式来递送至少一种第一生长因子；
[0035]-以持续释放模式来递送至少一种第二生长因子。
[0036]在另外的方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0037]-递送载剂组分；
[0038]-与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0039]-载体组分；和
[0040]-与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]现在，将参考【专利附图】
【附图说明】本发明，所述附图在下文进行简单说明。
[0042]图1示出了本发明的载体所展现的持续释放模式。
[0043]图2示出了本发明的递送载剂所展现的最初释放模式。
[0044]图3示出了基于在递送载剂和载体中生长因子的量的不同的释放模式。当生长因子并入递送载剂和载体两者中时(50-50 )，观察多相释放模式。
[0045]图4示出了生物植入物的体内活性，其中生长因子根据本发明的方法如图3中所示进行释放。
[0046]图5示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物移植到小鼠中时，新骨(骨)在磷酸钙颗粒(CaP)上的形成。
[0047]图6示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物移植到小鼠中时，在载体(载体)上所形成的新骨(骨)的组织学外观。
[0048]图7示出了根据本发明的方法所制备的载体所产生的短持续的生长因子释放模式。
[0049]图8示出了持续释放模式如何能够通过改变根据本发明的方法所制备的载体的性能来进行变化。
【具体实施方式】
[0050]生长因子(GF)在组织的修复和再生中起着必不可少的作用，外源性GF可以用于刺激各种组织和器官的修复。为了使外源性生长因子在刺激修复中有效，它们必须保持在需要修复的部位，并防止失活、隔绝或降解。为此使用载体。然而，生长因子从这些载体的释放不理想，并且不能容易地改变。本发明基于生长因子从生物植入物的多相释放增加植入物的功效的发现。
[0051]本发明人已经发展了用于通过改善生长因子在移植部位的释放动力学或释放模式同时保持生长因子的活性来增强例如生物植入物的功效的方法和材料。在一个方面，本发明提供一种生长因子递送系统和方法，包括含有至少一种生长因子的载体，其与也含有至少一种生长因子的递送载剂组合。由载体和递送载剂所释放的至少一种生长因子可以是相同或不同的。
[0052]本发明的系统和方法能用于各种治疗和临床应用，包括骨折修复；骨移植；脊柱融合；以及头骨、下颌骨和骨缺损的再生。对于这些应用，本发明的系统优选提供在生物植入物上或以生物植入物的形式提供。
[0053]定义
[0054]除非下文另外定义，本文所使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。
[0055]如本所所用，术语“生物植入物”是指适合于移植的材料，并且含有外源性生长因子或生物活性因子。如本文进一步讨论的，本发明的系统优选通过对生物植入物施加所述物质来使用。然后在对象体内提供生物植入物，其中所述系统以多相释放模式释放至少一种生长因子。
[0056]如本文所用，术语“生长因子”是指通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β (TGFi3 )、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮细胞生长因子。在优选实施方案中，生长因子是BMP。
[0057]“重组的”表示由瞬时转染的、稳定转染的或转基因的宿主细胞或者由含有关于所述蛋白质的cDNA的表达结构所指示的动物所产生的蛋白质。术语“重组的”还包括这种多肽的药物可接受盐。
[0058]如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸单体的聚合物，其为通过酰胺键连接在一起的α氨基酸。因此，多肽的长度为至少两个氨基酸残基，并且通常更长。一般地，术语“肽”是指长度上仅有很少氨基酸残基的多肽。与肽相反，多肽可以包含任意数量的氨基酸残基。因此，术语多肽包括肽以及更长的氨基酸序列。
[0059]如本文所用，术语“骨形态发生蛋白”或“骨形态生成蛋白”或“BMP”可相互交换地使用，并且是指生长分化因子的转化生长因子β (TGFii)总科的骨形态发生蛋白(BMP)亚科的任何成员，包括BMP-2、ΒΜΡ-3 (也称作成骨素)、BMP_3b (也称作生长分化因子10，⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也称作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8 (也称作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10, BMP-1l (也称作生长分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生长抑制素)、BMP-12 (也称作生长分化因子_7，GDF-7)、BMP-13 (也称作生长分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也称作生长分化因子5，⑶F-5)和BMP-15。
[0060]术语“骨形态发生蛋白”和“BMP”还包括BMP的等位基因变异体、BMP的功能保守变异体和保持BMP活性的突变BMP。这种变异体和突变体的BMP活性可以通过本领域众所周知的任何方法(参见下文中测量BMP活性的分析的章节)或如实施例1所说明的进行确定。[0061]在优选实施方案中，BMP是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。在特别优选的实施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0062]在优选实施方案中，BMP是哺乳动物的BMP (例如哺乳动物的BMP-2或哺乳动物的BMP-7)。在特别优选的实施方案中，BMP是人类的BMP (hBMP)(例如hBMP_2或hBMP_7)。
[0063]如本文所用，术语“支架”是指其目的为提供支持细胞附着、迁移以及向内生长到组织修复部位内的结构的材料。
[0064]如本文所用，术语“载体”是指包含单一或多种组分的材料，并且适合于在一段时间内以“持续释放”模式在治疗部位释放至少一种生长因子。在一个方面，载体释放至少一种生长因子的时间段在几天和几周之间。优选地，载体适合于在几周的时间内释放至少一种生长因子。
[0065]在优选实施方案中，载体也可以用作支架或基体。如上所述，在本发明的一个方面，载体由分散在大孔的聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体进一步包覆有羟磷灰石层。在一个实施方案中，至少一种生长因子以液态施用到钙颗粒，然后在与聚合物基体组合前被冻干到颗粒上。
[0066]如本文所用，术语“递送载剂”是指包含或含有至少一种生长因子的材料，并且适合于在一段时间内以最初释放模式在治疗部位释放至少一种生产因子。在一个方面，形成递送载剂的材料为凝胶的形式。在一个方面，递送载剂释放至少一种生长因子的时间段在几小时和几天之间。在本发明的一个优选实施方案中，递送载剂以持续几小时时间的“最初释放”或“最初释放模式”释放大部分的至少一种生长因子。优选地，递送载剂适合于在72小时的时间内释放至少80%的其中所包含的(与其相关联的)生长因子。
[0067]在优选实施方案中，递送载剂是反相聚合物。如本文所用，术语“反相”是指凭借其聚合物进行从液体到凝胶的可逆温度依赖转变的性能。在一个方面，转变温度在15°C和37°C之间。优选地，转变温度在15°C和25°C之间。如本领域技术人员会知道的，“正相”材料随着温度降低其粘度增加。相反地，反相材料随着温度降低到其转变温度以下显示出粘度降低。
[0068]在特别优选的实施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具体地是Pluronic?F127(也叫做泊洛沙姆407)。
[0069]如本文所用，术语“持续释放”或“持续释放模式”是指在几天或几周的时间内通过载体的至少一种生长因子的释放，其中在最初时间段内释放的量相似于或低于移植的几天或几周后相同时间段内释放的量。优选地，持续释放模式持续至少一周。如本领域技术人员会理解的，一般地，在前三天内以持续释放模式释放的生长因子的量会低于在随后七天内释放的量。
[0070]如本文所用，术语“最初释放”或“最初释放模式”是指通过递送载剂的大量的至少一种生长因子的最初释放，然后在几小时或几天的时间段内释放逐渐降低的量。在一个方面，最初释放模式导致在大致72小时的时间内至少80%的装载的生长因子的递送。最初释放模式图示于图2中。
[0071]如本文所用，术语“多相释放”是指在最初释放时间段内至少一种生长因子的最初释放，然后在第二时间段内至少一种生长因子的“持续”释放。优选地，最初时间段是大致几个小时，第二时间段是大致几天到几周。这种释放模式还可以称为“双相释放”，这是由于其在两个阶段进行。在优选实施方案中，最初释放由本发明的递送系统提供，“持续”释放由本发明的载体提供。
[0072]在本发明的一个方面，递送载剂组分包含总量的至少10%并不超过50%的由本发明的系统递送的生长因子，载体组分包含总量的至少50%的由所述系统递送的生长因子。
[0073]测暈BMP活性的分析
[0074]对重组的BMP的体外和体内功能进行表征的分析在本领域是众所周知的(参见例如美国专利4，761,471号；美国专利4，789，732号；美国专利4，795, 804号；美国专利4，877，864号；美国专利5，013，649号；美国专利5，166,058号；美国专利5，618，924号；美国专利5,631, 142号；美国专利6，150，328号；美国专利6，593，109号；Clokie和Urist,Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ；19:3314-3324 ；Vallejo 等，J.Biotech.2002 ；94: 185-194 ；Peel 等，J.Craniofacial.Surg.2003 ； 14:284-291 ；以及 Hu 等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33)。
[0075]这种分析包括:对移植(例如植入后腿及臀部肌肉或胸的区域)入啮齿动物(例如大鼠或小鼠)后BMP的骨诱导活性进行定量的体内分析(参见例如美国专利4，761,471号；美国专利4，789，732号；美国专利4，795，804号；美国专利4，877，864号；美国专利5，013，649号；美国专利5，166,058号；美国专利5，618，924号；美国专利5,631, 142号；美国专利 6，150，328 号；美国专利 6，503，109 ；Kawai 和 Urist.,Clin.0rthop.Relat.Res.，1988 ；222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;以及 Hu等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33);对再生哺乳动物中头骨环锯缺损的BMP活性进行定量的体内分析(例如大鼠、狗或猴)(参见例如美国专利4，761，471号和美国专利4，789，732号)；对诱导体外培养的软骨细胞增殖的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利4，795，804号)；对诱导体外培养的肌肉细胞(例如C2C12细胞，ATCC编号CRL-1772)或骨髓基质细胞(例如鼠的W-20细胞，ATCC编号CRL-2623)中碱性磷酸酶活性的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利6, 593, 109号；Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302 ；Kirsch 等，EM`BO J，2000 ；19:3314-3324 ;Vallejo 等，J Biotech,2002；94:185-194 ;Peel 等,J Craniofacial Surg., 2003 ； 14:284-291 ;以及Hu等,Growth Factors,2004 ；22:29-33);对诱导培养的间质祖细胞系(例如鼠的C3H10T1-2细胞)中FGF-受体2(FGFR3)表达的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如Vallejo等，J Biotech2002 ；94:185-194);对诱导鸡枝芽细胞中蛋白多糖合成的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302);以及对诱导骨髓基质细胞(例如鼠的W-20细胞；ATCC编号CRL-2623)中骨钙素治疗的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利 6，593，109 号)。
