识别rig-i通路调节因子的方法和细胞的制作方法
【专利摘要】本文公开了识别用于治疗病毒感染(包括RNA病毒感染)的化合物的方法，以及所述化合物作为药物组合物的使用。所识别的化合物调节脊椎动物细胞中的RIG-I通路。
【专利说明】识别RIG-1通路调节因子的方法和细胞
【技术领域】
[0001]本文所公开的方法用于识别用于治疗脊椎动物中的病毒感染，包括RNA病毒感染的化合物。所识别的化合物调节RIG-1通路。
【背景技术】
[0002]总体来说，在美国和世界范围内RNA病毒表示巨大的公共健康问题。熟知的RNA病毒包括流感病毒(包括禽和猪分离物)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒、SARS-冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)。
[0003]世界上超过1.7亿人被HCV感染，他们中的1.3亿是慢性携带者，具有发展为慢性肝病(肝硬化、肝癌和肝功能衰竭)的风险。同样地，在发达国家HCV占所有肝移植的三分之二。最近研究显示，由于慢性感染患者年龄的增长，HCV感染的死亡率正在上升。同样，季节性流感感染5-20%的人群，每年导致200，000人住院治疗和36，000人死亡。
[0004]与流行性感冒和HCV相比，西尼罗病毒导致的感染人数最少，2009年美国为663人。百分之二十的感染患者发展为严重型疾病，导致4.5%的死亡率。与流行性感冒和HCV不同的是，西尼罗病毒感染的治疗无核准疗法，由于其可能作为生物恐怖剂，因此是药物开发的高优先级病原体。
[0005]在所列出的RNA病毒中，仅存在流感病毒的疫苗。因此，药物治疗对于显著降低这些病毒相关的发病率和死亡率是重要的。遗憾的是，抗病毒药物的数量有限，多数效果不佳，并且几乎都受到病毒耐药性的快速进化和作用谱有限的困扰。此外，急性流行性感冒和HCV感染的治疗仅适度有效。HCV感染的护理标准、聚乙二醇干扰素和病毒唑仅对50%的患者有效，并且存在许多组合治疗相关的剂量限制性副作用。急性流行性感冒抗病毒药的种类，金刚烷和神经氨酸苷酶 抑制剂二者仅在感染后48小时内有效，从而限制了治疗时机窗口。对金刚烷的高耐性已经限制了其用途，并且神经氨酸苷酶抑制剂的大量堆积最终会导致滥用和流行性感冒耐药株的出现。
[0006]大多数针对这些病毒靶向病毒蛋白的药物开发正努力进行。这是当前药物的作用谱窄，并且会出现病毒耐药性的大部分原因。大多数RNA病毒具有小基因组，并且多数编码小于十二个蛋白质。因此病毒靶标有限。基于前文所述，对病毒感染的有效治疗存在大量尚未满足的需求。
【发明内容】
[0007]本文所公开的方法包括如下事实:抗病毒物会导致病毒清除关键通路的下调。一个此类通路是RIG-1通路。本文所公开的方法提供了识别可在存在抗病毒物的情况下逆转或减少此类通路的下调的化合物，并且提供新型抗病毒药物开发的有效策略的方法。
[0008]作为非限制性例子，HCV病毒机制有助于抗病毒治疗剂和慢性宿主感染的耐性。HCV NS3 / 4A蛋白酶通过消除RIG-1受体依赖性信号通路来抑制先天免疫应答。因此，本文所公开的方法识别在下游作用或阻断NS3 / 4A干扰点的该通路调节剂。这些调节剂表示可有助于HCV感染的更有效治疗的可能治疗剂。因此，本文所公开的方法设计为识别在存在抗病毒干扰的情况下具有活性的调节剂。这些方法可应用于多个病毒系统。在一个实施方案中，调节剂是激动剂。
[0009]本发明有助于通过提供识别化合物的结构种类的方法来满足有效病毒治疗方法的需要，所述化合物在存在抗病毒物的情况下调节先天免疫信号转导。所识别的化合物结构种类使病毒药物开发的焦点从病毒蛋白的靶向转向靶向和调节宿主的先天抗病毒响应的药物的开发。此类化合物和方法可能更有效，对病毒耐药性出现的灵敏度更低，导致的副作用更少，并且对不同病毒的范围更有效(I)。在一个实施方案中，化合物刺激和/或增强先天免疫信号转导。
[0010]如前所述，RIG-1通路密切参与调节RNA病毒感染的先天免疫应答。预计RIG-1调节剂可用于多种病毒的治疗，包括(但不限于):HCV、流行性感冒和西尼罗病毒。因此，本发明涉及识别治疗病毒感染，包括RNA病毒感染的化合物的方法，其中该化合物调节，并且在具体实施方案中刺激和/或增强RIG-1通路信号转导。
