用于药物组合物的巨噬细胞活化因子的制作方法

用于药物组合物的巨噬细胞活化因子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含巨噬细胞活化因子（MAF）的药物组合物和产生所述药物组合物的方法，特别涉及基本不含糖苷酶的MAF组合物。本发明的组合物和包含所述组合物的药物组合物特别适用于静脉内给药。这样，根据一个方面，本发明提供了一种包含Gc蛋白来源的巨噬细胞活化因子（GcMAF）的组合物，其中所述组合物基本上不含糖苷酶。
【专利说明】用于药物组合物的巨噬细胞活化因子
发明领域
[0001]本发明涉及包含Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)的药物组合物和产生所述药物组合物的方法，特别涉及基本不含糖苷酶的GcMAF组合物。
[0002]发明背景
[0003]发炎导致巨噬细胞活化，引起免疫反应过程的进展。发炎引起的巨噬细胞活化需要B和T淋巴细胞和血清维生素D结合蛋白(DBP)的参与。
[0004]人维生素D结合蛋白，也称为“组-特异性成分”或“Ge蛋白”，是一种显示遗传多态性的进化上保守的糖蛋白。它是一种血浆蛋白，具有大约52，000的相对分子量，通常构成人血浆蛋白的大约0.5%。凝胶电泳分析可表明Ge蛋白的多态性，显示两个主要表型:Gcl和Gc2 (Hirschfeld等人，1960.Naturel85:931)。已经报告了 Gcl和Gc2基因的整个核苷酸编码序列，和所预测的氨基酸序列(Cooke等人，1985.J.Clin.1nvest.76:2420 ；Yang等人，1985.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:7994)。Gcl 又分成 Gclf 和 Gcls 亚型，因为存在一个氨基酸残基的变异，两个亚型在电泳上作为两条带迁移(“快”和“慢”)。
[0005]Gcl蛋白是人Ge蛋白的主要亚型。它携带一个分支的三糖，该三糖由连接于核心蛋白的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)构成，具有半乳糖和唾液酸(在Gclf中)的末端，或者半乳糖和甘露糖(在Gcls中)的末端。Gc2具有简单的糖基化模式，有一个核心GalNAc连接到末端半乳糖部分。Gclf寡糖被炎症引起的B细胞的膜β-半乳糖苷酶水解，产生巨噬细胞促活化因子，该因子接着被T细胞的唾液酸酶(也称为神经氨酸苷酶)水解，产生巨噬细胞活化因子(MAF) (Yamamoto 等人，1991.Proc.Nail.Acad.Sc1.USA88:8539-8543 ；Yamamoto和 Kumashirol993.1mmunol, 151:2794—2902 ；Naraparaju 和 Yamamoto 1994.1mmunol.Lets43:143-148)。小鼠DBP携带一个二糖，该二糖由N-乙酰半乳糖胺和半乳糖末端构成。该二糖被单独的B细胞β-半乳糖苷酶水解，产生活性MAF。这样，小鼠DBP和人Ge蛋白是MAF的前体。
[0006]本发明的发明人的美国专利号5，177,002公开了通过用糖苷酶处理糖基化的维生素D结合蛋白来体外产生活性巨噬细胞活化因子的方法。Ge蛋白的表型Gcl和Gc2以及Gcl亚型Gclf和Gcls,尤其表现为连接于Ge分子的多肽部分的寡糖的差异。通过与β -半乳糖苷酶和唾液酸酶(也称作神经氨酸苷酶)的组合温育，或与半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶的组合温育，从Gclf或Gcls蛋白有效地产生了巨噬细胞活化因子。如果Gcls至少部分包含Gcls变体Gcls*，后者含有唾液酸(N-乙酰基-D-神经氨酸或“NeuNAc”)代替α -甘露糖，用来处理Gcls/Gcls*混合物的酶混合物还包括唾液酸酶。单独用β -半乳糖苷酶处理Gc2蛋白有效地产生了巨噬细胞活化因子。这样，5，177，002专利公开了在没有完整B和T细胞的情况下，Ge蛋白向巨噬细胞活化因子的有效体外转变，从而产生命名为GcMAF的高度活性的因子。
[0007]对传统治疗形式有抗性的转移瘤的无控制生长是来自癌症的死亡的主要原因。转移来自预先存在于原发性肿瘤 中的特化恶性细胞的非随机传播。这些转移在来源上可以是无性系的，不同的转移可以来源于不同的祖细胞。另外，与良性非转移细胞相比，转移细胞可以展现增高的自发突变率，这解释了多个转移瘤对于同样的治疗形式可以展现不同敏感性的临床观察结果。这样对于扩散转移的成功治疗应规避肿瘤异质性和抗性发展的问题。
[0008]适当活化的巨噬细胞能满足这些苛刻的标准。通过与包含免疫调节剂的磷脂囊(脂质体)的相互作用，巨噬细胞可被活化而变成杀肿瘤的。杀肿瘤的巨噬细胞能在体外和体内识别和破坏肿瘤细胞，而不伤害非肿瘤细胞。虽然巨噬细胞区分肿瘤发生细胞和正常细胞的准确机制是未知的，该机制是独立于肿瘤细胞特征的，例如免疫原性、转移潜力和对细胞毒性药物的敏感性。而且，巨噬细胞对于肿瘤细胞的破坏明显与肿瘤细胞抗性的发展不相关。另外，活化的巨噬细胞对于形成相对于细菌和病毒入侵的免疫应答是必要的。因为在三种应答(杀肿瘤、杀菌、杀病毒)中，活化机制是相同的，巨噬细胞活化在宿主免疫应答中具有应用，对抗肿瘤、细菌和病毒的挑战。
