改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法

改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法
【专利摘要】本发明发现，通过将抗原结合分子的Fc区改变为在pH中性范围条件下不形成包含两分子的FcRn和活性型Fcγ受体这四者的异源复合体的Fc区，抗原结合分子的药代动力学得到改善、抗原结合分子的免疫应答得到降低。此外，在发现具有上述性质的抗原结合分子、其制造方法的同时，还成功地发现在给予含有这种抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物时，与以往的抗原结合分子相比，具有药代动力学得到改善、被给予的机体的免疫应答得到降低的更优异特性。
【专利说明】改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过改变包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fe区的抗原结合分子的Fe区，从而改善给予了抗原结合分子的机体的药代动力学的方法、或降低抗原结合分子的免疫应答的方法。此外，本发明还涉及在给予机体时其药代动力学得到改善、或该机体的免疫应答得到降低的抗原结合分子。进而，本发明还涉及该抗原结合分子的制造方法、和含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。
【背景技术】
[0002]抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，IgG型的抗体药物有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体药物(非专利文献I和非专利文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应器功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术、或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常，抗体药物的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给药制剂，制造成本高等。作为降低抗体药物的给药量的方法，可考虑提高抗体的药代动力学的方法、和提高抗体与抗原的亲和性的方法。
[0003]作为提高抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸置换(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，报道有亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高体外的生物活性，或者降低给药量，进而也可以提高体内(机体内)的药效(非专利文献7)。
`[0004]另一方面，每一分子抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，可以通过增强亲和性来以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。进而，只要可共价地与抗原结合，使亲和性无限大，则可以用一分子的抗体来中和一分子的抗原(二价的情形为二抗原)。但是，迄今为止的方法中，限制是一分子抗体对一分子抗原(二价的情形是二抗原)的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完全中和抗原。即，在增强亲和性的效果方面存在限制(非专利文献9)。中和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学提高、或者亲和力成熟技术，在降低必要抗体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标期间，需要用一个抗体来中和多个抗原。作为实现其的新方法，最近报道了 PH依赖性地与抗原结合的抗体(专利文献I)。在血浆中的中性条件下与抗原强结合、在内体内的酸性条件下从抗原解离的pH依赖性抗原结合抗体可以在内体内从抗原解离。PH依赖性抗原结合抗体在将抗原解离后，若抗体通过FcRn被循环至血浆中，则可以再次与抗原结合，因而可以用一个pH依赖性抗原结合抗体反复与多个抗原结合。
[0005]另外，与结合至FcRn而被循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。这种血浆中滞留性长的抗体与该抗原结合时，抗体抗原复合体的血浆中滞留性变得与抗体同样地长。因此，抗原通过与抗体结合，不仅血浆中滞留性变长，而且血浆中抗原浓度上升。
[0006]IgG抗体通过与FcRn结合而具有长的血浆中滞留性。IgG和FcRn的结合仅在酸性条件下(pH6.0)被观察到，而在中性条件下(pH7.4)基本观察不到其结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fe区导入突变而丧失在酸性条件下与FcRn的结合时，变得无法从内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高酸性条件下对FcRn的结合的方法。通过向IgG抗体的Fe区导入氨基酸置换，使酸性条件下的对FcRn的结合提高，从内体内再循环至血浆中的效率提高，结果血浆中滞留性改善。导入氨基酸置换时重要的是不能提高中性条件下对FcRn的结合。