[0011]本发明提供识别调节RIG-1活性的化合物的方法，包括以下步骤:提供包含在启动子控制下的荧光素酶报告基因的细胞；使细胞与推测RIG-1调节化合物接触；测量荧光素酶活化；以及选择在存在一种或多种抗病毒物的情况下活化荧光素酶高于所选择的阈值的化合物。在一个实施方案中，所选择的阈值可以高于对照水平二、三、四或五个标准偏差。
[0012]本发明还提供识别调节RIG-1活性的化合物的方法，其中化合物经结构选择，用于预测RIG-1的配体结合域的结合，然后所述方法包括以下步骤:提供包含在启动子控制下的荧光素酶报告基因的细胞；使细胞与推测RIG-1调节化合物接触；测量荧光素酶活化；以及选择在存在一种或多种抗病毒物的情况下活化荧光素酶高于所选择的阈值的化合物。在另一个实施方案中，所选择的阈值可以高于对照水平二、三、四或五个标准偏差。
[0013]在另一个实施方案中，本发明提供从类药分子的多样性库识别调节RIG-1活性的化合物的方法，其中所述方法包 括以下步骤:提供包含在启动子控制下的荧光素酶报告基因的细胞；使细胞与推测RIG-1调节化合物接触；测量荧光素酶活化；以及选择在存在一种或多种抗病毒物的情况下活化荧光素酶高于所选择的阈值的化合物。在另一个实施方案中，所选择的阈值可以高于对照水平二、三、四或五个标准偏差。
[0014]本发明还涉及识别在脊椎动物细胞中调节RIG-1通路的化合物的方法，其中所述调节是活化。
[0015]本发明还涉及识别具有活化干扰素调节因子-3(IRF_3)的至少一种活性的化合物，诱导干扰素和干扰素刺激基因(ISG)的表达，以及对甲型流感病毒、西尼罗病毒和丙型肝炎病毒中的至少一种具有抗病毒活性的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1示出了荧光素酶在克隆分离的NS3 / 4A细胞中表达的诱导，该细胞稳定转染有在IFNP启动子控制下的荧光素酶表达构建体，其显示出仙台病毒(A)感染后IFNP表达的活化。在存在HCV NS3 / 4A蛋白酶的情况下，IFNP表达的活化消除(B)。
[0017]图2显示出HCV NS3 / 4A蛋白酶在U20S细胞中的表达，该细胞稳定表达具有在四环素抑制启动子元件控制下的NS3 / 4A基因的构建体。在不存在Tet的情况下(左图)，NS3 / 4A以高水平表达；在存在Tet的情况下(右图)，NS3 / 4A表达受到抑制。
[0018]图3示出了四环素的滴定，从左至右为:无Tet、NS3 / 4A IFN^细胞培养物中所用正常浓度的12.5%、25%、50%、75%和100%。Tet的最小存在量足以抑制HCV NS3 /4A表达。
[0019]图4示出了在各种测定条件下NS3 / 4A IFN^克隆2A细胞中荧光素酶表达的诱导。其中示出了 RLU(A)和倍数诱导(B)。
[0020]图5A-5C示出了本文所公开的方法识别的化合物KIN101，其显示出剂量依赖性ISG54启动子诱导,对肌动蛋白启动子或细胞生长无影响。
[0021]图6A和6B显示出KINlOl和甲型流感相关的数据。
[0022]图7A-7C显示出细胞培养方法中KINlOl对HCV_2a病毒的活性。
[0023]图8A和8B显示，在表达HCV NS3蛋白酶的细胞中KINlOl活化IRF-3核移位。
[0024]图9显示出高通量筛选RIG-1激动剂活性得到的小分子KINlOO和KINlOl的识别。在10 y M下对20，000个成员的多样性库进行筛选，以识别诱导ISG54荧光素酶报告基因活性的化合物。未感染的细胞(阴性对照)和仙台病毒感染的细胞(阳性对照)在柱状图以及样本群体上提供。用于识别阳性命中的四个标准偏差阈值以垂直的黄线表示(A)。用化合物处理稳定表达ISG54启动子驱动的荧光素酶报告基因的Huh7细胞18h，显示出剂量依赖性荧光素酶生成(B)。用IOii M化合物处理表达肌动蛋白启动子驱动的荧光素酶构建体的Huh7细胞，然后分析荧光素酶生成。单独用媒介物(0.5%DMS0)处理阴性对照细胞。用得自多样性库，显示出肌动蛋白启动子的可再现活化的化合物处理阳性对照细胞(C)。用逐渐增加剂量的化合物生长Huh7细胞 48h，并且使用MTS测定法分析，以测量细胞代谢(0.D.越高，代谢活性越高)(D)。