[0009]研究已经表明，GcMAF在小鼠模型中对于一种埃利希(Ehrlich)腹水肿瘤的治疗具有杀肿瘤作用(Yamamoto等人，1997.Cancer Res.57:2187 - 2192 ;Koga等人，1999.ProcSoc Exp Biol Med.220:20 - 26)。在鳞状细胞癌的小鼠模型中，将GcMAF作为光动力治疗的辅助免疫治疗施用，显示了对于小鼠中肿瘤治愈的协同效应(Korbelik等人.1997.Br JCancer75:202 - 207)。在两种肿瘤模型中，假设GcMAF通过活化巨噬细胞发挥其作用，然后后者直接攻击肿瘤细胞。又有证据表明，GcMAF部分通过抗血管生成的机制而具有抗肿瘤发生性(Kisker等人，2003.Neoplasia5 (I): 32 - 40)。在所有模型中，均观察到GcMAF作为抗肿瘤发生性治疗的高效力。 [0010]美国专利申请公布号2011/0123591公开了通过使用体外系统通过巨噬细胞活化在哺乳动物中诱导杀肿瘤、杀细菌或杀病毒应答的方法。该系统包含将哺乳动物血液的白细胞组分与GcMAF或从Ge蛋白前体中产生内源性GcMAF的一种或更多酶相接触的方法。或者，该系统包含固定在惰性介质上的ct -N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)-结合配体,该惰性介质与哺乳动物的血浆接触，这样降低Nagalase的水平。
[0011]MAF的前体，即糖基化Ge蛋白，可自血液来源纯化。或者，Ge蛋白或者其负责巨噬细胞活化的小结构域可以运用重组方法进行生产，例如，如本发明的发明人的美国专利号6，410，269所公开的。不依赖于Ge蛋白来源，为了获得上文所描述的巨噬细胞活化因子，Ge蛋白应被部分去糖基化。5，177，002专利公开了固定酶的使用，将反应混合物通过适当的截止滤器，以避免糖苷酶污染最后制备物。未提供选择固定方式的任何特别指导原则，活化的琼脂糖珠为优选实施方案。
[0012]截至今天，GcMAF的使用被限制于离体治疗，或者限制于肌肉内给药以避免不良副作用，副作用的产生明显是因为组合物中存在根据前面公开的程序产生的污染蛋白。
[0013]因为已经确定了 GcMAF作为免疫缺陷疾病(例如AIDS)、不同类型的癌症、病毒感染和骨硬化病的有效疗法的潜力，使GcMAF组合物免于蛋白污染并适于静脉内注射将非常有利。
[0014]发明概述
[0015]本发明涉及治疗性的Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)组合物和产生所述组合物的方法。
[0016]本发明的教导克服了迄今公开的GcMAF组合物的缺点，后者被发现含有用来将Ge蛋白转化为巨噬细胞活化因子的糖苷酶的残留物，这样，当药物性施用特别是静脉内给药时，可能会引起不良反应 。
[0017]本发明部分基于未预期的发现，即，从将Ge蛋白源与固定在聚半乳糖基树脂(例如，琼脂糖珠)的β -半乳糖苷酶接触所获得的GcMAF制备物含有有害量的β -半乳糖苷酶。无意于被任何特定理论或作用机制所束缚，GcMAF组合物中发现的糖苷酶残留物的存在可能是由于固体支持物被附着于其的糖苷酶消化的现象。
[0018]这样，根据一个方面，本发明提供了含有Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)的组合物，其中所述组合物基本上不含糖苷酶。
[0019]在此使用的术语“基本上不含糖苷酶”指的是含有少于组合物总蛋白含量的3%的糖苷酶、典型地少于2%或1%、更典型地少于所述组合物的总蛋白含量的0.5%或0.2%的组合物。
[0020]根据一些实施方案，GcMAF包含维生素D结合蛋白(Ge蛋白)、或者具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的其活性片段。
[0021]术语“维生素D结合蛋白”和“Ge蛋白”在此互换使用，指的是该糖蛋白和其遗传变体的所有多态形式，包括Gc2、Gcl、和亚型Gclf、Gcls和Gels*。此处使用的术语“其活性片段”指的是Ge蛋白的具有连接到氨基酸残基的末端N-乙酰半乳糖胺基团，能够活化巨噬细胞的任何部分。
[0022]根据一些实施方案，Ge蛋白片段包含对应于所有成熟Ge蛋白多态形式的氨基酸400-435的氨基酸序列。根据其他的实施方案，Ge片段是对应于成熟蛋白的氨基酸375-458的Ge蛋白结构域III。
[0023]根据一些实施方案，Ge蛋白包含选择自由SEQ ID NO: 1-3 (分别为Gclf、Gcls和Gc2)组成的组的氨基酸序列。根据这些实施方案，N-乙酰半乳糖胺基团连接到成熟Ge蛋白的位置418的氨基酸苏氨酸或位置420的氨基酸苏氨酸。
[0024]根据其他实施方案，对应于成熟Ge蛋白的氨基酸375-458的Ge片段结构域III，由SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5中所列出的氨基酸序列组成。根据该实施方案，N-乙酰半乳糖胺连接到位置44的氨基酸苏氨酸或位置46的氨基酸苏氨酸。