若中性条件下与FcRn结合，则即使在内体内的酸性条件下与FcRn结合而返回到细胞表面上,在中性条件下的血衆中IgG抗体也不会从FcRn解离,此时IgG抗体未被再循环至血浆中，因而反而会损害血浆中滞留性。例如，将通过对IgGl导入氨基酸置换而在中性条件下(PH7.4)观察到对小鼠FcRn的结合的抗体给予小鼠时，据报道抗体的血浆中滞留性变差(非专利文献10)。此外，在对食蟹猴给予通过对IgGl导入氨基酸置换而使酸性条件下(pH6.0)的人FcRn的结合提高、但同时还观察到中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合的抗体时，据报道抗体的血浆中滞留性没有发生改善，血浆中滞留性未观察到变化(非专利文献10、11和12)。因此，提高抗体功能的抗体工程技术中，仅仅着眼于通过不使中性条件下(pH7.4)对人FcRn的结合增加而使酸性条件下对人FcRn的结合增加来改善抗体的血浆中滞留性，迄今为止尚未报道向IgG抗体的Fe区导入氨基酸置换以增加中性条件下(pH7.4WtAFcRn的结合的优点。即使提高抗体对抗原的亲和性，也不能促进抗原从血浆中的消除。上述的PH依赖性抗原结合抗体据报道与通常的抗体相比，作为促进抗原从血浆中消除的方法也是有效的(专利文献I)。
[0007]如此，pH依赖性抗原结合抗体可以用I个抗体与多个抗原结合，与通常的抗体相t匕，能促进抗原从血浆中的消除，因此具有通常的抗体所无法实现的作用。然而，迄今为止尚未报道有该PH依赖性抗原结合抗体的可以反复与抗原结合的效果、以及使促进抗原从血浆中消除的效果进一步提高的抗体工程技术。
[0008]另一方面，抗体药物的免疫原性在将抗体药物对人给予时的血浆中滞留性、有效性、安全性方面非常重要。据报道，人的体内若对所给予的抗体药物产生抗体，则会引起抗体药物在血浆中的消除加快、有效性降低、引起过敏反应而影响安全性等不期望的事件(非专利文献13)。[0009]在考虑抗体药物的免疫原性的基础上，需要对天然抗体原本在机体内所起的功能进行理解。首先，多数抗体药物是属于IgG类的抗体，但作为与IgG抗体的Fe区结合而起作用的Fe受体，已知有Fe Y受体(以下，也记载为Fe Y R)的存在。已知Fe Y R表达在树突细胞或NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、脂肪细胞等的细胞膜上，通过IgG的Fe区的结合而对免疫细胞传达活性型或抑制型的细胞内信号。作为人Fe Y R的蛋白家族，报道有Fe Y RIa,FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIb的同型，也报道有各自的异型(非专利文献14)。作为人 Fe Y RIIa 的异型，报道有 131 位为 Arg (hFc y RIIa(R))和 HisChFc y RIIa(H))的2种。另外，作为人Fe YRIIIa的异型，报道有158位为Val (hFc Y RIIIa(V))和Phe(hFc y RIIIa(F))的2种。此外，作为小? Fe y R的蛋白家族，报道有FcyRI, Fcy RIIb、FcyRIIKFcyRIV (非专利文献 15)。
[0010]AFcyR 分类为作为活性型受体的 Fe Y RIa, Fe y RIIa, Fe y RIIIa, Fe y RIIIb,以及作为抑制性受体的Fe Y Rllb。同样地，小鼠Fe Y R分类为作为活性型受体的Fe y R1、Fe Y RII1、Fe Y RIV、以及作为抑制性受体的Fe Y RIIb。
[0011]活性型Fe Y R若与免疫复合体交联，则会引起细胞内结构域或作为相互作用对象的FcR common Y -链所含的免疫受体酪氨酸相关的活化基序(immunoreceptortyrosine-based activating motifs, ITAMs)的磷酸化，将信号传递物质SYK活化,开始活化信号级连，由此引起炎症性免疫反应(非专利文献15)。
[0012]已表明，对于Fe区与Fe YR的结合，抗体的铰链区以及CH2结构域内的数个氨基酸残基以及与CH2结构域结合的EU编号297位的Asn上所附加的糖链是重要的(非专利文献15、非专利文献16、非专利文献17)。围绕向这些位置导入了突变的抗体,迄今为止研究了对各种Fe Y R具有结合特性的突变体，得到了对活性型Fe Y R具有更高亲和性的Fe区突变体(专利文献2、专利文献3、专利文献4、专利文献5)。
[0013]另一方面，作为抑制型Fe Y R的Fe Y RIIb是表达于B细胞的唯一的Fe Y R(非专利文献18)。据报道，通过抗体的Fe区对Fe Y RIIb的相互作用，B细胞的初次免疫得到抑制(非专利文献19)。此外，据报道B细胞上的Fe Y RIIb和B细胞受体(B cell receptor:BCR)若经由血中的免疫复合体交联 ，则B细胞的活化受到抑制，B细胞的抗体产生受到抑制(非专利文献20)。该BCR和Fe Y RIIb介导的免疫抑制信号的传导中需要包含在Fe y RIIb的细胞内结构域中的免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motif, ITIM)(非专利文献21、非专利文献22)。该免疫抑制作用经由Ι--Μ的磷酸化而发生。磷酸化的结果是含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SH2-containing inositolpolyphosphate 5-phosphatase, SHIP)被补充，阻碍其它的活性型Fe Y R的信号级联的传导，抑制炎症性免疫反应(非专利文献23)。