[0025]图10显示出KINlOl的抗病毒活性。用KINlOl处理Huh7细胞24h，然后在1.0的MOI下使用HCV-2a感染。使细胞再生长48h，然后对HCV蛋白染色。感染细胞的数量对所加入的药物的浓度在(A)中示出。用KINlOl (IOiiM)预处理Huh7细胞，并且生长18h，然后在
1.0的MOI下用HCV-2a感染细胞，再生长72h。收集来自感染细胞的上清液，并且纯化HCVRNA，通过HCV特异性引物使用实时PCR定量。用HCV感染、未接受KINlOU未处理)的细胞用作阴性对照，感染率值设定为100%。IFN-P (内含子A;100IU / ml)用作HCV抑制的阳性对照(B)。Huh7细胞在1.0的MOI下用HCV-2a感染，在感染4h后将化合物或IFN添加到感染细胞。其余的实验如分图B中所描述进行(C)。用逐渐增加剂量的KINlOl预处理MRC5细胞4h，在1.0的MOI下用甲型流感病毒WSN感染，并且生长24h。使用针对流感病毒NP蛋白的ELISA方法检测感染细胞。未用药物处理的感染细胞用作感染的阳性对照(D)。IFN-^用作抗病毒活性的阳性对照。细胞用指示剂量的IFN-P处理，用流感病毒感染，并且使用ELISA方法检测感染细胞(E)。如分图D所描述处理和感染MRC5细胞。感染24h后收集细胞，裂解，通过蛋白质印迹分析全细胞蛋白裂解物中的流感病毒NP蛋白。假感染细胞用于确定非特异性背景，并且无药物治疗的流感病毒感染细胞用作感染和检测的阳性对照。IFN用作流感病毒感染抑制的阳性对照。底部分图示出了作为加载对照的Hsp90的染色(F)。如分图D所描述处理和感染MRC5细胞。感染十六小时后，固定细胞并且使用特异性和荧光标记抗体检测流感病毒NP。不包含药物的阴性对照细胞在左边分图中示出，用KINlOl (IOiiM)处理的细胞在中间示出，用IFN-P处理的细胞在右边示出。感染细胞使用Array Scan定量(G)。感染流感病毒的感染细胞在Array Scan上测量,并且示出了药物处理后感染细胞的相对数量(H)。[0026]图11示出了通过KINlOO和KINlOl的IRF-3核移位诱导。用药物或对照物处理Huh7细胞(人类肝癌)18h，固定并且用IRF-3多克隆兔血清和FITC 二抗染色(绿色，左边分图)。单独用媒介物(0.5% DMSO培养基)处理假感染细胞，仙台病毒感染作为引起IRF-3核移位的阳性对照。KINlOl和KINlOO以10 y M的浓度添加到包含0.5% DMSO的培养基的细胞，以及在用于ISG诱导的筛选或验证测定中未显示出活性的药物处理的阴性样品中。右边分图中示出的细胞以类似的方式处理，并且对多聚(A)结合蛋白(PABP)染色，作为胞质蛋白的对照，所述蛋白的细胞分布不应被药物处理改变(A)。在各种细胞类型中以及不同处理时间IRF-3移位的定量。如图1OA所示，用阴性对照或KINlOl处理各种细胞类型指示的时间量。在IRF-3染色后，使用Array Scan VTI仪器分析细胞，以对细胞限定核和细胞质区域中的IRF-3定量。IRF-3核染色阳性的细胞通过测量IRF-3特异性染色强度确定，并且定量表示三个孔的平均值，每个分析孔100个细胞。IRF-3核定位阳性的细胞在核中的IRF-3染色比阴性对照大三个标准偏差(B)。
[0027]图12示出了在存在抗病毒物的情况下KINlOl诱导的IRF-3核移位。人骨肉瘤细胞稳定转化有在四环素抑制启动子控制下的HCV NS3-4A蛋白酶编码序列。细胞在四环素不存在的情况下生长，以诱导高水平的HCV蛋白酶(A)。细胞在存在或不存在四环素以及用KINlOl (10 u M)或对照物处理的情况下生长18h。如图11所示对细胞进行IRF-3染色，并且示出了代表性图像。仙台病毒感染用作HCV NS3-4A蛋白酶抑制的IRF-3移位的对照。假处理细胞在包含0.5% DMSO C的培养基中生长。图像如图11所示在Array Scan VTI上进行分析。所示出的值展示了核中的IRF-3强度，并且表示三个孔的平均值，每个分析孔100个细胞⑶。
[0028]图13示出了离散免疫通路的表达，其中心位于KINlOl诱导的IRF信号转导。顶部信号转导通路在MRC5细胞中上调，然后用KINlOl处理(A)。使用Ingenuity PathwayAnalysis生成网络示意图，其示出了编码KINlOl处理上调的先天免疫蛋白的基因的互连网络(B)。TaqMan确认微阵列示出的所选基因被KINlOl处理上调。归-化表达以对数尺度示出(C)。蛋白质印迹分析示出KINlOl处理后IRF活化下游蛋白质的丰度增加。IFN-3处理用作阳性对照(D)。