[0025]根据一些实施方案，分离的维生素D结合蛋白或其任何部分纯化自人血清。根据其他实施方案，分离的维生素D结合蛋白或其负责巨噬细胞活化的小结构域可运用重组系统由克隆的多核苷酸产生。
[0026]从混合介质(composition medium)中去除将Ge蛋白转化为巨卩遼细胞活化因子的糖苷酶可由本领域技术人员所知的任何方法来进行，所述方法包括但不限于，亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤。根据一些典型实施方案，这些酶被固定在固相上，特别是没有酶底物的固相。
[0027]将这些酶固定在固体支持物上有数个优点，包括将酶从想得到的蛋白质中简单分离开。本发明现在公开，使用没有酶底物的固相防止可溶性酶释放入反应介质中，有利于将不期望的酶从最终组合物中移除。
[0028]这样，根据另外的方面，本发明提供了产生基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物的方法，该方法包括(a)将Ge蛋白或者其活性片段在体外与糖苷酶β -半乳糖苷酶或者与β-半乳糖苷酶和至少一种另外的糖苷酶的组合相接触，其中每种糖苷酶都固定在不含所述酶底物的固相上，以获得Ge巨噬细胞活化因子(GcMAF);和(b)将所固定的酶从GcMAF组合物中移除，从而获得基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物。
[0029]根据一些实施方案，另外的糖苷酶选自由甘露糖苷酶和唾液酸酶组成的组。
[0030]根据一些实施方案，Ge蛋白是Gclf，且与半乳糖苷酶和唾液酸酶(神经氨酸苷酶)接触。
[0031]根据一些实施方案，该方法还包括将含有GcMAF的组合物进行离子交换层析。根据典型的实施方案，层析为阴离子交换层析，使用，例如Q-琼脂糖柱。根据可选的实施方案，该方法还包括将GcMAF组合物进行疏水作用层析，例如苯基琼脂糖柱。根据其他的实施方案，该方法还包括离子交换层析与疏水作用层析的组合。 [0032]根据一些实施方案，β_半乳糖苷酶固定在包含丙烯酸珠的固相上。根据特别的实施方案，固相为亲水性丙烯酸珠。
[0033]根据一些实施方案,表型Gd、亚型Gclf的Ge蛋白，与固定的β_半乳糖苷酶和固定的唾液酸酶接触，以提供巨噬细胞活化因子。根据其他的实施方案，表型Gd、亚型Gcls的Ge蛋白，如所需地与固定的β_半乳糖苷酶和至少一种固定的另外的糖苷酶接触。根据一些典型实施方案，表型Gd、亚型Gcls的Ge蛋白，与β -半乳糖苷酶和甘露糖苷酶和唾液酸酶的组合相接触，每种酶都固定在不含酶底物的固相上，以确保含有唾液酸代替α -甘露糖的Gcls变体(h Gcls*)的转换。根据另外的实施方案，表型Gc2的Ge蛋白与所固定的单独半乳糖苷酶接触，以形成巨噬细胞活化因子。
[0034]根据另一个方面，本发明提供根据以上描述的方法制备的巨噬细胞活化因子。根据一些实施方案，所述巨噬细胞活化因子基本上不含糖苷酶。
[0035]根据另外的方面，本发明提供一种药物组合物，包含治疗有效量的本发明的巨噬细胞活化因子，并还包含药学上可接受的稀释剂或载体。根据优选的实施方案，药物组合物被配制用来静脉内给药。
[0036]根据又另外一个方面，本发明提供了在有此需要的个体中诱导巨噬细胞活化的方法，包含向所述个体施用本发明的含巨噬细胞活化因子的药物组合物。
[0037]根据又另外一个方面，本发明提供了治疗癌症或HIV感染患者的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的含GcMAF的药物组合物。
[0038]根据一些实施方案，以100_500ng/注射的剂量给予GcMAF。
[0039]根据一些实施方案,癌症与α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(alpha-N-acetylgalactosaminidase) (Nagalase)水平升高相关。根据其他的实施方案,癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、头/颈癌、脑癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、纤维肉瘤、间皮瘤、白血病和黑色素瘤。
[0040]本发明的其他目的、特征和优点将从下文的详述和附图中变得明显。
[0041]发明详述
[0042]本发明提供了包含Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子的治疗组合物。本发明的组合物比迄今已知的组合物具有优势，不含污染性的酶并适于静脉内给药。