[0076]测暈BMP结合与释放的分析
[0077]各种分析可以用于测量来自载体的重组BMP的结合与释放。例如，重组BMP蛋白质的量可以通过本领域中众所周知的任何技术进行定量，包括斑点印迹、免疫分析(例如酶联免疫吸附分析，ELISA)、当生物植入物包含放射标记的BMP时释放缓冲剂中出现的放射性增加的测量以及色谱法(例如高压液相色谱、HPLC和离子交换色谱)。
[0078]这类方法在本领域中是众所周知的(参见例如Harlow和Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press).1999 ;Gosling 编著，Immunoassays:A Practical Approach,牛津大学出版社(Oxford University Press).2000 ;01iver 编著，HPLC of Macromolecules:A Practical Approach.,牛津大学出版社，1998 ；Millner 编著，High ResolutionChromatography:A Practical Approach.牛津大学出版社，I999 ;Hockf ield 等，SelectedMethods for Antibody and Nucleic Acid Probes.冷泉港实验室出版社.1993 ；Gore 编著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry:A Practical Approach.牛津大学出版社，2000)。
[0079]例如已经描述了 BMP蛋白质的放射免疫实验分析的方案(参见例如美国专利4，857，456号)。例如已经描述了 BMP蛋白质的免疫印迹分析的方案(参见例如Wang等，ProcNatl Acad Sci USA1990 ;87:2220_2224)。例如用于人类、大鼠或小鼠BMP-2的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从R&D Systems(目录#DBP200、roBP200或SBP200)。例如用于人类BMP-7的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从 R&D Systems (目录#DY354 或 DY354E)。
_0] 试剂盒
[0081]在一个方面，本发明提供一种用于包含本文所描述系统的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含用于制造递送载剂和载体以及所需的生长因子的必需组分。即本发明的试剂盒会包含用于制造递送载剂和载体以及与递送载剂相关联的至少一种生长因子和与载体相关联的至少一种生长因子的必需组分。
[0082]优选地，递送载剂和相关联的生长因子保持在分开的容器中，待在使用时组合。这在递送载剂可以包括液体或凝胶的情况下会是特别优选的。在这种情况下，相关联的生长因子可以以冻干粉末保持在分开的容器中。在使用时，粉末形式的生长因子可以与液体或凝胶递送载剂组合。
[0083]试剂盒优选地包含·另外的包含载体的容器，相关联的生长因子可以装载或包覆到所述载体上。在一个实施方案中，载体材料还可以保持与相关联的生长因子分开。
[0084]在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包含至少三个容器用于以下的每一个:1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子(即与递送载剂相关联的生长因子)；和3)载体和至少一种第二生长因子(即与载体相关联的生长因子)。使用时，粉末形式的至少一种第二生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后混合物施用到载体，至少一种第二生长因子预装载到所述载体上。
[0085]在一个方面，本发明的试剂盒根据可能的需要可以包含任何必需的试剂和/或说明书和/或器皿。
[0086]实施例
[0087]现在，将通过以下实施例说明本发明。这些实施例说明了本发明人的新发现，即生长因子例如rhBMP-2的多相释放模式比仅产生突然释放或持续释放的载体更有效，所述多相释放模式通过在以持续释放来释放BMP的载体内装载部分的BMP和在以最初释放来释放BMP的递送载剂内装载部分的BMP而产生。
[0088]如会对本领域技术人员明显的，能够在载体内放置一种生长因子，在递送载剂内放置不同的生长因子，产生各生长因子不同的释放模式。
[0089]将会理解，本文所提供的实施例仅意欲说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。同样地，本发明不限于本文所描述的任何特别优选的实施方案。事实上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员可以是明显的。因此，本发明仅受所附的权利要求以及权利要求享有权利的等同物的完整范围限制。
[0090]实施例1:通过在PLGA中包封制造含有BMP的持续释放复合载体
[0091]该实施例示范如何形成含有rhBMP-2的载体，其以持续释放模式释放生长因子。
[0092]材料和方法
[0093]本征粘度为1.33dL/g 的 PLGA75/25 (MW=205000-210000)购自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四钙(TTCP)从 Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)获得，无水憐酸二钙(DCPA)和二甲亚讽(DMSO)从Taihei Chemical Industrial C0.(MO, USA)获得。糖颗粒购自 Tate&Lyle North America Inc.(多伦多，加拿大)。
[0094]可再吸收的磷酸钙颗粒通过在100%的相对湿度混合等摩尔的TTCP和DCPA与去离子蒸懼水(ddH20) 24小时进行制备。反应物进行研磨并通过45 y m的筛进行筛分。
[0095]重组的人类BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂(1.5mg/ml， pH4.5 ;5mm谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%鹿糖和0.01%Tween?80与ddH20)中进行制备。蛋白质溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并搅拌至少15分钟。然后，粉末进行冷冻并冻干。
[0096]然后，具有(CaP-BMP)或没有(CaP)BMP的颗粒用于通过如下的相转化/颗粒浙滤来制造CaP颗粒-PLGA支架块:将PLGA以11.5% (w/v)的浓度溶于DMSO。CaP和CaP-BMP 颗粒按照2:1的CaP/PLGA比例(w/w)彻底混合入该溶液。尺寸范围为0.85至1.18mm的糖晶体分散于CaP/PLGA中，混合物在_18°C下在模具中进行固化。PLGA沉淀，糖晶体通过三次更换ddH20浸洗来滤出。
[0097]—层羟磷灰石如下沉积到大孔复合支架上并遍及大孔复合支架:干燥的PLGA/ CaP圆柱，测量直径2mm和长2mm，在70%的乙醇中预湿润，并在37°C下浸入60ml的3XSBF 中9天时间。SBF如下制备:在剧烈搅拌下，向1.8L的ddH20中依次加入以下盐:29.711g NaCl, 2.206g CaCl2_2H20，IOmllM HCl, 0.852Na2HP04。最终体积达到 2L。每天更换 SBF 溶液。包覆之后，3PCC样品在ddH20中进行漂洗，并空气干燥。
[0098]这导致形成能够在至少七天内以持续释放模式释放rhBMP-2的大孔复合载体 (3PS)。这些结果图示于图1中。
[0099]实施例2:通过在磷酸钙粘合剂中包封制造含有BMP的持续释放载体
[0100]本实施例示范如何形成具有持续释放模式的包含rhBMP-2的磷酸钙粘合剂(CPC) 载体。
[0101]材料和方法
[0102]磷酸四钙(TTCP)从Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)获得,无水磷酸二IiiKDCPA)从Sigma Chemical Co获得。大孔双相磷酸|丐颗粒(Eclipse)购自Citagenix (Laval Qc,加拿大)。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂 (1.5mg/ml,pH4.5 ；5mm 谷氛酸，2.5% 甘氛酸,0.5% 鹿糖和 0.01%Tween?80 与 ddH20)中进行制备。
[0103]可再吸收的磷酸钙粘合剂颗粒通过混合等摩尔的TTCP和DCPA与rhBMP-2溶液来制备。反应物进行研磨，并通过300和100 u m的筛进行筛分，保留在100和300 u m之间的颗粒。[0104]这导致形成rhBMP-2并入其中的磷酸钙粘合剂载体颗粒。在移植入动物中后，BMP 在至少几周的时间内以持续的方式进行释放。[0105]为了生成也用作大孔支架的基于CPC的持续释放载体，CPC颗粒(0.1至0.3mm)与大孔磷酸钙颗粒(1至2mm)以1:1的比例(w/w)进行混合。_6] 实施例3:通过使用结合BMP的涂层制造含有BMP的持续释放载体[0107]本实施例示范如何通过应用结合BMP的涂层来形成具有持续释放模式的载体。一个这样的方法是如在我们的共同待决的申请号美国申请13/002，444号(其全部内容通过引用并入本文)中所述的用抗体或结合BMP的蛋白包覆支架。[0108]材料和方法[0109]纯净的多克隆兔抗人类BMP-2抗体购自Cell Sciences (Canton MA.,目录 #PA0025)o 大孔双相磷酸|丐(BCP)颗粒(Eclipse)购自 Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。[0110]在生物安全柜中称出无菌BCP颗粒，并置于无菌TPP管(Mandel Scientific, Guelph 0N，加拿大)中。抗体溶液在磷酸盐缓冲的盐水中稀释至最终浓度为Iml PBS中150、 300和600ng抗体,过滤灭菌,并以l:lv/v的比例应用到支架。在进行冷冻和冻干前，样品在室温下搅拌至少15分钟。然后，BMP溶液应用到颗粒，允许在室温下浸15分钟，然后进行冷冻和再冻干。[0111]这导致形成覆盖有结合并以持续方式缓慢释放rhBMP-2的抗体的BCP颗粒。[0112]能够结合的rhBMP-2的量能通过增加所用抗体的量来增加。释放的速率能够通过使用具有更低的亲和性和亲和力的抗体来增加。[0113]实施例4:俥用F127牛产含BMP的递送载剂[0114]本实施例示范如何使用F127制备含有rhBMP-2的递送载剂。[0115]材料和方法[0116]泊洛沙姆如下进行制备:100ml的蒸馏水冷却到4°C，随着搅拌在几个小时的时间内缓慢添加各种量的泊洛沙姆407，直到所有固体颗粒都溶解，使最终溶液在12和33%之间。然后，泊洛沙姆溶液在高压釜中进行灭菌(121°C，20分钟，30psi )。在灭菌后，泊洛沙姆溶液在4°C下保存直到使用。[0117]冻干的重组人类BMP-2粉末(rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆溶液，并缓慢地混合。[0118]或者，rhBMP-2以 1/10 或 1/20 的比例(v/v)从溶液(lmg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%吐温80)添加。[0119]这导致形成在前两天释放超过80%的rhBMP-2的递送载剂(如图2中所示)。[0120]实施例5:具有多相释放模式的生物植入物的生产[0121]本实施例示范如何形成以多相释放模式来释放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。[0122]材料和方法[0123]制备每5mg载体含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的3PS载体(如实施例1所述)， 并储存于Eppendorf管中。在45.5 的F127中含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的递送载剂(如实施例4所述制备的)在4°C储存于Eppendorf管中。紧接着使用之前，F127移液到3PS载体上，并且载体混合到递送载剂中。[0124]然后，该3PS-F127生物植入物如下文所述用于测量体外BMP释放以及体内骨形成活性。