[0014]由于该性质，因而Fe YRIIb被期待作为直接降低针对抗体药物的免疫原性的方法。即使将在对小鼠来说是异种蛋白的Exendin-4 (Ex4)中融合有小鼠IgGl的分子(Ex4/Fe)给予小鼠，也不会产生抗体，但是通过给予对Ex4/Fc加以修饰而形成的不会与B细胞上的Fe Y RIIb结合的分子(Ex4/Fc mut),却会产生针对Ex4的抗体(非专利文献24)。该结果暗示Ex4/Fc与B细胞上的Fe Y RIIb结合，从而抑制B细胞的针对Ex4的小鼠抗体的产生。
[0015]此外，FcYRIIb也表达于树突细胞、巨噬细胞、活化的嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱细胞。在这些细胞中，FcYRIIb也妨碍吞噬作用和炎症性细胞因子的释放等活性型Fe YR的功能，抑制炎症性免疫反应(非专利文献25)。
[0016]对于Fe YRIIb的免疫抑制功能的重要性，迄今为止通过使用了 Fe YRIIb敲除小鼠的研究进行了说明。据报道，Fe YRIIb敲除小鼠中，体液免疫未受适当控制(非专利文献26)、对胶原诱导关节炎(CIA)的敏感性增加(非专利文献27)、呈狼疮(lupus)样的症状、或呈古德帕斯彻(Goodpasture)综合征样的症状(非专利文献28)。
[0017]此外，据报道Fe Y RIIb的调节不全也与人的自体免疫疾病相关。例如，据报道FcyRIIb的启动子区或穿膜区的基因多态性与系统性红斑狼疮(SLE)的发病频率相关(非专利文献29、非专利文献30、非专利文献31、非专利文献32、非专利文献33)、或者SLE患者的B细胞表面的Fe Y RIIb的表达降低(非专利文献34、非专利文献35)。
[0018]这样，根据小鼠模型和临床上的发现，认为Fe YRIIb主要通过与B细胞的相关而发挥控制自身免疫疾病、炎症性疾病的功能，是有望用于控制自身免疫疾病、炎症性疾病的目标分子。
[0019]已知主要用作市售抗体药物的IgGl不仅与Fe Y RIIb强结合，而且与活性型Fe Y R也强结合(非专利文献36)。认为通过利用增强了 Fe Y RIIb结合的Fe区、或者与活性型Fe Y R相比提高了 FcYRIIb结合的选择性的Fe区，可以开发出与IgGl相比具有免疫抑制性质的抗体药物。例如，暗示了通过利用具有与BCR结合的可变区、和增强了 Fe Y RIIb结合的Fe的抗体，可以抑制B细胞的活化的可能性(非专利文献37)。
[0020]但是，已知Fe Y RIIb与作为活性型Fe Y R之一的Fe Y RIIa的胞外区的序列为93%一致，结构极其类似。进而，作为基因多态性，Fe YRIIa中存在第二 Ig结构域的131位的氨基酸为His的H型与作为Arg的R型，各自与抗体的相互作用不同(非专利文献38)。因此，为了制造特异性地与FcYRIIb结合的Fe区，认为最难的问题是对抗体的Fe区赋予在不增加或减少对Fe Y RIIa的各基因多型的结合活性、同时增加Fe y RIIb结合活性的选择性地提高Fe Y RIIb结合活性的性质。
[0021]迄今为止报道了通过向Fe区导入氨基酸突变来使Fe Y RIIb结合的特异性提高的例子(非专利文献39)。该文献中，制作了与IgGl相比、较对两基因多型的Fe YRIIa的结合更多地维持了对Fe Y RIIb的结合的突变体。但是，该文献中报道的对Fe Y RIIb的特异性得到改善的任意突变体中，与天然型IgGl相比，对Fe YRIIb的结合减少。因此，认为这些突变体实际上难以在IgGl以上的程度上引起Fe YRIIb介导的免疫抑制性反应。
[0022]也增强了对Fe Y RIIb的结合的报道(非专利文献37)。该文献中，通过向抗体的Fe 区加以 S267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E 等的突变来使对 Fe Y RIIb 的结合增强。其中，导入了 S267E/L328F的突变的抗体最为强烈地与FCRIIb强结合，但该突变体对Fe Y RIa和Fe Y RIIa的H型的结合却维持于和天然型IgGl相同程度。即使Fe Y RIIb结合与IgGl相比增强，对于不表达Fe Y RIIb而表达Fe y RIIa的血小板之类的细胞(非专利文献25)，也并非Fe Y RIIb结合的增强，而仅是Fe y RIIa结合的增强效果有影响。例如有报道，在系统性红斑狼疮中，血小板通过Fe Y RIIa依赖性机制活化,血小板的活化与重症度相关(非专利文献40)。进而根据其它报道，该突变使得对Fe Y RIIa的R型的结合增强至对Fe Y RIIb的结合的同程度的数百倍，R型中，与Fe Y RIIa结合相比，Fe y RIIb结合的选择性并未提高(专利文献17)。此外，相对于树突细胞或巨噬细胞等表达Fe Y RIIa和Fe Y RIIb两者的细胞种类，为了传递抑制性信号，需要相较于Fe Y RIIa的对Fe y RIIb的结合的选择性，对于R型来说，其无法实现。[0023]Fe Y RIIa的H型和R型在高加索人和非裔美国人中以大致相同程度的频率被观察到(非专利文献41、非专利文献42)。因此，认为将对FcYRIIa R型的结合增强的抗体用于自身免疫疾病的治疗具有一定的限制。即使Fe Y RIIb结合与活性型Fe Y R相比增强，从用作自身免疫疾病的治疗药的观点出发，也不能忽视对Fe Y RIIa的任一基因多型的结合得到增强这一点。
[0024]在研制利用FcyRIIb的以自身免疫疾病治疗为目的的抗体药物时，重要的是，与天然型IgG相比，相对于Fe Y RIIa的任一基因多型，Fe介导的结合均不增加、优选减少、并且对Fe YRIIb的结合增强。但是，迄今为止尚无具有这种性质的突变体的报道，其开发受到需求。
[0025]应予说明，本发明的现有技术文献如下所示。
[0026]现有技术文献 专利文献
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【权利要求】