[0043]Ge蛋白，也称为维生素D结合蛋白，是一种包含附着有特定寡糖的多肽的血清因子。用特异性的糖苷酶逐步移除一定的寡糖，导致将Ge蛋白转化为高度有效的巨噬细胞活化因子(MAF)，如本发明的发明人的美国专利号5，177，002所公开，通过引用全文并入本文。[0044]人Ge蛋白可用本领域技术人员所知的任何方法从血清中纯化。根据一些实施方案，用于本发明方法的高纯度Ge蛋白根据Link等人(1986.Anal.Biochem.157:262)的程序使用25-羟基维生素D3-琼脂糖亲和层析分离自血清。Ge蛋白也可根据Haddad等人(1984.Biochem.J.218:805)的程序通过肌动蛋白-琼脂糖亲和层析进行纯化，后者利用Ge蛋白对肌动蛋白的结合特异性。[0045]可选地，Ge蛋白可从编码人Ge蛋白或Ge蛋白小结构域(结构域III)的克隆cDNA获得。Ge蛋白和Ge结构域III的克隆和表达描述于本发明的发明人的美国专利号6，410，269，通过引用全文并入本文。其中描述的方法采用噬菌体λ gtll中的人肝cDNA文库(Clontech，Palo Alto，CA)，以分离编码人Ge蛋白的全长cDNA，并使用昆虫细胞中的杆状病毒表达系统进行蛋白质表达。然而，应明确理解本领域所知的任何方法/系统能被用于表达编码Ge蛋白或其活性部分的cDNA，包括细菌、昆虫和哺乳动物细胞系统。根据一些实施方案，在真核细胞中进行表达，使得Ge蛋白或其活性结构域被正确糖基化。可以使用本领域所知的任何这样的细胞系统，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞、人胚肾HEK293细胞和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。因此,可以使用任何真核表达载体，包括但不限于，pC1-NE0、pWE3、pcDNA3.1和pCM182。将载体插入选择的细胞系统可以如下进行，例如，通过电穿孔，脂类例如TransFectin或本领域技术人员所知的化学方法，伴随或不伴随扩增。转染可以导致瞬时或稳定的表达，两种方式均足以获得所要的Ge蛋白或其部分。根据本发明的教导，所表达的蛋白是活性MAF的前体，可以通过本领域所知的任何方法从细胞中提取或从生长培养基中采集。
[0046]这里所用的术语“Ge蛋白”或“维生素D结合蛋白”指的是所有基因型，包括Gc2、Gd、以及亚型Gclf、Gcls和Gcls*和其活性变体和片段。这里所用的“活性” Ge蛋白或其片段指的是能够激活巨噬细胞的Ge蛋白，尤其是具有连接至氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的Ge蛋白或其片段。
[0047]根据一些实施方案，Ge蛋白包含选自由SEQ ID NO: 1-3 (分别为Gclf、Gcls和Gc2)组成的组的氨基酸序列。根据这些实施方案，N-乙酰半乳糖胺基团连接至成熟Ge蛋白位置418的氨基酸苏氨酸或位置420的氨基酸苏氨酸。
[0048]根据一些实施方案，Ge蛋白片段包含对应于所有成熟Ge蛋白多态形式的氨基酸400-435的氨基酸序列。根据其他的实施方案，Ge片段是对应于成熟蛋白的氨基酸375-458的Ge蛋白结构域III。
[0049]根据其它的实施方案，对应于成熟Ge蛋白的氨基酸375-458的Ge片段结构域111由SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5中所列出的氨基酸序列组成。根据该实施方案，N-乙酰半乳糖胺连接到位置44的氨基酸苏氨酸或位置46的氨基酸苏氨酸。
[0050]当巨噬细胞被激活时，它具有清除癌症细胞和HIV-感染细胞的潜力。GcMAF被酶α-Ν-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)的去糖基化阻止它激活巨噬细胞并因此抑制细胞免疫应答。已提出在HIV感染的患者中，有缺陷的抗原呈递是免疫缺陷中的一个因素。HIV患者血浆中升高的Nagalase的存在表明在这些患者中巨噬细胞激活可能被抑制。另外，Nagalase已被显示是感染起始促进融合的包膜蛋白的内在成分。全身性红斑狼疮患者中的Nagalase的血浆浓度也被发现升高。在狼疮中，自身抗体形成病理性免疫复合体并沉积在组织中。如果巨噬细胞激活被阻断，会抑制这些复合体被巨噬细胞的清除。已显示癌细胞产生Nagalase，血清中升高的浓度已被记录于许多患黑色素瘤、前列腺癌、结肠直肠癌、转移性乳腺癌的癌症患者中。给予这样的患者外源性GcMAF可以因此克服由于Nagalase的升高浓度而引起的活性巨噬细胞的不足。事实上，GcMAF已被显示直接作用并激活癌症患者、HIV感染患者和骨硬化病(osteoperotic)患者的巨噬细胞或破骨细胞，初步临床试验显示GcMAF对于数种人类癌症的治愈效应(例如，Pacini S.等人,2012.AnticancerRes.; 32 ⑴:45-52 !Gregory KJ 等人 2010.PLoS One.20105 (10): el3428)。
[0051]为了适于药用，特别当配制为用于静脉内注射时，GcMAF组合物应满足无毒并且被人高度耐受的精细要求。
[0052]因此，要求用来将Ge蛋白或其结构域III转化为活化MAF的糖苷酶以及其它潜在污染物应被从MAF组合物中移除。
[0053]根据一个方面，本发明提供包含Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)的组合物，其中所述组合物基本上不含糖苷酶。