[0125]载体与递送载剂的比例能够变化以产生凝胶(1:1比例v:v)或油灰(2:1比例 v:v)0另外，BMP与载体的比例或载体的颗粒尺寸能够变化以改变持续释放模式。最终，载体和递送载剂中rhBMP-2的量能够变化以改变与之后几周释放的量相比在前几个小时最初释放的rhBMP-2的量。
[0126]实施例6:来自牛物棺入物的BMP释放的体外分析。
[0127]本实施例描述了如何测量来自实施例1至5中所述的各种生物植入物的rhBMP-2 的释放。
[0128]材料&方法
[0129]如实施例1至5中所制备的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物转移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的总量为相对于每5mg载体以及45.5 的F127的9.1 y g 的rhBMP-2，或者相对于每IOmg载体以及100 U I的F127的20 y g的rhBMP-2。
[0130]然后，样品在37°C在搅拌下利用Iml包含磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)+1%BSA的释放缓冲溶液进行培养。在不同时期(例如1、2、5、7和10天)后，缓冲剂被移除，并替换为新鲜的释放缓冲剂，并且收集的溶液在_20°C下储存于1.5ml的小瓶中用于进一步的分析。
[0131]使用商业的ELISA (Quantikine?hBMP-2ELISA, RnD Systems)测量释放到缓冲剂中的BMP-2的量。ELISA根 据制造商的说明来实施。
[0132]益果
[0133]在从任何未装载BMP的生物植入物中所收集的释放缓冲剂中没有可以检测到的 BMP。已经装载rhBMP-2的载体样品证实在研究期间持续释放rhBMP-2，而单独的递送载剂中的样品以“最初释放模式”进行释放。
[0134]当载体和递送载剂组合时，根据BMP装载入的组分获得各种释放模式。当100%的 rhBMP-2 (9.1iig)装载在之后与33%的F127 (45.5 yl)混合的3PS (5mg)载体内时，BMP 释放模式与持续形式匹配，其中在前两天释放的BMP的量为5ng，在3天和5天之间其为 8ng，在5天和7天之间其为IOng (图3 ; 100-0)。
[0135]当100%的rhBMP-2 (9.1 u g)装载在33%的F127 (45.5 yl)内，然后与其中没有 BMP的3PS载体(5mg)混合时，BMP被释放，其中释放的BMP的量在第一天为2363ng，在第二天为381ng，然后在第三天为12ng (图3 ;0_100)。
[0136]当BMP分布在载体和递送载剂之间时，生物植入物证实双相释放模式，其中在中等最初释放之后是BMP的持续释放(图3 ;50-50)。
[0137]实施例7:测试释放的BMP的活性的体外分析。
[0138]本实施例描述了如何确定从生物植入物释放的rhBMP-2是否保持其活性。为了证实释放的rhBMP是生物活性的，应答细胞可以利用释放物来培养，并测量其对生长因子的应答。这种分析在本领域中是已知的(参见Peel等，J.Craniofac.Surg.2003,14: 284-291)。
[0139]材料&方法
[0140]制备如实施例1至5中所述的具有或没有rhBMP-2的材料。释放物如实施例3中所述进行制备，除了缓冲剂是a最小必需培养基与15%的胎牛血清和抗体(a MEM+15%FBS+AB)0
[0141]C2C12细胞以0.5X IO5细胞/ml、lml a MEM+15%FBS每孔接种到24孔组织培养板中。在24和72小时之间的各种时期后，除去培养基并应用各种释放物。阴性对照包括利用新鲜的a MEM+15%FBS+AB培养的C2C12细胞。阳性对照包括利用含有25、50和IOOng/ ml的rhBMP-2的a MEM+15%FBS+AB培养的C2C12细胞。48小时后，细胞在Iml细胞溶解缓冲剂(Cellytic Sigma Aldrich)中溶解,使用对硝基苯酹磷酸酯分析物(Sigma Aldrich) 测量细胞溶解物的碱性磷酸酶(ALP)活性。溶解物的细胞蛋白含量使用Coomassie Plus Reagent (Fisher)进行测量,并用于使ALP活性对每孔的细胞数归一化。
[0142]一般地，为了确定是否在与载体或递送载剂相结合时已经有BMP活性的任何损失，确定未与载体或递送载剂相结合的rhBMP-2标准物的ALP/PTN结果的标准活性曲线。释放物中活性rhBMP-2的浓度可以从该标准曲线进行确定，其表达为如通过ELISA测定的释放物中存在的rhBMP-2总量的百分比。
[0143]实施例8:多相BMP植入物的骨诱导活性的评价
[0144]本实施例描述了如何体内测定含有BMP的生物植入物的骨诱导活性。为了评价生物植入物诱导骨形成的活性，使用小鼠肌肉囊分析。在该模型中，生物植入物置于在小鼠后肢中制造的肌肉囊中，形成的诱导骨的尺寸与试验的BMP的量成比例。这种分析在本领域是已知的(参见如 Barr 等，Oral Surg.0ral Med.0ral Pathol.0ral Radiol.Endod., 2010 ；109:531-40)。
[0145]材料和方法
[0146]生物植入物如实施例1和5中所述进行制备。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶_1 小鼠的后肢的大腿肌肉中通过钝器解剖制造双侧的囊。然后，生物植入物置入已经置入肌肉囊的无菌胶囊中。将肌肉拉到一起，用Mitchel夹使皮肤闭合。
[0147]动物在术后第28天进行安乐死。收获后肢，并用10%缓冲的福尔马林进行固定。 固定之后,试样使用微 CT 扫描仪(General Electric Healthcare eXplore?Locus SP)进行成像。扫描样品，并使用制造商软件在59 的分辨率下重构。图像重构之后，确定感兴趣的区域(R0I)。该区域包括含有生物植入物诱导的骨的所有区域。根据位置和密度这些可以简单地与骨骼骨进行区分。
[0148]为了分析ROI内的骨的数量和质量，mCT图像的体素区分为骨和非骨的相。区分通过确定体素灰度的阈值来实现，在所述阈值体素视为骨。对每个样品测定ROI的总体积 (TV)、骨体积(BV)、总体积的矿物密度(TV-MD )、骨体积的矿物密度(BV-MD )、总体积的矿物含量(TV-MC)、骨体积的矿物含量(BV-MC)和骨体积分数(BVF)。对于由于载体引起的钙的存在，通过使用仅选择载体的上阈值并将其从使用包括载体加新骨的下阈值获得的数值中扣除来调整数值(参见 Humber 等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology.2010.109:372_384)。
[0149]在微CT分析完成之后，试样或者嵌入spurs树脂，或者在甲酸中脱钙并嵌入蜡中。 嵌入树脂的样品通过背散射SEM进行评价，而嵌入蜡的样品进行切割并利用苏木精和曙红 (H&E)进行染色，并通过光学显微镜进行检查，以评价移植部位存在的组织类型。
[0150]益果
[0151]载体和递送载剂如实施例5所述进行组合。[0152]微CT分析显示，所有BMP都在3PS载体内的生物植入物产生最小的骨的小骨，所述生物植入物具有持续BMP释放模式(图4:100-0)，所有BMP都在F127递送载剂内的生物植入物产生中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP释放模式(图4:0-100)，而 50%BMP装载入载体并且50%装载入递送载剂的生物植入物产生最大的骨的小骨，所述生物植入物具有多相BMP释放模式(图4:50-50)。
[0153]背散射SEM显示，到28天时骨遍及生物植入物形成以及形成到已经并入PLGA的磷酸钙颗粒上(图5)。组织学确认所形成的组织是骨(图6)。
[0154]实施例9:来自生物植入物的BMP释放的活体分析
[0155]本实施例描述了如何测量移植后从实施例1、2、3、4或5中所述的各种生物植入物到动物中的rhBMP-2的释放。做到此的方法在本领域是众所周知的。例如参见Uludag等， J Biomed Mater Res，46，193 - 202，1999。
[0156]材料&方法
[0157]重组的hBMP-2通过珀金埃尔默(Perkin Elmer)用碘125 (1-125)进行放射性标记。放射性标记的rhBMP-2 (强放射性的)与未标记的rhBMP-2 (无放射性的)混合，以产生 I: 100的强放射性的无放射性的混合物。
[0158]含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如实施例1至5中进行制备。然后，这些生物植入物如实施例8中所述移植到动物中。在各个时间段，牺牲动物并切出植入物部位。然后对切出的组织称重，放射性的量使用Y计数器进行测定。
[0159]为了确定计数是否与蛋白质相关，组织在0.5ml PBS+0.5%BSA中均匀化。两ml冰冷的10%三氯乙酸加入匀浆中，然后在4°C保持至少I小时。然后，离心匀浆，并移除上层清液。然后，沉淀物的放射性使用Y计数器进行测量。
[0160]与植入物相关的放射性对衰减进行校正，估计保持在植入物中的BMP的总量。
[0161]实施例10:具有短持续释放模式的载体的生产
`[0162]本实施例描述了生产以短持续释放模式来释放生长因子的载体的手段。
[0163]材料&方法
[0164]大孔双相磷酸钙(BCP)颗粒(Eclipse)购自Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂(1.5mg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%Tween?80与ddH20)中进行制备。
[0165]无菌的rhBMP-2溶液在摇动下以9.1 ii g每5mg或4.55 ii g每5mg (BMP每BCP) 的比例利用无菌BCP颗粒培养15分钟。然后，样品进行冷冻并无菌冻干。
[0166]冻干之后,载体称为5mg的等分部分,并置于无菌的epindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45.5 yl)。然后，BMP释放模式如实施例6中所述进行测定。
[0167]MS
[0168]未用F127包覆的载体(BCP)显示突然释放模式，其中在第一天释放大量BMP，然后在每一之后的时间点释放减少量的BMP。在F127内混合BCP (BCP-Pol)产生短期的持续释放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (图7)。
[0169]实施例11:改变载体的持续释放模式
[0170]本实施例描述改变载体的释放模式的手段。
[0171]材料&方法[0172]具有不同本征粘度和分子量的PLGA购自Birmingham Polymers Inc.(Birmingham, AL)。然后,载体如实施例1所述使用这些PLGA来制造。这些载体的BMP释放模式根据实施例6的方法进行测定。