[0029]图14示出了与假处理(DMSO)或仙台病毒感染的人MRC5细胞相比较的KINlOl诱导的分化基因表达。其示出了表现出>2倍变化的基因。KINlOl处理的基因上调(红色)和下调(绿色)的特征图示出了类似于仙台病毒感染的图案。
[0030]图15示出了与单独用DMSO处理的对照细胞所示出相比的KINlOl处理后上调的顶部20个探针(对应于18个基因)。
[0031]图16示出了与DMSO对照处理相比较的来自KINlOl处理MRC5细胞的75个差异
表达的基因。
[0032]图17示出了所述方法显著抑制的呼吸道合胞病毒(RSV)识别的化合物。KINlOl保护细胞免于RSV诱导的细胞病变和细胞死亡(分图A)，减少由感染细胞产生的RSV病毒RNA的量(分图B)，并且减少病毒诱导的蚀斑的数量和大小(分图C)。
[0033]图18示出所述方法识别的化合物引起了登革热病毒感染和生长的强效和有效减少。
[0034]定义[0035]如本文单独或组合使用，术语“烷氧基”或“烃氧基”是指包含烷基醚基团的官能团。烷氧基的例子包括(但不限于):甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等等。
[0036]术语“烷基”、“烯基”和“炔基”是指取代的和未取代的烷基、烯基和炔基。术语“烷基”是指包含含有I至20个通过单键专门连接的碳原子的直链或支链烃并且不具有任何环状结构的官能团。烷基可以任选地如本文所定义取代。烷基的例子包括(但不限于):甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戍基、异戍基、己基、庚基、羊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、~.十烷基等等。
[0037]取代烷基、烯基和炔基是指被一至五个选自H、低级烷基、芳基、烯基、炔基、芳烧基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷芳基、烷氨基、芳氨基、NH2、OH、CN、NO2、OCF3、CF3、F、1-脒、2-脒、烷基羰基、吗啉基、哌啶基、二噁基、哌喃基、杂芳基、呋喃基、苯硫基、四唑并、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、噻二唑基、噻二唑S-氧化物、噻二唑S，S- 二氧化物、吡唑并、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、SR、SOR、SO2R, C02R、COR、CONRj R”、CSNRj R”、SonNRj R”的取代基取代的烷基、烯基和炔基。
[0038]如本文单独或组合使用，术语“炔基”是指包含含有2至20个碳原子的直链或支链烃、具有一个或多个碳碳三键并且不具有任何环状结构的官能团。炔基可以任选地如本文所定义取代。炔基的例子包括(但不限于):乙炔基、丙炔基、羟丙炔基、丁炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、3甲基丁炔-1-基、戍炔基、戍炔-1-基、己炔基、己炔-2基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、十三炔基、十四炔基、十五炔基、十六炔基、十七炔基、十八炔基、十九炔基、二十炔基等等。
[0039]如本文单独或组合使用，术语“亚烷基”是指衍生自连接到两个或更多个位置的直链或支链饱和烃的饱和脂族基团，例如亚甲基(-C2-)。除非另外指明，术语“烷基”可以包括“亚烷基”。
[0040]如本文单独或组合使用，术语“烷基羰基”或“烷酰基”是指包含通过羰基连接到母体分子部分的烷基的官能团。烷基羰基的例子包括(但不限于):甲基羰基、乙基羰基等
坐寸o
[0041]术语“亚炔基”是指连接到两个位置的碳碳三键，例如乙亚炔基(-C:::C-、-C ^ C-)。除非另外指明，术语“炔基”可以包括“亚炔基”。