[0054]根据另外的方面，本发明提供产生基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物的方法，该方法包括(a)将Ge蛋白或其活性片段在体外与糖苷酶β-半乳糖苷酶或与β-半乳糖苷酶和至少一种另外的糖苷酶的组合接触，其中每种糖苷酶固定在不含所述酶底物的固相上，以获得Ge巨噬细胞活化因子(GcMA F );和(b )将所固定的酶从GcMAF组合物中移除，从而获得基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物。
[0055]移除糖苷酶可由本领域已知的任何方法来进行。根据本发明的一些典型实施方案，Ge蛋白或其部分与酶接触，其中酶固定在固相上，其中固相不含酶底物。特别重要的是将β_半乳糖苷酶固定在不含半乳糖的固相上。本发明现在公开，β_半乳糖苷酶在将Ge蛋白活化为MAF所要求的温育时间期间被从琼脂糖固相中释放出来。这样，当在迄今公开的方法中将固定的半乳糖苷酶从组合物中移除时，可溶性酶或其残留物仍然能污染组合物。
[0056]根据一些实施方案，包含GcMAF的本发明的组合物包含少于所述组合物的总蛋白含量3%的糖苷酶。根据其它的实施方案，组合物含有少于组合物的总蛋白含量的2%、典型地少于1%、更典型地少于0.5%或0.2%。每一种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。如此处所使用，术语“总蛋白含量的总蛋白的百分比(％)”指的是总蛋白含量中的糖苷酶的
重量/重量百分比。
[0057]根据一些实施方案，根据本发明的教导，β_半乳糖苷酶的固定固相不含糖苷酶底物，由能够结合酶的丙烯酸珠组成。数种市场上能买到的树脂可被用于糖苷酶的固定，所述树脂包括但不限于Profinity环氧化物(Biorad) ;FractOgel?环氧基树脂(Merck);和Eupergit? (BioChemika, Sigma)。
[0058]除了半乳糖苷酶，至少一种另外的糖苷酶可被使用，取决于Ge蛋白基因型。为了激活Gclf蛋白，β-半乳糖苷酶和唾液酸酶被用于将Gclf转化为GcMAF。为了激活Gcls蛋白，半乳糖苷酶和甘露糖苷酶被用于将Gcls转化为GcMAF。除了 β-半乳糖苷酶以外，每种另外使用的酶可 以固定在固相上。根据本发明的教导，为了避免在最终组合物中存在甘露糖苷酶和/或唾液酸酶，甘露糖苷酶和唾液酸酶中每一种酶均固定在不含酶底物的基质上。
[0059]根据一些实施方案，甘露糖苷酶或唾液酸酶固定在基于琼脂糖的珠上。[0060]可选地以及另外，可溶或者固定的糖苷酶通过将酶从期望GcMAF蛋白质中分离的几种层析技术和/或过滤和/或沉淀和/或离心，从所述GcMAF组合物中被移除。
[0061]典型的层析技术包括通过大小(尺寸排阻，也称作凝胶过滤)；通过电荷(离子交换层析)，通过疏水性(疏水作用层析和反相层析)和通过生物识别(亲和层析)分离。
[0062]根据一些实施方案，该方法还包括将含有GcMAF的组合物通过离子交换层析。根据典型的实施方案，层析是阴离子交换层析。可使用不同类型的阴离子交换树脂，包括 DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex> DEAE-Sephacel> DEAE-纤维素、DEAE-Sepharose>Q-sepharose 等等。
[0063]本发明现在公开，将GcMAF组合物通过阴离子交换层析还导致活性GcMAF从非活性形式中分离。这样，本发明提供了实现活性GcMAF从不同来源中高产量分离和纯化的方法。
[0064]根据一些实施方案，阴离子交换树脂为Q-Sepharose。不同的条件可被用于该特定步骤中。根据一些实施方案，阴离子交换树脂首先用PH在4.5-9.5、传导率低于12.0mS/cm的缓冲溶液平衡。树脂被平衡后，含有GcMAF的级分通过稀释被调整至离子强度低于12mS/cm,并被加载在阴离子交换树脂上。pH和传导率的这些条件允许GcMAF保留在柱上，同时洗涤阴离子交换介质。洗涤缓冲液(pH范围在4.5-9.5之间)的传导率在洗涤过程中增加。这种增加提供适合的条件，使得没有GcMAF在流通液(flow through)中被丢弃,从而得到最大GcMAF产量。
[0065]然后GcMAF从柱上被洗脱。根据一些实施方案，使用pH在4.5-9.5，传导率高于3mS/cm的缓冲溶液进行洗脱。
[0066]根据其它的实施方案，该方法还包括将GcMAF组合物通过疏水作用层析，例如苯基琼脂糖柱。
[0067]根据一些实施方案，疏水作用树脂是苯基琼脂糖。不同的条件可被用于该特定步骤。根据一些实施方案，疏水作用树脂首先用PH在4.5-9.5、传导率高于15.0mS/cm的缓冲溶液平衡。树脂被平衡后，含有GcMAF的级分通过稀释被调整至离子强度高于15.0mS/cm,并被加载在疏水作用树脂上。PH和传导率的这些条件允许GcMAF保留在柱上，同时洗涤疏水作用介质。洗涤缓冲液(pH范围在4.5-9.5之间)的传导率在洗涤过程中降低。这种降低提供适合的条件，使得没有GcMAF在流通液中被丢弃，从而得到最大GcMAF产量。
[0068]然后GcMAF从柱上被洗脱。根据一些实施方案，使用pH在4.5-9.5、传导率低于25mS/cm的缓冲溶液进行洗脱。