[0173]结果
[0174]所有载体产生持续释放模式。然而，释放的BMP的量根据所用PLGA的粘度/分子量而不同。以低粘度PLGA(Pol-1)制造的载体在研究期间的12周内比使用高粘度(Pol-2) PLGA的那些释放更多的rhBMP-2 (图8)。
【权利要求】
1.一种用于生长因子在治疗部位的多相释放的系统，所述系统包括: -递送载剂，其包含至少一种第一生长因子；和 -载体，其包含至少一种第二生长因子； -其中: -所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放所述至少一种第一生长因子; -所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放所述至少一种第二生长因子。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述递送载剂包括聚合物。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述载体包括分散在聚合物基体内的多个颗粒，并且其中所述颗粒在其表面上含有所述至少一种第二生长因子。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述颗粒包括磷酸钙颗粒。
8.根据权利要求6或7所述的系统，其中所述聚合物基体包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的系统，其中所述第一时间段包括数小时或数天。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的系统，其中所述第二时间段包括数天或数周。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的系统，其中所述递送载剂递送总量的至少10%的所述生长因子，所述载体递送总量的至少50%的所述生长因子。
18.一种包括根据权利要求1至17中任一项所述的生长因子释放系统的生物植入物。
19.一种生长因子的多相释放的方法，所述方法包括: -以最初释放模式递送至少一种第一生长因子； -以持续释放模式递送至少一种第二生长因子。
20.根据权 利要求19所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子由递送载剂递送，所述至少一种第二生长因子由载体递送。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述递送载剂递送总量的至少10%的所述生长因子，所述载体递送总量的至少50%的所述生长因子。
28.一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包括: -递送载剂组分； -与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子； -载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述递送载剂和所述载体组分在分开的容器中。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述递送载剂和所述至少一种第一生长因子提供在分开的容器中。
31.根据权利要求28至30所述的试剂盒，其中所述载体和所述至少一种第二生长因子在单个容器中组合，并且其中所述至少一种第二生长因子装载或包覆在所述载体组分上。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述递送载剂包括聚合物。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
36.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述载体包括分散在聚合物基体内的多个颗粒，并且其中所述颗粒含有在其表面上的所述至少一种第二生长因子。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述颗粒包括磷酸钙颗粒。
38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其中所述聚合物基体包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
40.根据权利要求28至38中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是BMP。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
45.根据权利要求28至44中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子包括总量的至少10%的提供于所述试剂盒中的生长因子，所述至少一种第二生长因子包括总量的至少50%的提供于所述试 剂盒中的生长因子。
【文档编号】A61K38/18GK103596553SQ201280017716
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月11日 优先权日:2011年4月11日
【发明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申请人:感应生物制品股份有限公司
【专利摘要】一种用于至少一种生长因子在治疗部位的多相递送的系统，包括用于以最初释放模式来释放至少一种生长因子的递送载剂，和用于以持续释放模式来释放至少一种生长因子的载体。最初释放模式在数小时至数天的时间内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子最初大量释放，剩余物以逐渐降低的量释放。持续释放模式在数天至数周的时间内释放至少一种生长因子，其中所述生长因子在这样的时间段内以通常恒定的量进行释放。本发明的系统特别适合于对生物植入物的应用。本发明还包括用于至少一种生长因子的多相递送的方法和试剂盒。
【专利说明】用于生长因子的多相释放的系统和方法
[0001]在先申请的交叉引用
[0002]该申请根据巴黎公约要求2011年4月11日提交的美国申请61/474，049号的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及用于释放生物物质的系统和方法。具体地，本发明涉及与生物植入物相关的生长因子的释放。更具体地，本发明提供一种用于产生至少一种生长因子的多相释放模式以改善生物植入物的性能的系统和方法。
【背景技术】
[0004]生长因子(GF)是通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子在组织的修复和再生中起着必不可少的作用，GF的外源性应用可以用于刺激各种组织和器官的修复，所述组织和器官包括骨、软骨、皮肤和粘膜，以及用于通过在修复部位的血管再生的刺激增强组织的修复。[0005]哺乳动物中分泌的生长和分化因子的转化生长因子β (TGF β )总科有超过30个成员。这些二聚蛋白质的特征在于保守的七胱氨酸结基结构。它们调节许多细胞种类的增殖、分化和迁移，并在形态发生、器官发生、组织维护和创伤愈合方面具有重要作用。生长因子的TGFii总科可以细分为几个亚科，包括转化生长因子β亚科、骨形态发生蛋白(BMP)和生长分化因子(⑶F)科(也叫做BMP亚科)，以及抑制素和激活素亚科。
[0006]TGF β总科的BMP亚科包含至少二十种蛋白质，包括ΒΜΡ_2、ΒΜΡ-3 (也称作成骨素)、BMP-3b (也称作生长分化因子10，ffl)F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也称作成骨蛋白-1，0Ρ-1)、ΒΜΡ-8 (也称作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-1I (也称作生长分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生长抑制素)、BMP-12 (也称作生长分化因子_7，OTF-7)、BMP_13(也称作生长分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也称作生长分化因子5，⑶F-5)和BMP-15 (关于综述，参见例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs2001 ; 10:1677-1686)。
[0007]BMP已经显示出在成软骨细胞中刺激基质合成；在成骨细胞中刺激碱性磷酸酶活性和胶原蛋白合成，诱导早期间质祖细胞分化为成骨细胞(骨诱导)，调节单核细胞和间质细胞的趋化性，以及调节神经细胞的分化(关于综述，参见例如Azari等，Expert OpinInvest Drugs2001 ；10: 1677-1686 和 Hoffman 等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ；57:294-308)。
[0008]BMP蛋白质的许多功能之一是在脊椎动物中诱导软骨、骨和结缔组织的形成。BMP总科的最具有骨诱导能力的成员是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (参见例如Hoffman等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ;57_294_308 ;Yeh等,J Cellular Biochem.，2005:95-173-188 ;和 Boden，0rthopaedicNursing2005, 24:49_52)。已经长期认为 BMP 的该骨诱导的能力对于各种治疗和临床应用非常有希望，所述治疗和临床应用包括骨折修复；脊柱融合；骨骼疾病的治疗，头骨、下颌骨和骨缺损的再生；以及在口腔和牙科应用中，例如在牙周创伤再生期间的牙齿发生和牙骨质发生中，拔牙窝移植、牙槽嵴增高和上颌窦增高。目前，由美敦力(Medtronic)以INFUSE?销售的重组人类BMP-2被FDA批准用于脊柱融合手术，用于骨折不愈合的修复以及用于口腔手术，而由史赛克(Stryker)以OP-1?销售的重组人类BMP-7被批准作为顽固的长骨不愈合中自体移植的替代，以及用于翻修后外侧腰椎融合，其中自体移植和骨髓收获是不可行的，或者预期不会促进融合。
[0009]已经外源地用于增强骨修复的其他重组生长因子包括各种TGFP (参见Clokie&Bell, J.Craniofacial Surg.2003，14:268_77)、成纤维细胞生长因子总科(FGF)的成员(参见 Kawaguchi 等，(2007) J.0rthopaedic Res.25 (4):480_487)、血小板衍生的生长因子总科(PDGF)的成员(参见Hollinger等，2008JBJS90 (si):48-54)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)(参见 Street 等，2002PNAS99:9656-61 )。
[0010]为了使这些生长因子有效，当在修复部位存在适当的应答细胞的临界密度时，它们必须是活性的并且同时以足够的浓度可得。GF的短的半衰期、热不稳定性、对蛋白酶的灵敏度和/或溶解度要求它们与载体组合施用，以满足该要求。
[0011]已经对用于GF递送的大量载体进行了评价。这些载体包括纤维胶原海绵，明胶水凝胶，纤维蛋白凝胶，肝素，反相聚合物(例如泊洛沙姆)，由聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)构成的支架，肝素接合的PLGA支架和无机材料(例如磷酸钙)。例如，用于牙周再生的生物植入物(GEM-21S? )使用β -磷酸三钙(β -TCP)作为rhroGF-BB的载体(参见 http: //www.0steohealth.com/GEM21S.aspx)。