[0042]如本文单独或组合使用，术语“芳基”、“烃基芳基”或“芳香烃”是指包含具有3至12个碳原子的共轭环状分子环状结构的取代的或未取代的芳香烃官能团。芳基可以是单环的、双环的或多环的，并且可以任选地包括一至三个另外的环状结构，例如环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基或杂芳基。术语“芳基”包括(但不限于):苯基(次苄基)、苯硫基、吲哚基、萘基、甲苯基、二甲苯基、蒽基、菲基、甘菊环基、联苯基、萘基、1-甲基萘基、苊基、苊烯基、蒽基、芴基、次联苯甲基、菲基、苯并[a]蒽基、苯并[c]菲基、屈基、荧蒽基、芘基、并四苯基(苯并蒽基)、三亚苯基、蒽嵌蒽基、苯并芘基、苯并[a]芘基、苯并[e]荧蒽基、苯并[ghi]茈基、苯并[j]荧蒽基、苯并[k]荧蒽基、碗烯基、蔻基、二蔻基、螺烯基、并七苯基、并六苯基、卵苯基、并五苯基、茜基、茈基和四次苯基。取代的芳基是指被一至五个选自H、低级烷基、芳基、烯基、炔基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷芳基、烷氨基、芳氨基、NH2、OH、CN、NO2, OCF3> CF3> Br、Cl、F、1-甲脒基、2-甲脒基、烷基羰基、吗啉代、哌啶基、二噁基、哌喃基、杂芳基、呋喃基、苯硫基、四唑并、噻唑、异噻唑、咪唑、噻二唑、噻二唑S-氧化物、噻二唑S，S 二氧化物、吡唑并、噁唑、异噁唑、批啶基、嘧啶基、喹啉、异喹啉、SR、S0R、SO2R, CO2R, COR、CONRR、CSNRR、SOnNRR 的取代基取代的芳基。[0043]如本文单独或组合使用，术语“低级芳基”是指包含具有3至6个碳原子的共轭环状分子环状结构的取代的或未取代的芳香烃官能团。低级芳基的例子包括(但不限于):苯基和萘基。
[0044]如本文单独或组合使用，术语“羧基”或“羧酸基”是指官能团-C (=0) OH或对应的“羧酸”阴离子-C (=0)0-。例子包括(但不限于):甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸。“0-羧基”是指具有通式RCOO的羧基，其中R为有机部分或基团。“C-羧基”是指具有通式COOR的羧基，其中R为有机部分或基团。
[0045]如本文单独或组合使用，术语“环烷基”、“碳环的烷基”和“碳环烷基”是指包含具有3至12个碳原子的非共轭环状分子环状结构的取代的或未取代的非芳香烃官能团，在碳环结构中所述碳原子通过碳-碳单键专门连接。环烷基可以是单环的、双环的或多环的，并且可以任选地包括一至三个另外的环状结构，例如芳基、杂芳基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。
[0046]如本文单独或组合使用，术语“低级环烷基”是指包含具有3至6个碳原子的非共轭环状分子环状结构的单环取代的或未取代的非芳香烃官能团，在碳环结构中所述碳原子通过碳-碳单键专门连接。低级环烷基的例子包括(但不限于):环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
[0047]如本文所用，术语“官能团”是指分子内特定的负责那些分子的特征化学反应的原
子基团。
[0048]如本文单独或组合使用，术语“杂烷基”是指包含含有I至20个通过单键专门连接原子的直链或支链烃官能团，其中链中的至少一个原子为碳，并且链中的至少一个原子为
0、S、N或它们的任何组合。杂烷基可以是完全饱和的，或包含I至3的不饱和度。非碳原子可以在杂烷基的任何内部位置，并且最多两个非碳原子可以是连续的，例如-CH2-NH-0CH3。此外，非碳原子可以任选地为氧化的，并且氮可以任选地为季铵化的。
[0049]如本文单独或组合使用，术语“杂芳基”是指包含具有3至12个原子的共轭环状分子环状结构的取代的或未取代的芳香烃官能团，其中环状结构中的至少一个原子为碳，并且环状结构中的至少一个原子为O、S、N或它们的任何组合。杂芳基可以是单环的、双环的或多环的，并且可以任选地包括一至三个另外的环状结构，例如芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基。