1.以下(a)或(b)中的任一方法，其包含:将包含抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、和在PH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fe区的抗原结合分子的Fe区改变为在pH中性范围条件下不会形成含有两分子的FcRn和一分子的活性型Fe Y受体的异源复合体的Fe区； (a)改善抗原结合分子的药代动力学的方法、或 (b)使抗原结合分子的免疫原性降低的方法。
2.权利要求1所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的Fe区包括:改变为Fe区的活性型Fe Y受体结合活性低于天然型人IgG的Fe区的该活性型Fe Y受体结合活性的Fe区。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，前述活性型FeY受体是人Fe Y RIa、人Fe Y RIIa(R)、人 FcyRIIa (H)、人 FcyRIIIa (V)或人 FcyRIIIa (F)。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括对前述Fe区的氨基酸中以EU编号表示的235位、237位、238位、239位、270位、298位、325位和329位中的任意一个以上的氨基酸进行置换。
5.权利要求4所述的方法,其包括前述Fe区的以EU编号表不的氨基酸的下述任一者以上的置换: 将 234 位的氨基酸置换为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、Lys> Met、Phe> Pro、Ser、Thr或Trp中的任一者、 将 235 位的氛基酸置换为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、lie、Lys> Met、Pro、Ser>Thr> Val或Arg中的任一者、 将 236 位的氨基酸置换为 Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro 或 Tyr 中的任一者、 将 237 位的氛基酸置换为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、His、lie、Leu、Lys> Met> Pro、Ser>Thr> Val、Tyr 或 Arg 中的任一者、 将 238 位的氨基酸置换为 Ala、Asn、Gin、Glu、Gly、His、lie、Lys、Thr、Trp 或 Arg 中的任一者、 将239位的氨基酸置换为Gin、His、Lys> Phe> Pro、Trp> Tyr或Arg中的任一者、 将 265 位的氛基酸置换为 Ala、Arg、Asn、Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Ser>Thr、Trp、Tyr 或 Val 中的任一者、 将 266 位的氨基酸置换为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、Lys> Phe> Pro、Ser>Thr> Trp或Tyr中的任一者、 将267位的氨基酸置换为Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中的任一者、 将 269 位的氨基酸置换为 Ala、Arg、Asn、Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 中的任一者、 将 270 位的氨基酸置换为 Ala、Arg、Asn、Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 中的任一者、 将271位的氨基酸置换为Arg、His、Phe> Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者、 将295位的氨基酸置换为Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一者、 将296位的氨基酸置换为Arg、Gly、Lys或Pro中的任一者、将297位的氨基酸置换为Ala、 将298位的氨基酸置换为Arg、Gly、Lys> Pro、Trp或Tyr中的任一者、 将300位的氨基酸置换为Arg、Lys或Pro中的任一者、 将324位的氨基酸置换为Lys或Pro中的任一者、 将 325 位的氨基酸置换为 Ala、Arg、Gly、His、lie、Lys> Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或 Val中的任一者、 将 327 位的氨基酸置换为 Arg、Gin、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp>Tyr或Val中的任一者、 将328位的氨基酸置换为Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中的任一者、 将 329 位的氛基酸置换为 Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe、Ser>Thr> Trp、Tyr> Val 或 Arg 中的任一者、 将330位的氨基酸置换为Pro或Ser中的任一者、 将331位的氨基酸置换为Arg、Gly或Lys中的任一者、或 将332位的氨基酸置换为Arg、Lys或Pro中的任一者。
6.权利要求1所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的Fe区包括:改变为Fe区的抑制型Fe Y受体结合活性高于活性型Fe Y受体结合活性的Fe区。