[0012]然而，这些载体具有有限的有效性，这是由于当与载体结合时生长因子活性的损失，GF在植入部位无效率的释放，和/或对蛋白质水解和降解差的防护。例如，生物植入物Infuse?使用I型胶原海绵作为rhBMP-2的载体。rhBMP-2从载体突然释放，BMP在创伤部位内的半衰期为 I 至 3 天(Winn 等，1998, Adv.Drug Del.Rev.31:303 ；Friess 等，1999，Intl.J.Pharm.，187:91 )。到使骨再生的间充质干细胞已经迁移进入创伤部位的时候，仅装载的初始量百分比的BMP的一 部分存在以刺激这些细胞制造骨。目前用于确保在这之后的时间内保持有效水平的BMP的解决方案是明显地增加最初装载的BMP的量。这些增加的剂量增加并发症的风险，包括超越移植部位的骨形成、自身免疫应答和可能的癌症。另外，这急剧地增加了移植的成本。
[0013]因此，本领域中存在对以一定模式释放生长因子的材料和方法的需求，所述模式最小化需要装载以实现要求的治疗效果的生长因子的量。
[0014]一种策略是在生物可降解的聚合物基体中包封GF，所述生物可降解的聚合物基体以持续的释放模式释放GF许多天。例如，BMP已经与聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)组合以产生持续的释放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP能使BMP变性，降低其活性，并且难以控制释放模式以优化生物植入物的有效性。另外，这些载体的降解速率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。
[0015]另一种策略是将GF直接化学固定到载体上，保持其在移植部位。然而，这也可能导致部分或全部的GF活性的损失，并且限制GF活性使得仅直接与载体接触的那些细胞能够与 GF 相互作用并应答(参见 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials, 2006, 27:4547-56)，因为效果限于与载体的直接界面处而不遍及创伤部位，这是不期望的。
[0016]实际上，在创伤愈合期间，多重GF在不同的时间以变化的浓度存在于创伤部位和周围组织中。例如，骨折之后即刻，在受伤部位的血小板最初会在接下来的日子里在骨折部位内随着蛋白质水平的急剧下降释放大量的F1DGF (参见Tyndall等，ClinicalOrthopaedics and Related Research, 2003,408:319 - 330)。相反地，BMP-2 在骨折愈合过程的所有阶段表达(参见 Rasubala 等，British Journal of Oral and MaxillofacialSurgery, 2003, 41:173 - 178)。估计这些生长因子的浓度在低于外源性GF的治疗应用期间所使用的那些的数量级，这是由于浓度与细胞要求的匹配以及多重生长因子的协同效应。产生允许具有多相释放模式的生长因子的递送和具有不同的释放模式的多重生长因子的释放的系统将允许使用具有GF释放模式的生物植入物，所述GF释放模式比目前以突然释放或持续释放来释放单一生长因子的生物植入物更接近地模拟在自然愈合过程中的GF释放。
[0017]该背景信息是为了使本 申请人:认为的已知信息能够与本发明相关联而提供的。既不必意欲承认也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
【发明内容】
[0018]在一个方面，本发明提供一种用于至少一种生长因子在例如治疗部位的多相释放的系统、方法和 试剂盒。为此目的，本发明的系统可以提供为生物植入物等。在一个方面，本发明的方法以最初释放来递送至少一种生长因子，随后以“持续释放模式”递送至少一种生长因子。本发明利用一种用于最初释放的递送系统和一种用于持续释放的载体。
[0019]在一个方面，相同的生长因子以最初释放模式和持续释放模式进行释放。在一个方面，释放不同的生长因子，其中第一生长因子以最初模式释放，第二生长因子以持续释放模式释放。如会被本领域技术人员所知的，认为两种不同的生长因子以这种不同的方式的释放更接近地模拟在治疗部位自然的生长因子释放系统。
[0020]根据本发明的一个方面，提供一种提供至少一种生长因子的持续释放的载体，其与提供至少一种生长因子的最初释放的递送载剂组合。载体和递送载剂的组合产生生长因子的多相释放模式。
[0021]在优选实施方案中，生长因子(“GF”)是转化生长因子β (TGFii)总科的成员。在特别优选的实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白(BMP)。
[0022]在本发明的一个方面，载体(“CAR”)由分散在聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体进一步用羟磷灰石包覆。
[0023]在一个实施方案中，至少一种的生长因子以液态施用到钙颗粒，然后在与聚合物基体组合前被冻干到颗粒上。
[0024]在本发明的另一个方面，载体通过混合一种或更多种磷酸钙粉末与含有至少一种生长因子的液态溶液以产生磷酸钙粘合剂来形成。在一个方面，然后粘合剂被研磨成颗粒。
[0025]在优选实施方案中，递送载剂是反相聚合物。在特别优选的实施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具体地是泊洛沙姆407 (也叫做PluronicTMF127)。
[0026]如上文所指出的，在一个方面，载体和递送载剂适合于释放相同的生长因子，而在另一个方面，载体和递送载剂适合于释放不同的生长因子。在本发明的再一方面，载体和递送载剂各自适合于释放两种或更多种生长因子的组合，其中各自所释放的组合是相同或不同的。[0027]因此，在一个方面，本发明提供一种用于生长因子在治疗部位的多相释放的系统，所述系统包括:
[0028]-递送载剂，其包含至少一种第一生长因子；和
[0029]-载体，其包含至少一种第二生长因子；
[0030]-其中:
[0031]-所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式来释放至少一种第一生长因子;
[0032]-所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式来释放至少一种第二生长因子。
[0033]在另一方面，本发明提供一种用于生长因子的多相释放的方法，所述方法包括:
[0034]-以最初释放模式来递送至少一种第一生长因子；
[0035]-以持续释放模式来递送至少一种第二生长因子。
[0036]在另外的方面，本发明提供一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0037]-递送载剂组分；
[0038]-与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子；
[0039]-载体组分；和
[0040]-与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]现在，将参考【专利附图】
【附图说明】本发明，所述附图在下文进行简单说明。
[0042]图1示出了本发明的载体所展现的持续释放模式。
[0043]图2示出了本发明的递送载剂所展现的最初释放模式。
[0044]图3示出了基于在递送载剂和载体中生长因子的量的不同的释放模式。当生长因子并入递送载剂和载体两者中时(50-50 )，观察多相释放模式。
[0045]图4示出了生物植入物的体内活性，其中生长因子根据本发明的方法如图3中所示进行释放。
[0046]图5示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物移植到小鼠中时，新骨(骨)在磷酸钙颗粒(CaP)上的形成。
[0047]图6示出了当根据本发明的方法所制备的生物植入物移植到小鼠中时，在载体(载体)上所形成的新骨(骨)的组织学外观。
[0048]图7示出了根据本发明的方法所制备的载体所产生的短持续的生长因子释放模式。
[0049]图8示出了持续释放模式如何能够通过改变根据本发明的方法所制备的载体的性能来进行变化。
【具体实施方式】
[0050]生长因子(GF)在组织的修复和再生中起着必不可少的作用，外源性GF可以用于刺激各种组织和器官的修复。为了使外源性生长因子在刺激修复中有效，它们必须保持在需要修复的部位，并防止失活、隔绝或降解。为此使用载体。然而，生长因子从这些载体的释放不理想，并且不能容易地改变。本发明基于生长因子从生物植入物的多相释放增加植入物的功效的发现。
[0051]本发明人已经发展了用于通过改善生长因子在移植部位的释放动力学或释放模式同时保持生长因子的活性来增强例如生物植入物的功效的方法和材料。在一个方面，本发明提供一种生长因子递送系统和方法，包括含有至少一种生长因子的载体，其与也含有至少一种生长因子的递送载剂组合。由载体和递送载剂所释放的至少一种生长因子可以是相同或不同的。
[0052]本发明的系统和方法能用于各种治疗和临床应用，包括骨折修复；骨移植；脊柱融合；以及头骨、下颌骨和骨缺损的再生。对于这些应用，本发明的系统优选提供在生物植入物上或以生物植入物的形式提供。
[0053]定义
[0054]除非下文另外定义，本文所使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。
[0055]如本所所用，术语“生物植入物”是指适合于移植的材料，并且含有外源性生长因子或生物活性因子。如本文进一步讨论的，本发明的系统优选通过对生物植入物施加所述物质来使用。然后在对象体内提供生物植入物，其中所述系统以多相释放模式释放至少一种生长因子。
[0056]如本文所用，术语“生长因子”是指通过GF与特定细胞表面受体的相互作用来刺激细胞的生长和/或分化的肽和蛋白质。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β (TGFi3 )、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮细胞生长因子。在优选实施方案中，生长因子是BMP。
[0057]“重组的”表示由瞬时转染的、稳定转染的或转基因的宿主细胞或者由含有关于所述蛋白质的cDNA的表达结构所指示的动物所产生的蛋白质。术语“重组的”还包括这种多肽的药物可接受盐。
[0058]如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸单体的聚合物，其为通过酰胺键连接在一起的α氨基酸。因此，多肽的长度为至少两个氨基酸残基，并且通常更长。一般地，术语“肽”是指长度上仅有很少氨基酸残基的多肽。与肽相反，多肽可以包含任意数量的氨基酸残基。因此，术语多肽包括肽以及更长的氨基酸序列。
[0059]如本文所用，术语“骨形态发生蛋白”或“骨形态生成蛋白”或“BMP”可相互交换地使用，并且是指生长分化因子的转化生长因子β (TGFii)总科的骨形态发生蛋白(BMP)亚科的任何成员，包括BMP-2、ΒΜΡ-3 (也称作成骨素)、BMP_3b (也称作生长分化因子10，⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也称作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8 (也称作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10, BMP-1l (也称作生长分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生长抑制素)、BMP-12 (也称作生长分化因子_7，GDF-7)、BMP-13 (也称作生长分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也称作生长分化因子5，⑶F-5)和BMP-15。
[0060]术语“骨形态发生蛋白”和“BMP”还包括BMP的等位基因变异体、BMP的功能保守变异体和保持BMP活性的突变BMP。这种变异体和突变体的BMP活性可以通过本领域众所周知的任何方法(参见下文中测量BMP活性的分析的章节)或如实施例1所说明的进行确定。[0061]在优选实施方案中，BMP是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。在特别优选的实施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0062]在优选实施方案中，BMP是哺乳动物的BMP (例如哺乳动物的BMP-2或哺乳动物的BMP-7)。在特别优选的实施方案中，BMP是人类的BMP (hBMP)(例如hBMP_2或hBMP_7)。