[0069]本发明的组合物的无菌性是主要关注事项，因为产物将要因治疗目的被施用于人，特别是通过静脉内给药。虽然对血清来源材料通常检查了污染病毒的存在，并尽很大努力去排除污染的供体级分，有需要进一步确保该方法的最终产物是无病毒的。
[0070]因此，本发明的方法可还包括病毒移除和/或病毒失活步骤。可通过几种方法完成病毒减少，包括纳米过滤；溶剂/清洁剂处理；碘失活，例如，用碘化的离子交换基质材料例如碘化的SEPHADEX?进行处理(如PCT申请W097/48422和W097/48482所公开)；用病原体失活化合物进行处理；热失活，Y照射；或任何其他适合的杀病毒方法。
[0071]脂质包被病毒被非离子生物相容性溶剂和清洁剂有效失活。描述了通过溶剂-清洁剂应用进行病毒失活的方法，例如，在EP0131740中。然而，非-脂质包被的病毒不能通过溶剂-清洁剂处理被失活，这样，不得不使用其它失活方法来进行其失活，包括通过物理方式排除，例如，将组合物通过非常小孔径的滤器进行过滤，以通过尺寸排阻移除病毒(纳米过滤)。
[0072]在将糖苷酶从活性GcMAF中分离和病毒移除以后，可通过传统的方法，例如透析过滤、超滤、冻干法等，或它们的组合，来处理溶液以降低其水含量并改变离子组成。
[0073]根据一些实施方案，包含纯化GcMAF的组合物以PBS缓冲液通过超滤进行透析，MWCO在5-50kDa之间。然后用PBS将GcMAF蛋白稀释至其终浓度，通过0.1或0.2 μ m的膜进行过滤，以获得无菌的GcMAF组合物。
[0074]根据另外的方面，本发明提供包含治疗有效量的本发明的巨噬细胞活化因子，并包含药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。根据优选的实施方案，药物组合物配制为用于静脉内给药。
[0075]如这里所使用，术语“治疗有效量”指的是蛋白或蛋白制剂或组合物在其给药的活生物体内经一段时间有效治疗病症的量。
[0076]本发明的药物组合物可通过本领域熟知的方法进行生产，例如，通过传统混合、溶解、制粒、研磨、粉碎、糖衣制作、磨细、乳化、封装、捕获或冻干过程进行生产。药物组合物的目的是有利于将化合物向生物体的施用。
[0077]这样，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种包括辅料和助剂的可接受的稀释剂或载体以传统方式配制，这些辅料和助剂有利于将活性化合物加工为可被药用的组合物。适当的制剂依赖于所选择的给药途径。根据典型的实施方案，本发明的药物组合物配制为用于静脉内给药。
[0078]为了静脉内注射，本发明的化合物可用水溶液配制，优选使用生理性相容的缓冲液，例如Hank溶液、Ringer溶液、或生理盐水缓冲液。含水注射混悬剂可以包含增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，混悬液也可以含有合适的稳定剂或试剂来增加化合物的稳定性和可溶性，并允许高度浓缩溶液的组合物。
[0079]可选地，活性成分可以是粉末形式，以使用适合的媒介物例如无菌无热原水在使用前重构。
[0080]在本发明的情形下适合使用的药物组合物包括其中包含可达到预期目的的有效量的活性成分的组合物。更具体地说，治疗有效量意味着可有效预防、减轻或改善被治疗的受试者的疾病症状的化合物的量。
[0081]确定治疗有效量是本领域技术人员能力范围内的。根据一些实施方案，以100-500ng/注射的剂量给予GcMAF。技术人员可根据与待被治疗的特定疾病和阶段以及受治疗个体的特征(年龄、大小、性别，等)相关的参数来确定给药方案。
[0082]这里描述的化合物的毒性和治疗有效性可由细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，通过确定根据本发明的GcMAF化合物的IC50(提供50%巨噬细胞活化的浓度)和LD50 (在50%受试动物中引起死亡的致死剂量)。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可被用于配制一系列的人用剂量。剂量可以依赖于使用的剂型和利用的给药途径而变化。可由个体医生根据患者的情况选择确切的剂型、给药途径和剂量(见例如，Fingl 等人，1975,于 〃The Pharmacological Basis of Therapeutics' Ch.1p.1 中)。
[0083]依赖于待治疗病症的严重性和响应性，可确定给药方案。根据一些实施方案，本发明的包含GcMAF的药物组合物通过静脉内注射给药，每周一次，共几周。给药也可以是慢释组合物的单独给药，治疗过程持续几天到几周，或者直到实现治愈或达到减小疾病状态。
[0084]当然，将给药的组合物的量依赖于被治疗的受试者、病痛的严重性、给药方式、开处方医师的判断、等等。
[0085]提供下列实施例以更充分地阐明发明的一些实施方案。然而，它不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员能容易地设计此处公开的原则的许多变化和修改，而不偏离本发明的范围。
实施例
[0086]实施例1:GcMAF产牛