7.权利要求6所述的方法，其中，前述抑制型FeY受体是人FcYRIIb。
8.权利要求6或7所述的方法，其中，前述活性型FeY受体是人Fe Y RIa、人Fe Y RIIa(R)、人 FcyRIIa (H)、人 FcyRIIIa (V)或人 FcyRIIIa (F)。
9.权利要求6至8中任一项所述的方法,其包括对以EU编号表不的238或328位的氨基酸进行置换。
10.权利要求9所述的方法，其包括将以EU编号表示的238位的氨基酸置换为Asp，或将328位的氨基酸置换Glu。
11.权利要求9或10所述的方法，其包括以EU编号表示的氨基酸的下述任一者以上的置换: 将233位的氨基酸置换为Asp、 将234位的氨基酸置换为Trp、或Tyr中的任一者、 将237位的氨基酸置换为Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp或Tyr中的任一者、 将239位的氨基酸置换为Asp、 将267位的氨基酸置换为Ala、Gln或Val中的任一者、 将268位的氨基酸置换为Asn、Asp、或Glu中的任一者、 将271位的氨基酸置换为Gly、 将326位的氨基酸置换为Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser或Thr中的任一者、 将330位的氨基酸置换为Arg、Lys、或Met中的任一者、 将323位的氨基酸置换为lie、Leu、或Met中的任一者、 将296位的氨基酸置换为Asp。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，前述Fe区是这样的Fe区，其氨基酸中以 EU 编号表示的 237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、298、303、`305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、.389、424、428、433、434、和436中的任意一个以上的氨基酸包含与天然型Fe区的氨基酸不同的氨基酸。
13.权利要求12所述的方法，其中，前述Fe区的以EU编号表示的氨基酸是下述任一者以上的组合: .237位的氨基酸为Met、 .248位的氨基酸为He、 .250 位的氨基酸为 Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或 Tyr 中的任一者、 .252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr中的任一者、 .254位的氨基酸为Thr、 .255位的氨基酸为Glu、 .256位的氨基酸为Asn、Asp、Glu、或Gln中的任一者、 .257 位的氨基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr、或 Val 中的任一者、 .258位的氨基酸为His、 .265位的氨基酸为Ala、 .286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一者、 .289位的氨基酸为His、 . 297位的氨基酸为Ala、 .298位的氨基酸为Gly、 .303位的氨基酸为Ala、 .305位的氨基酸为Ala、 .307位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Val、Trp、或Tyr中的任一者、 .308位的氨基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gin、或 Thr 中的任一者、 . 309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中的任一者、 . 311位的氨基酸为Ala、His、或Ile中的任一者、 .312位的氨基酸为Ala或His中的任一者、 .314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者、 .315位的氨基酸为Ala、Asp或His中的任一者、 .317位的氨基酸为Ala、 .332位的氨基酸为Val、 .334位的氨基酸为Leu、 . 360位的氨基酸为His、 .376位的氨基酸为Ala、. .380位的氨基酸为Ala、 .382位的氨基酸为Ala、 .384位的氨基酸为Ala、 .385位的氨基酸为Asp或His中的任一者、 .386位的氨基酸为Pro、 .387位的氨基酸为Glu、.389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一者、 .424位的氨基酸为Ala、 .428 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者、 .433位的氨基酸为Lys、 .434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一者、或 .436 位的氨基酸为 His、lie、Leu、Phe、Thr、或 Val。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域。
15.权利要求14所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
16.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据pH条件而发生变化的抗原结合结构域。