[0063]如本文所用，术语“支架”是指其目的为提供支持细胞附着、迁移以及向内生长到组织修复部位内的结构的材料。
[0064]如本文所用，术语“载体”是指包含单一或多种组分的材料，并且适合于在一段时间内以“持续释放”模式在治疗部位释放至少一种生长因子。在一个方面，载体释放至少一种生长因子的时间段在几天和几周之间。优选地，载体适合于在几周的时间内释放至少一种生长因子。
[0065]在优选实施方案中，载体也可以用作支架或基体。如上所述，在本发明的一个方面，载体由分散在大孔的聚合物支架或基体内的磷酸钙颗粒形成。在一个方面，支架或基体进一步包覆有羟磷灰石层。在一个实施方案中，至少一种生长因子以液态施用到钙颗粒，然后在与聚合物基体组合前被冻干到颗粒上。
[0066]如本文所用，术语“递送载剂”是指包含或含有至少一种生长因子的材料，并且适合于在一段时间内以最初释放模式在治疗部位释放至少一种生产因子。在一个方面，形成递送载剂的材料为凝胶的形式。在一个方面，递送载剂释放至少一种生长因子的时间段在几小时和几天之间。在本发明的一个优选实施方案中，递送载剂以持续几小时时间的“最初释放”或“最初释放模式”释放大部分的至少一种生长因子。优选地，递送载剂适合于在72小时的时间内释放至少80%的其中所包含的(与其相关联的)生长因子。
[0067]在优选实施方案中，递送载剂是反相聚合物。如本文所用，术语“反相”是指凭借其聚合物进行从液体到凝胶的可逆温度依赖转变的性能。在一个方面，转变温度在15°C和37°C之间。优选地，转变温度在15°C和25°C之间。如本领域技术人员会知道的，“正相”材料随着温度降低其粘度增加。相反地，反相材料随着温度降低到其转变温度以下显示出粘度降低。
[0068]在特别优选的实施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具体地是Pluronic?F127(也叫做泊洛沙姆407)。
[0069]如本文所用，术语“持续释放”或“持续释放模式”是指在几天或几周的时间内通过载体的至少一种生长因子的释放，其中在最初时间段内释放的量相似于或低于移植的几天或几周后相同时间段内释放的量。优选地，持续释放模式持续至少一周。如本领域技术人员会理解的，一般地，在前三天内以持续释放模式释放的生长因子的量会低于在随后七天内释放的量。
[0070]如本文所用，术语“最初释放”或“最初释放模式”是指通过递送载剂的大量的至少一种生长因子的最初释放，然后在几小时或几天的时间段内释放逐渐降低的量。在一个方面，最初释放模式导致在大致72小时的时间内至少80%的装载的生长因子的递送。最初释放模式图示于图2中。
[0071]如本文所用，术语“多相释放”是指在最初释放时间段内至少一种生长因子的最初释放，然后在第二时间段内至少一种生长因子的“持续”释放。优选地，最初时间段是大致几个小时，第二时间段是大致几天到几周。这种释放模式还可以称为“双相释放”，这是由于其在两个阶段进行。在优选实施方案中，最初释放由本发明的递送系统提供，“持续”释放由本发明的载体提供。
[0072]在本发明的一个方面，递送载剂组分包含总量的至少10%并不超过50%的由本发明的系统递送的生长因子，载体组分包含总量的至少50%的由所述系统递送的生长因子。
[0073]测暈BMP活性的分析
[0074]对重组的BMP的体外和体内功能进行表征的分析在本领域是众所周知的(参见例如美国专利4，761,471号；美国专利4，789，732号；美国专利4，795, 804号；美国专利4，877，864号；美国专利5，013，649号；美国专利5，166,058号；美国专利5，618，924号；美国专利5,631, 142号；美国专利6，150，328号；美国专利6，593，109号；Clokie和Urist,Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ；19:3314-3324 ；Vallejo 等，J.Biotech.2002 ；94: 185-194 ；Peel 等，J.Craniofacial.Surg.2003 ； 14:284-291 ；以及 Hu 等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33)。
[0075]这种分析包括:对移植(例如植入后腿及臀部肌肉或胸的区域)入啮齿动物(例如大鼠或小鼠)后BMP的骨诱导活性进行定量的体内分析(参见例如美国专利4，761,471号；美国专利4，789，732号；美国专利4，795，804号；美国专利4，877，864号；美国专利5，013，649号；美国专利5，166,058号；美国专利5，618，924号；美国专利5,631, 142号；美国专利 6，150，328 号；美国专利 6，503，109 ；Kawai 和 Urist.,Clin.0rthop.Relat.Res.，1988 ；222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;以及 Hu等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33);对再生哺乳动物中头骨环锯缺损的BMP活性进行定量的体内分析(例如大鼠、狗或猴)(参见例如美国专利4，761，471号和美国专利4，789，732号)；对诱导体外培养的软骨细胞增殖的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利4，795，804号)；对诱导体外培养的肌肉细胞(例如C2C12细胞，ATCC编号CRL-1772)或骨髓基质细胞(例如鼠的W-20细胞，ATCC编号CRL-2623)中碱性磷酸酶活性的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利6, 593, 109号；Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302 ；Kirsch 等，EM`BO J，2000 ；19:3314-3324 ;Vallejo 等，J Biotech,2002；94:185-194 ;Peel 等,J Craniofacial Surg., 2003 ； 14:284-291 ;以及Hu等,Growth Factors,2004 ；22:29-33);对诱导培养的间质祖细胞系(例如鼠的C3H10T1-2细胞)中FGF-受体2(FGFR3)表达的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如Vallejo等，J Biotech2002 ；94:185-194);对诱导鸡枝芽细胞中蛋白多糖合成的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302);以及对诱导骨髓基质细胞(例如鼠的W-20细胞；ATCC编号CRL-2623)中骨钙素治疗的BMP活性进行定量的体外分析(参见例如美国专利 6，593，109 号)。
[0076]测暈BMP结合与释放的分析
[0077]各种分析可以用于测量来自载体的重组BMP的结合与释放。例如，重组BMP蛋白质的量可以通过本领域中众所周知的任何技术进行定量，包括斑点印迹、免疫分析(例如酶联免疫吸附分析，ELISA)、当生物植入物包含放射标记的BMP时释放缓冲剂中出现的放射性增加的测量以及色谱法(例如高压液相色谱、HPLC和离子交换色谱)。
[0078]这类方法在本领域中是众所周知的(参见例如Harlow和Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press).1999 ;Gosling 编著，Immunoassays:A Practical Approach,牛津大学出版社(Oxford University Press).2000 ;01iver 编著，HPLC of Macromolecules:A Practical Approach.,牛津大学出版社，1998 ；Millner 编著，High ResolutionChromatography:A Practical Approach.牛津大学出版社，I999 ;Hockf ield 等，SelectedMethods for Antibody and Nucleic Acid Probes.冷泉港实验室出版社.1993 ；Gore 编著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry:A Practical Approach.牛津大学出版社，2000)。
[0079]例如已经描述了 BMP蛋白质的放射免疫实验分析的方案(参见例如美国专利4，857，456号)。例如已经描述了 BMP蛋白质的免疫印迹分析的方案(参见例如Wang等，ProcNatl Acad Sci USA1990 ;87:2220_2224)。例如用于人类、大鼠或小鼠BMP-2的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从R&D Systems(目录#DBP200、roBP200或SBP200)。例如用于人类BMP-7的蛋白质水平的定量的ELISA试剂盒是可以商业购买的，例如从 R&D Systems (目录#DY354 或 DY354E)。
_0] 试剂盒
[0081]在一个方面，本发明提供一种用于包含本文所描述系统的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含用于制造递送载剂和载体以及所需的生长因子的必需组分。即本发明的试剂盒会包含用于制造递送载剂和载体以及与递送载剂相关联的至少一种生长因子和与载体相关联的至少一种生长因子的必需组分。
[0082]优选地，递送载剂和相关联的生长因子保持在分开的容器中，待在使用时组合。这在递送载剂可以包括液体或凝胶的情况下会是特别优选的。在这种情况下，相关联的生长因子可以以冻干粉末保持在分开的容器中。在使用时，粉末形式的生长因子可以与液体或凝胶递送载剂组合。
[0083]试剂盒优选地包含·另外的包含载体的容器，相关联的生长因子可以装载或包覆到所述载体上。在一个实施方案中，载体材料还可以保持与相关联的生长因子分开。
[0084]在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒会包含至少三个容器用于以下的每一个:1)递送载剂组分；2)至少一种第一生长因子(即与递送载剂相关联的生长因子)；和3)载体和至少一种第二生长因子(即与载体相关联的生长因子)。使用时，粉末形式的至少一种第二生长因子与液体或凝胶形式的递送载剂组合，然后混合物施用到载体，至少一种第二生长因子预装载到所述载体上。
[0085]在一个方面，本发明的试剂盒根据可能的需要可以包含任何必需的试剂和/或说明书和/或器皿。
[0086]实施例
[0087]现在，将通过以下实施例说明本发明。这些实施例说明了本发明人的新发现，即生长因子例如rhBMP-2的多相释放模式比仅产生突然释放或持续释放的载体更有效，所述多相释放模式通过在以持续释放来释放BMP的载体内装载部分的BMP和在以最初释放来释放BMP的递送载剂内装载部分的BMP而产生。
[0088]如会对本领域技术人员明显的，能够在载体内放置一种生长因子，在递送载剂内放置不同的生长因子，产生各生长因子不同的释放模式。
[0089]将会理解，本文所提供的实施例仅意欲说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。同样地，本发明不限于本文所描述的任何特别优选的实施方案。事实上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员可以是明显的。因此，本发明仅受所附的权利要求以及权利要求享有权利的等同物的完整范围限制。
[0090]实施例1:通过在PLGA中包封制造含有BMP的持续释放复合载体
[0091]该实施例示范如何形成含有rhBMP-2的载体，其以持续释放模式释放生长因子。
[0092]材料和方法