[0087]第I步:富集-用硫酸铵沉淀 [0088]从健康供血者处获得血液。每一血样的Ge蛋白类型在PCR反应中使用特异性引物来确定，并进一步通过质谱分析法进行确定。由BioGlobe GmbH Hamburg, Germany基于Abbas 等人 2008 年(Cancer Epidemiol Biomarkers Prevl7:1339-1343)描述的方法进行分型。将Gclf等位基因纯合的供血者样品取出进行进一步处理。在2009年筛查的50例样品中的I例，以及2010年筛查的105例样品中的7例被鉴定为Gclf纯合子。
[0089]从血液样品中分离出血清级分,Ge蛋白通过70%硫酸铵(AS )从血清中被沉淀。在离心后，将沉淀蛋白溶于PBS中，并在pH约7.0-7.6的相同缓冲液中透析。
[0090]第2步:捕获-维生素D-琼脂糖亲和柱
[0091]将蛋白加载在以TEST缓冲液(Tris、EDTA、盐水、Triton，pH7.4)预平衡的25-0H-维生素D亲和柱上。在用TEST缓冲液洗涤后，蛋白用6M GuHCl洗脱。汇集峰吸收值在280nm的级分,并用pH7.0的磷酸盐缓冲液透析。
[0092]第3步:钝化-羟某磷灰石梓
[0093]将蛋白加载在用pH7.0的磷酸盐缓冲液预平衡的羟基磷灰石柱上。在用相同缓冲液洗涤后，蛋白通过10-200mM的线性梯度的磷酸盐洗脱。汇集含有蛋白的级分。
[0094]第4步:Ge活化(GcMAF的制各)
[0095]将仅含Gclf型的汇集蛋白级分用与丙烯酸珠(Profinity Epoxide, BioRad)结合的β -半乳糖苷酶在ΡΗ7.4的PBS中在37°C处理I小时，伴随轻轻混合。结合至丙烯酸珠的酶以离心方式移除，并收集蛋白级分。接着，蛋白级分在0.1M NaAc2mM CaCl2pH5.0中在37°C下用结合至琼脂糖的神经氨酸苷酶处理I小时，伴随轻轻混合，结合的酶通过离心被移除。现在收集含有GcMAF的蛋白级分，通过0.22μπι的滤器进行过滤，并贮存在4°C。蛋白类型通过ELISA进行确认,并通过Bradford试验进行定量。
[0096]第5步:最终钝化
[0097]GcMAF在离子交换(IEX)柱(例如Q琼脂糖)和疏水作用层析(HIC)柱(例如苯基琼脂糖凝胶)上处理，以移除残留的污染的酶和未活化的Ge蛋白。然后通过测量糖苷酶活性和/或使用特异性抗体测量糖苷酶的存在，检查组合物为基本上不含糖苷酶。
[0098]第6步:配制
[0099]纯化的蛋白通过超滤在PBS中进行透析，MWCO在IOkDa到50kDa之间。然后蛋白用PBS稀释至其终浓度并为了灭菌通过0.2 μ m Millipore滤器进行过滤。[0100]前述具体实施方案的描述充分揭示了本发明的一般特性，以致他人在没有过多实验和不偏离一般概念的情况下，可通过应用现有的知识将容易修改和/或调整此具体的实施方案用于多种应用，且，因此，此类调整和修改应该并预期被包含在公开的实施方案的等同物的含义和范围内。将理解的是本文所采用的用语或术语是用于描述并不是限制的目的。用于实施多种公开的功能的手段、材料和步骤可采取多种可选的形式而不偏离本发明。
【权利要求】
1.一种组合物，其含有Ge蛋白来源的巨噬细胞活化因子(GcMAF)，其中所述组合物基本上不含糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物含有少于所述组合物的总蛋白含量中的3%的糖苷酶。
3.根据权利要求2所述的组合物，所述组合物含有少于所述组合物的总蛋白含量中的1%的糖苷酶。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述GcMAF包含具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的维生素D结合蛋白(Ge蛋白)或其片段。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述GcMAF包含SEQIDNO: 1-3中的任何一个所列出的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述N-乙酰半乳糖胺基团连接至在选自由位置418和位置420组成的组的位置的氨基酸苏氨酸。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述Ge蛋白片段包含对应于所述Ge蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述Ge片段由SEQID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所列出的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述N-乙酰半乳糖胺基团连接至在选自由位置44和位置46组成的组的位置的氨基酸苏氨酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述Ge蛋白或其片段是自血清中纯化。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述Ge蛋白或其片段是产生自克隆的多核苷酸。