杂芳基的例子包括(但不限于):吖啶基、苯并吲哚基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并二噁英基、二氢苯并二噁英基、苯并间二氧杂环戊基、1，3_苯并间二氧杂环戊基、苯并呋喃基、苯并异噁唑基、苯并哌喃基、苯并苯硫基、苯并[c]苯硫基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、咔唑基、色氧代、噌啉基、氢!增琳基、香ii素基、苯并咲喃基、咲喃并批唳基、咲喃基、喷嚷基、喷噪基、氢^引哚基、咪唑基、喷唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异二氢吲哚基、二氢异吲哚基、异喹啉基、二氢异喹啉基、异噁唑基、异噻唑基、噁唑基、噁二唑基、邻二氮菲基、啡啶基、嘌呤基、哌喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯啉基、吡咯基、吡咯并吡啶基、喹啉基、喹噁啉基、喹唑啉基、四氢喹啉基、四唑并哒嗪基、四氢异喹啉基、苯硫基、噻唑基、噻二唑基、噻吩并吡啶基、噻吩基、苯硫基、三唑基、咕吨基等等。
[0050]如本文单独或组合使用，术语“低级杂芳基”是指包含具有3至6个原子的共轭环状分子环状结构的单环或双环取代的或未取代的芳香烃官能团，其中环状结构中的至少一个原子为碳，并且环状结构中的至少一个原子为O、S、N或它们的任何组合。
[0051]如本文单独或组合使用，术语“羟基”是指羟基(-0H)官能团。
[0052]如本文单独或组合使用，术语“氧代”是指官能团=0。
[0053]如本文所用，术语“脊椎动物”包括所有活脊椎动物，例如(但不限于):哺乳动物、人类、鸟、狗、猫、牲畜、家畜、自由放养群等。
【具体实施方式】
[0054]本发明提供识别使病毒处理的焦点从病毒蛋白的靶向转向靶向和增强宿主(患者)先天抗病毒响应药物的开发的化合物的方法。此类化合物和方法可能更有效，对病毒耐药性出现的灵敏度更低，导致的副作用更少，并且对不同病毒的范围更有效(I)。
[0055]RIG-1通路密切参与调节RNA病毒感染的先天免疫应答。RIG-1是触发多种RNA病毒的免疫性的关键胞质病原体识别受体(5-8)。RIG-1是结合以尿苷的均聚序列表征的RNA病毒基因组内基序或聚合物U / A基序的双链RNA解旋酶(9)。结合RNA通过自体同源阻遏蛋白域诱导可减轻RIG-1信号转导抑制的构象变化，从而允许RIG-1通过其串联半胱天冬酶活化和募集域(CARD)向下游转导信号(4)。RIG-1信号转导取决于其NTP酶活性，但不需要解旋酶域(10，11)。RIG-1信号转导在静息细胞中沉默，并且阻遏蛋白域作为控制响应病毒感染的信号转导的通断开关(8)。
[0056]RIG-1信号转导通过位于线粒体外膜的关键接头蛋白IPS-1 (也称为Cardif、MAV和VISA)转换(12-15)。IPS-1募集刺激下游IRF-3活化的大分子信号转导复合物，IRF-3是诱导I型IFN和控制感染的病毒响应基因表达的转录因子(16)。直接或通过RIG-1通路组分，包括IRF-3的调节触发RIG-1信号转导的化合物提供引人注目的抗病毒药或免疫调节剂治疗应用。
[0057]RIG-1信号转导是抗病毒物的靶标，其导致信号转导组分的分解，并且导致阻止病毒清除和促进持续感染的先天免疫信号转导下调。如本文所用，抗病毒物是指任何在细胞内产生效果，包括抑制一种或多种细胞反病毒活性的病毒蛋白、核酸或结构。RNA病毒利用下表1中列出的多种反病毒机制。
【权利要求】
1.一种治疗脊椎动物中病毒感染的方法，所述方法通过在存在一种或多种抗病毒物的情况下，给所述脊椎动物提供调节RIG-1通路的活性的化合物进行，其中所述化合物由包括以下步骤的方法识别:(a)在存在一种或多种抗病毒物的情况下，提供包含在启动子控制下的报告基因的细胞；(b)使所述细胞与推测RIG-1通路调节化合物接触；(c)测量报告基因的表达；以及(d)在存在一种或多种抗病毒物的情况下，选择活化报告基因表达高于所选择阈值的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒感染是RNA病毒的感染。