[0093]本征粘度为1.33dL/g 的 PLGA75/25 (MW=205000-210000)购自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四钙(TTCP)从 Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)获得，无水憐酸二钙(DCPA)和二甲亚讽(DMSO)从Taihei Chemical Industrial C0.(MO, USA)获得。糖颗粒购自 Tate&Lyle North America Inc.(多伦多，加拿大)。
[0094]可再吸收的磷酸钙颗粒通过在100%的相对湿度混合等摩尔的TTCP和DCPA与去离子蒸懼水(ddH20) 24小时进行制备。反应物进行研磨并通过45 y m的筛进行筛分。
[0095]重组的人类BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂(1.5mg/ml， pH4.5 ;5mm谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%鹿糖和0.01%Tween?80与ddH20)中进行制备。蛋白质溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并搅拌至少15分钟。然后，粉末进行冷冻并冻干。
[0096]然后，具有(CaP-BMP)或没有(CaP)BMP的颗粒用于通过如下的相转化/颗粒浙滤来制造CaP颗粒-PLGA支架块:将PLGA以11.5% (w/v)的浓度溶于DMSO。CaP和CaP-BMP 颗粒按照2:1的CaP/PLGA比例(w/w)彻底混合入该溶液。尺寸范围为0.85至1.18mm的糖晶体分散于CaP/PLGA中，混合物在_18°C下在模具中进行固化。PLGA沉淀，糖晶体通过三次更换ddH20浸洗来滤出。
[0097]—层羟磷灰石如下沉积到大孔复合支架上并遍及大孔复合支架:干燥的PLGA/ CaP圆柱，测量直径2mm和长2mm，在70%的乙醇中预湿润，并在37°C下浸入60ml的3XSBF 中9天时间。SBF如下制备:在剧烈搅拌下，向1.8L的ddH20中依次加入以下盐:29.711g NaCl, 2.206g CaCl2_2H20，IOmllM HCl, 0.852Na2HP04。最终体积达到 2L。每天更换 SBF 溶液。包覆之后，3PCC样品在ddH20中进行漂洗，并空气干燥。
[0098]这导致形成能够在至少七天内以持续释放模式释放rhBMP-2的大孔复合载体 (3PS)。这些结果图示于图1中。
[0099]实施例2:通过在磷酸钙粘合剂中包封制造含有BMP的持续释放载体
[0100]本实施例示范如何形成具有持续释放模式的包含rhBMP-2的磷酸钙粘合剂(CPC) 载体。
[0101]材料和方法
[0102]磷酸四钙(TTCP)从Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)获得,无水磷酸二IiiKDCPA)从Sigma Chemical Co获得。大孔双相磷酸|丐颗粒(Eclipse)购自Citagenix (Laval Qc,加拿大)。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂 (1.5mg/ml,pH4.5 ；5mm 谷氛酸，2.5% 甘氛酸,0.5% 鹿糖和 0.01%Tween?80 与 ddH20)中进行制备。
[0103]可再吸收的磷酸钙粘合剂颗粒通过混合等摩尔的TTCP和DCPA与rhBMP-2溶液来制备。反应物进行研磨，并通过300和100 u m的筛进行筛分，保留在100和300 u m之间的颗粒。[0104]这导致形成rhBMP-2并入其中的磷酸钙粘合剂载体颗粒。在移植入动物中后，BMP 在至少几周的时间内以持续的方式进行释放。[0105]为了生成也用作大孔支架的基于CPC的持续释放载体，CPC颗粒(0.1至0.3mm)与大孔磷酸钙颗粒(1至2mm)以1:1的比例(w/w)进行混合。_6] 实施例3:通过使用结合BMP的涂层制造含有BMP的持续释放载体[0107]本实施例示范如何通过应用结合BMP的涂层来形成具有持续释放模式的载体。一个这样的方法是如在我们的共同待决的申请号美国申请13/002，444号(其全部内容通过引用并入本文)中所述的用抗体或结合BMP的蛋白包覆支架。[0108]材料和方法[0109]纯净的多克隆兔抗人类BMP-2抗体购自Cell Sciences (Canton MA.,目录 #PA0025)o 大孔双相磷酸|丐(BCP)颗粒(Eclipse)购自 Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。[0110]在生物安全柜中称出无菌BCP颗粒，并置于无菌TPP管(Mandel Scientific, Guelph 0N，加拿大)中。抗体溶液在磷酸盐缓冲的盐水中稀释至最终浓度为Iml PBS中150、 300和600ng抗体,过滤灭菌,并以l:lv/v的比例应用到支架。在进行冷冻和冻干前，样品在室温下搅拌至少15分钟。然后，BMP溶液应用到颗粒，允许在室温下浸15分钟，然后进行冷冻和再冻干。[0111]这导致形成覆盖有结合并以持续方式缓慢释放rhBMP-2的抗体的BCP颗粒。[0112]能够结合的rhBMP-2的量能通过增加所用抗体的量来增加。释放的速率能够通过使用具有更低的亲和性和亲和力的抗体来增加。[0113]实施例4:俥用F127牛产含BMP的递送载剂[0114]本实施例示范如何使用F127制备含有rhBMP-2的递送载剂。[0115]材料和方法[0116]泊洛沙姆如下进行制备:100ml的蒸馏水冷却到4°C，随着搅拌在几个小时的时间内缓慢添加各种量的泊洛沙姆407，直到所有固体颗粒都溶解，使最终溶液在12和33%之间。然后，泊洛沙姆溶液在高压釜中进行灭菌(121°C，20分钟，30psi )。在灭菌后，泊洛沙姆溶液在4°C下保存直到使用。[0117]冻干的重组人类BMP-2粉末(rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆溶液，并缓慢地混合。[0118]或者，rhBMP-2以 1/10 或 1/20 的比例(v/v)从溶液(lmg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%吐温80)添加。[0119]这导致形成在前两天释放超过80%的rhBMP-2的递送载剂(如图2中所示)。[0120]实施例5:具有多相释放模式的生物植入物的生产[0121]本实施例示范如何形成以多相释放模式来释放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。[0122]材料和方法[0123]制备每5mg载体含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的3PS载体(如实施例1所述)， 并储存于Eppendorf管中。在45.5 的F127中含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的递送载剂(如实施例4所述制备的)在4°C储存于Eppendorf管中。紧接着使用之前，F127移液到3PS载体上，并且载体混合到递送载剂中。[0124]然后，该3PS-F127生物植入物如下文所述用于测量体外BMP释放以及体内骨形成活性。
[0125]载体与递送载剂的比例能够变化以产生凝胶(1:1比例v:v)或油灰(2:1比例 v:v)0另外，BMP与载体的比例或载体的颗粒尺寸能够变化以改变持续释放模式。最终，载体和递送载剂中rhBMP-2的量能够变化以改变与之后几周释放的量相比在前几个小时最初释放的rhBMP-2的量。
[0126]实施例6:来自牛物棺入物的BMP释放的体外分析。
[0127]本实施例描述了如何测量来自实施例1至5中所述的各种生物植入物的rhBMP-2 的释放。
[0128]材料&方法
[0129]如实施例1至5中所制备的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物转移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的总量为相对于每5mg载体以及45.5 的F127的9.1 y g 的rhBMP-2，或者相对于每IOmg载体以及100 U I的F127的20 y g的rhBMP-2。
[0130]然后，样品在37°C在搅拌下利用Iml包含磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)+1%BSA的释放缓冲溶液进行培养。在不同时期(例如1、2、5、7和10天)后，缓冲剂被移除，并替换为新鲜的释放缓冲剂，并且收集的溶液在_20°C下储存于1.5ml的小瓶中用于进一步的分析。
[0131]使用商业的ELISA (Quantikine?hBMP-2ELISA, RnD Systems)测量释放到缓冲剂中的BMP-2的量。ELISA根 据制造商的说明来实施。
[0132]益果
[0133]在从任何未装载BMP的生物植入物中所收集的释放缓冲剂中没有可以检测到的 BMP。已经装载rhBMP-2的载体样品证实在研究期间持续释放rhBMP-2，而单独的递送载剂中的样品以“最初释放模式”进行释放。
[0134]当载体和递送载剂组合时，根据BMP装载入的组分获得各种释放模式。当100%的 rhBMP-2 (9.1iig)装载在之后与33%的F127 (45.5 yl)混合的3PS (5mg)载体内时，BMP 释放模式与持续形式匹配，其中在前两天释放的BMP的量为5ng，在3天和5天之间其为 8ng，在5天和7天之间其为IOng (图3 ; 100-0)。
[0135]当100%的rhBMP-2 (9.1 u g)装载在33%的F127 (45.5 yl)内，然后与其中没有 BMP的3PS载体(5mg)混合时，BMP被释放，其中释放的BMP的量在第一天为2363ng，在第二天为381ng，然后在第三天为12ng (图3 ;0_100)。
[0136]当BMP分布在载体和递送载剂之间时，生物植入物证实双相释放模式，其中在中等最初释放之后是BMP的持续释放(图3 ;50-50)。
[0137]实施例7:测试释放的BMP的活性的体外分析。
[0138]本实施例描述了如何确定从生物植入物释放的rhBMP-2是否保持其活性。为了证实释放的rhBMP是生物活性的，应答细胞可以利用释放物来培养，并测量其对生长因子的应答。这种分析在本领域中是已知的(参见Peel等，J.Craniofac.Surg.2003,14: 284-291)。
[0139]材料&方法
[0140]制备如实施例1至5中所述的具有或没有rhBMP-2的材料。释放物如实施例3中所述进行制备，除了缓冲剂是a最小必需培养基与15%的胎牛血清和抗体(a MEM+15%FBS+AB)0
[0141]C2C12细胞以0.5X IO5细胞/ml、lml a MEM+15%FBS每孔接种到24孔组织培养板中。在24和72小时之间的各种时期后，除去培养基并应用各种释放物。阴性对照包括利用新鲜的a MEM+15%FBS+AB培养的C2C12细胞。阳性对照包括利用含有25、50和IOOng/ ml的rhBMP-2的a MEM+15%FBS+AB培养的C2C12细胞。48小时后，细胞在Iml细胞溶解缓冲剂(Cellytic Sigma Aldrich)中溶解,使用对硝基苯酹磷酸酯分析物(Sigma Aldrich) 测量细胞溶解物的碱性磷酸酶(ALP)活性。溶解物的细胞蛋白含量使用Coomassie Plus Reagent (Fisher)进行测量,并用于使ALP活性对每孔的细胞数归一化。
[0142]一般地，为了确定是否在与载体或递送载剂相结合时已经有BMP活性的任何损失，确定未与载体或递送载剂相结合的rhBMP-2标准物的ALP/PTN结果的标准活性曲线。释放物中活性rhBMP-2的浓度可以从该标准曲线进行确定，其表达为如通过ELISA测定的释放物中存在的rhBMP-2总量的百分比。
[0143]实施例8:多相BMP植入物的骨诱导活性的评价