12.—种用于产生基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物的方法，所述方法包含(a)将Ge蛋白或者其活性片段在体外与糖苷酶β_半乳糖苷酶或者与β_半乳糖苷酶和至少一种另外的糖苷酶的组合相接触，其中每种所述糖苷酶都固定在不含所述酶底物的固相上，以获得Ge巨噬细胞活化因子(GcMAF);和(b)将所固定的酶从GcMAF中移除，从而获得基本上不含糖苷酶的GcMAF组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述另外的糖苷酶选自由甘露糖苷酶和唾液酸酶组成的组。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述GcMAF包含具有连接到氨基酸残基的N-乙酰半乳糖胺基团的Ge蛋白或其片段。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述Ge蛋白包含SEQID N0:l_3中的任何一个所列出的氨基酸序列或其片段。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述N-乙酰半乳糖胺基团连接至在选自由位置418和位置420组成的组的位置的氨基酸苏氨酸。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述Ge蛋白片段包含对应于所述Ge蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述Ge蛋白片段由SEQID N0:4或SEQ ID NO: 5中所列出的氨基酸序列组成。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述N-乙酰半乳糖胺基团连接至在选自由位置44和位置46组成的组的位置的氨基酸苏氨酸。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述Ge蛋白或其片段是自血清中纯化。
21.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述Ge蛋白或其片段是产生自克隆的多核苷酸。
22.根据权利要求12所述的方法，还包括将所述含有GcMAF的组合物通过离子交换层析。
23.根据权利要求22所述的方法，包括将所述含有GcMAF的组合物通过阴离子交换层析。
24.根据权利要求12所述的方法，还包括将所述含有GcMAF的组合物通过疏水作用层析。
25.根据权利要求12所述的方法，还包括将所述含有GcMAF的组合物通过离子交换层析和疏水作用层析的组合。
26.根据权利要求12所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶固定在包含丙烯酸珠的固相上。
27.一种组合物，其包含根据权利要求12-26的任一项所述的方法产生的GcMAF，其中所述组合物基本上不含糖苷酶。
28.根据权利要求27所述的组合物，所述组合物含有少于所述组合物的组合物总蛋白含量中的3%的糖苷酶。
29.根据权利要求27所述的组合物，所述组合物含有少于所述组合物的总蛋白含量中的1%的糖苷酶。
30.一种药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1所述的包含巨噬细胞活化因子的组合物，还包含治疗上可接受的稀释剂或载体。
31.一种药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求27所述的包含巨噬细胞活化因子的组合物，还包含治疗上可接受的稀释剂或载体。
32.根据权利要求30或31所述的药物组合物，配制为用于静脉内给药。
33.一种在有此需要的个体中诱导巨噬细胞活化的方法，包括向所述个体施用权利要求32所述的药物组合物。
34.一种用于治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的药物组合物。
35.一种治疗HIV感染患者的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的药物组合物。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述癌症或HIV与α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(Nagalase)的升高的水平相关。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、头/颈癌、脑癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、纤维肉瘤、间皮瘤、白血病和黑色素瘤。
【文档编号】A61K38/14GK103547280SQ201280024137
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年4月5日 优先权日:2011年4月7日
【发明者】山本信人 申请人:艾弗兰纳特有限公司