17.权利要求16所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以pH酸性范围下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子是抗体。
20.权利要求1所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的Fe区包括:改变为构成Fe区的二个多肽的一者具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一者不具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fe区。
21.权利要求20所述的方法，其包括对构成前述Fe区的二个多肽的一者的氨基酸序列中以 EU 编号表示的 237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、和436中的任意一个以上的氨基酸进行置换。
22.权利要求21所述的方法，其包括前述Fe区的以EU编号表示的氨基酸的下述任一者以上的置换: 将237位的氨基酸置换为Met、 将248位的氨基酸置换为lie、 将 250 位的氨基酸置换为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp、或 Tyr> 将252位的氨基酸置换为Phe、Trp、或Tyr、 将254位的氨基酸置换为Thr、 将255位的氨基酸置换为Glu、 将256位的氨基酸置换为Asn、Asp、Glu、或Gin、 将 257 位的氨基酸置换为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或 Val、 将258位的氨基酸置换为His、 将265位的氨基酸置换为Ala、将286位的氨基酸置换为Ala或Glu、 将289位的氨基酸置换为His、 将297位的氨基酸置换为Ala、 将298位的氨基酸置换为Gly、 将303位的氨基酸置换为Ala、 将305位的氨基酸置换为Ala、 将 307 位的氛基酸置换为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp、或 Tyr> 将 308 位的氨基酸置换为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gin、或 Thr、 将309位的氨基酸置换为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg、 将311位的氨基酸置换为Ala、His、或lie、 将312位的氨基酸置换为Ala或His、 将314位的氨基酸置换为Lys或Arg、 将315位的氨基酸置换为Ala、Asp或His、 将317位的氨基酸置换为Ala、 将332位的氨基酸置换为Val、 将334位的氨基酸置换为Leu、 将360位的氨基酸置换为His、 将376位的氨基酸置换为Ala、 将380位的氨基酸置换为Ala、 将382位的氨基酸置换为Ala、 将384位的氨基酸置换为Ala、 将385位的氨基酸置换为Asp或His、 将386位的氨基酸置换为Pro、 将387位的氨基酸置换为Glu、 将389位的氨基酸置换为Ala或Ser、 将424位的氨基酸置换为Ala、 将 428 位的氛基酸置换为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser>Thr、Val、Trp、或 Tyr> 将433位的氨基酸置换为Lys、 将434位的氨基酸置换为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr、或 将436位的氨基酸置换为His、lie、Leu、Phe、Thr、或Val。
23.权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域。
24.权利要求23所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
25.权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据pH条件而发生变化的抗原结合结构域。
26.权利要求25所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以pH酸性范围下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
27.权利要求20至26中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区。
28.权利要求20至27中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子是抗体。
29.抗原结合分子，其包含抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、以及在pH中性 范围条件下具有FcRn结合活性的Fe区,该Fe区包含选自下述中的任一者以上的氨基酸: 234位的氨基酸为Ala、 235位的氨基酸为Ala、Lys或Arg中的任一者、 236位的氨基酸为Arg、 238位的氨基酸为Arg、 239位的氨基酸为Lys、 270位的氨基酸为Phe、 297位的氨基酸为Ala、 298位的氨基酸为Gly、 325位的氨基酸为Gly、 328位的氨基酸为Arg、或 329位的氨基酸为Lys、或Arg 其中，所述氨基酸是以EU编号表示的氨基酸。