[0144]本实施例描述了如何体内测定含有BMP的生物植入物的骨诱导活性。为了评价生物植入物诱导骨形成的活性，使用小鼠肌肉囊分析。在该模型中，生物植入物置于在小鼠后肢中制造的肌肉囊中，形成的诱导骨的尺寸与试验的BMP的量成比例。这种分析在本领域是已知的(参见如 Barr 等，Oral Surg.0ral Med.0ral Pathol.0ral Radiol.Endod., 2010 ；109:531-40)。
[0145]材料和方法
[0146]生物植入物如实施例1和5中所述进行制备。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶_1 小鼠的后肢的大腿肌肉中通过钝器解剖制造双侧的囊。然后，生物植入物置入已经置入肌肉囊的无菌胶囊中。将肌肉拉到一起，用Mitchel夹使皮肤闭合。
[0147]动物在术后第28天进行安乐死。收获后肢，并用10%缓冲的福尔马林进行固定。 固定之后,试样使用微 CT 扫描仪(General Electric Healthcare eXplore?Locus SP)进行成像。扫描样品，并使用制造商软件在59 的分辨率下重构。图像重构之后，确定感兴趣的区域(R0I)。该区域包括含有生物植入物诱导的骨的所有区域。根据位置和密度这些可以简单地与骨骼骨进行区分。
[0148]为了分析ROI内的骨的数量和质量，mCT图像的体素区分为骨和非骨的相。区分通过确定体素灰度的阈值来实现，在所述阈值体素视为骨。对每个样品测定ROI的总体积 (TV)、骨体积(BV)、总体积的矿物密度(TV-MD )、骨体积的矿物密度(BV-MD )、总体积的矿物含量(TV-MC)、骨体积的矿物含量(BV-MC)和骨体积分数(BVF)。对于由于载体引起的钙的存在，通过使用仅选择载体的上阈值并将其从使用包括载体加新骨的下阈值获得的数值中扣除来调整数值(参见 Humber 等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology.2010.109:372_384)。
[0149]在微CT分析完成之后，试样或者嵌入spurs树脂，或者在甲酸中脱钙并嵌入蜡中。 嵌入树脂的样品通过背散射SEM进行评价，而嵌入蜡的样品进行切割并利用苏木精和曙红 (H&E)进行染色，并通过光学显微镜进行检查，以评价移植部位存在的组织类型。
[0150]益果
[0151]载体和递送载剂如实施例5所述进行组合。[0152]微CT分析显示，所有BMP都在3PS载体内的生物植入物产生最小的骨的小骨，所述生物植入物具有持续BMP释放模式(图4:100-0)，所有BMP都在F127递送载剂内的生物植入物产生中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP释放模式(图4:0-100)，而 50%BMP装载入载体并且50%装载入递送载剂的生物植入物产生最大的骨的小骨，所述生物植入物具有多相BMP释放模式(图4:50-50)。
[0153]背散射SEM显示，到28天时骨遍及生物植入物形成以及形成到已经并入PLGA的磷酸钙颗粒上(图5)。组织学确认所形成的组织是骨(图6)。
[0154]实施例9:来自生物植入物的BMP释放的活体分析
[0155]本实施例描述了如何测量移植后从实施例1、2、3、4或5中所述的各种生物植入物到动物中的rhBMP-2的释放。做到此的方法在本领域是众所周知的。例如参见Uludag等， J Biomed Mater Res，46，193 - 202，1999。
[0156]材料&方法
[0157]重组的hBMP-2通过珀金埃尔默(Perkin Elmer)用碘125 (1-125)进行放射性标记。放射性标记的rhBMP-2 (强放射性的)与未标记的rhBMP-2 (无放射性的)混合，以产生 I: 100的强放射性的无放射性的混合物。
[0158]含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如实施例1至5中进行制备。然后，这些生物植入物如实施例8中所述移植到动物中。在各个时间段，牺牲动物并切出植入物部位。然后对切出的组织称重，放射性的量使用Y计数器进行测定。
[0159]为了确定计数是否与蛋白质相关，组织在0.5ml PBS+0.5%BSA中均匀化。两ml冰冷的10%三氯乙酸加入匀浆中，然后在4°C保持至少I小时。然后，离心匀浆，并移除上层清液。然后，沉淀物的放射性使用Y计数器进行测量。
[0160]与植入物相关的放射性对衰减进行校正，估计保持在植入物中的BMP的总量。
[0161]实施例10:具有短持续释放模式的载体的生产
`[0162]本实施例描述了生产以短持续释放模式来释放生长因子的载体的手段。
[0163]材料&方法
[0164]大孔双相磷酸钙(BCP)颗粒(Eclipse)购自Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。重组的人类 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制缓冲剂(1.5mg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%Tween?80与ddH20)中进行制备。
[0165]无菌的rhBMP-2溶液在摇动下以9.1 ii g每5mg或4.55 ii g每5mg (BMP每BCP) 的比例利用无菌BCP颗粒培养15分钟。然后，样品进行冷冻并无菌冻干。
[0166]冻干之后,载体称为5mg的等分部分,并置于无菌的epindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45.5 yl)。然后，BMP释放模式如实施例6中所述进行测定。
[0167]MS
[0168]未用F127包覆的载体(BCP)显示突然释放模式，其中在第一天释放大量BMP，然后在每一之后的时间点释放减少量的BMP。在F127内混合BCP (BCP-Pol)产生短期的持续释放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (图7)。
[0169]实施例11:改变载体的持续释放模式
[0170]本实施例描述改变载体的释放模式的手段。
[0171]材料&方法[0172]具有不同本征粘度和分子量的PLGA购自Birmingham Polymers Inc.(Birmingham, AL)。然后,载体如实施例1所述使用这些PLGA来制造。这些载体的BMP释放模式根据实施例6的方法进行测定。
[0173]结果
[0174]所有载体产生持续释放模式。然而，释放的BMP的量根据所用PLGA的粘度/分子量而不同。以低粘度PLGA(Pol-1)制造的载体在研究期间的12周内比使用高粘度(Pol-2) PLGA的那些释放更多的rhBMP-2 (图8)。
【权利要求】
1.一种用于生长因子在治疗部位的多相释放的系统，所述系统包括: -递送载剂，其包含至少一种第一生长因子；和 -载体，其包含至少一种第二生长因子； -其中: -所述递送载剂适合于在第一时间段以最初释放模式释放所述至少一种第一生长因子; -所述载体适合于在第二时间段以持续释放模式释放所述至少一种第二生长因子。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述递送载剂包括聚合物。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述载体包括分散在聚合物基体内的多个颗粒，并且其中所述颗粒在其表面上含有所述至少一种第二生长因子。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述颗粒包括磷酸钙颗粒。
8.根据权利要求6或7所述的系统，其中所述聚合物基体包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的系统，其中所述第一时间段包括数小时或数天。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的系统，其中所述第二时间段包括数天或数周。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的系统，其中所述递送载剂递送总量的至少10%的所述生长因子，所述载体递送总量的至少50%的所述生长因子。
18.一种包括根据权利要求1至17中任一项所述的生长因子释放系统的生物植入物。
19.一种生长因子的多相释放的方法，所述方法包括: -以最初释放模式递送至少一种第一生长因子； -以持续释放模式递送至少一种第二生长因子。
20.根据权 利要求19所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子由递送载剂递送，所述至少一种第二生长因子由载体递送。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述递送载剂递送总量的至少10%的所述生长因子，所述载体递送总量的至少50%的所述生长因子。
28.一种用于生长因子的多相递送的试剂盒，所述试剂盒包括: -递送载剂组分； -与所述递送载剂相关联的至少一种第一生长因子； -载体组分；和 -与所述载体相关联的至少一种第二生长因子。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述递送载剂和所述载体组分在分开的容器中。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述递送载剂和所述至少一种第一生长因子提供在分开的容器中。
31.根据权利要求28至30所述的试剂盒，其中所述载体和所述至少一种第二生长因子在单个容器中组合，并且其中所述至少一种第二生长因子装载或包覆在所述载体组分上。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的试剂盒，其中所述递送载剂包括聚合物。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
36.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述载体包括分散在聚合物基体内的多个颗粒，并且其中所述颗粒含有在其表面上的所述至少一种第二生长因子。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述颗粒包括磷酸钙颗粒。
38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其中所述聚合物基体包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是相同的。
40.根据权利要求28至38中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子和所述至少一种第二生长因子是不同的。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是转化生长因子β总科的生长因子。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是:骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子β、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是BMP。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述第一和第二生长因子是BMP-2或BMP-7。
45.根据权利要求28至44中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种第一生长因子包括总量的至少10%的提供于所述试剂盒中的生长因子，所述至少一种第二生长因子包括总量的至少50%的提供于所述试 剂盒中的生长因子。
【文档编号】A61K38/18GK103596553SQ201280017716
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月11日 优先权日:2011年4月11日
【发明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申请人:感应生物制品股份有限公司
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