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是人流感病毒(甲型、乙型或丙型)、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒、SARS-冠状病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、克沙奇病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人变异流行性感冒病毒1-4、人呼吸道合胞病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、登革热病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒或圣路易斯脑炎病毒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中给所述脊椎动物提供至少一种另外的抗病毒药剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述另外的药剂以所述化合物相同的药物组合物的部分，或与所述化合物分开提供。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述药剂是PEG干扰素a_2a、PEG干扰素a_2b、病毒唑、奥司他韦、扎那米韦、金刚胺和/或金刚乙胺。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的所述选择的阈值高于对照水平四个标准偏差。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述化合物经结构选择，用于预测RIG-1的配体结合域的结合。``
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是U20S细胞、PH5CH8细胞、HeLa细胞、H印2细胞、MRC5细胞、A549细胞或Huh7细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述识别的化合物具有如下结构:
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗病毒物为NS3/ 4a、3ABC、V蛋白、NS1、NS2 和 / 或 VP35。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述脊椎动物是人、鸟、狗、猫或家畜。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告基因是荧光素酶。
14.一种识别在存在一种或多种抗病毒物的情况下调节RIG-1通路的活性的化合物的方法，所述方法包括如下步骤:(a)在存在一种或多种抗病毒物的情况下，提供包含在启动子控制下的报告基因的细胞；(b)使所述细胞与推测RIG-1通路调节化合物接触；(c)测量报告基因的表达；以及(d)在存在一种或多种抗病毒物的情况下，选择活化报告基因表达高于所选择阈值的化合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(d)的所述选择的阈值高于对照水平四个标准偏差。
16.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述化合物经结构选择，用于预测RIG-1的配体结合域的结合。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞是U20S细胞、PH5CH8细胞、HeLa细胞、H印2细胞、MRC5细胞、A549细胞或Huh7细胞。
18.根据权利要求14 所述的方法，其中所述识别的化合物具有如下结构:
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗病毒物为NS3/ 4a、3ABC、V蛋白、NS1、NS2 和 / 或 VP35。
20.一种响应于仙台病毒暴露而表达在启动子控制下的荧光素酶以及在Tet抑制元件的控制下的抗病毒物的细胞。
【文档编号】A61K48/00GK103491965SQ201280020298
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月23日 优先权日:2011年2月25日
【发明者】肖恩·P·艾度纳托, 克里斯廷·贝达德 申请人:奇尼塔公司