30.权利要求29所述的抗原结合分子，其包含选自下述中的任一者以上的氨基酸: 237位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者、 238位的氨基酸为Lys 239位的氨基酸为Arg、或 329位的氨基酸为Lys或Arg中的任一者， 其中，所述氨基酸是前述Fe区的以EU编号表示的氨基酸。
31.抗原结合分子，其包含:抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域，以及构成Fe区的二个多肽的一者具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一者不具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fe区。
32.权利要求29至31中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述Fe区是这样的Fe区，构成其的二个多肽的一者的氨基酸序列中以EU编号表示的237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、和 436 中的任意一个以上的氨基酸与天然型Fe区的氨基酸不同。
33.权利要求32所述的抗原结合分子，其中前述Fe区的以EU编号表示的氨基酸是下述任一者以上的组合: 237位的氨基酸为Met、 248位的氨基酸为He、.250 位的氨基酸为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp、或 Tyr> . 252位的氨基酸为Phe、Trp、或Tyr、 . 254位的氨基酸为Thr、 .255位的氨基酸为Glu、 .256位的氨基酸为Asn、Asp、Glu、或Gin、 .257位的氨基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr、或 Val、 .258位的氨基酸为His、 .265位的氨基酸为Ala、 .286位的氨基酸为Ala或Glu、 . 289位的氨基酸为His、 .297位的氨基酸为Ala、 .303位的氨基酸为Ala、 .305位的氨基酸为Ala、 .307位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Val、Trp、或 Tyr> .308位的氨基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gin、或 Thr、 .309位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Pro、或 Arg、 .311位的氨基酸为Ala、His、或lie、 .312位的氨基酸为Ala或His、 .314位的氨基酸为Lys或Arg、 .315位的氨基酸为Ala、Asp或His、 .317位的氨基酸为Ala、 .332位的氨基酸为Val、 .334位的氨基酸为Leu、 .60位的氨基酸为His、 .376位的氨基酸为Ala、 . 380位的氨基酸为Ala、 .382位的氨基酸为Ala、 .384位的氨基酸为Ala、 .385位的氨基酸为Asp或His、 .386位的氨基酸为Pro、 . 387位的氨基酸为Glu、 . 389位的氨基酸为Ala或Ser、 .424位的氨基酸为Ala、 .428 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp、或 Tyr> .433位的氨基酸为Lys、 .434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr、或者 .436 位的氨基酸为 His、lie、Leu、Phe、Thr、或 Val。
34.权利要求29至33中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域。
35.权利要求34所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
36.权利要求29至33中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据pH条件而发生变化的抗原结合结构域。
37.权利要求36所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以pH酸性范围下的抗原结合活性低于PH中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域。
38.权利要求29至37中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区。
39.权利要求29至38中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体。
40.编码权利要求29至39中任一项所述的抗原结合分子的多核苷酸。
41.可作用地连接有权利要求40所述的多核苷酸的载体。
42.导入有权利要求41所述的载体的细胞。
43.权利要求29至39中任一项所述的抗原结合分子的制造方法，其包括从权利要求42所述的细胞的培养液中回收抗原结合分子的步骤。
44.药物组合物，其含有权利要求29至39中任一项所述的抗原结合分子、或由权利要求43所述的制造方法得到的抗原结合分子作为有效成分。
【文档编号】A61K39/395GK103703129SQ201280026850
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】井川智之, 前田敦彦, 原谷健太, 岩柳有起, 橘达彦, 味元风太, 仓持太一, 坚田仁, 门野正次郎 申请人:中外制药株式会社