改进疫苗免疫原性的方法
【专利摘要】本发明提供被称为“免疫银行(ImmuneBanking)”的方法，该方法通过利用现有的体液应答而增强疫苗功效。所述方法包括用分子标记来标记新抗原，所述分子标记被现有的抗体应答所识别。这种对带标记的疫苗组分的识别增强了对新疫苗的适应性免疫应答。进一步公开了用于抗原缀合的包含脊髓灰质炎的VP-1表位的抗体识别表位(ARE)的序列。
【专利说明】改进疫苗免疫原性的方法
[0001] 发明优先权
本申请要求于2011年4月4日提交的美国临时申请号61/471，553的优先权。此临时申请的全部内容都通过引用结合到本文中。
_2] 发明背景
免疫系统相当复杂并且包括生物体抗击感染性病原体和癌细胞的许多不同途径。一般而言，认为免疫系统能够引发体液免疫应答(HIR)和/或细胞介导的免疫应答(CMI)。HIR涉及B淋巴细胞谱系的细胞(B细胞)中产生的抗体的产生和分泌。分泌的抗体与侵入的微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原结合。然后，免疫系统中的多种细胞将与抗体结合的抗原破坏掉。体液免疫还指抗体的产生和与之相伴的辅助过程。它还指抗体的效应器功能，其包括病原体和毒素中和、经典补体激活、和吞噬作用及病原体消除的调理素促进。
[0003]免疫应答的第二类是细胞介导的免疫(CMI)。CMI是这样的免疫应答:其不涉及抗体或补体，而是涉及多种免疫细胞(例如巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒素T-淋巴细胞)的激活，以及响应抗原的多种细胞因子的释放。细胞免疫能够通过激活抗原特异性T-淋巴细胞而保护机体。这些细胞在其表面展示外源抗原的表位的体细胞中诱发细胞凋亡，所述体细胞例如感染病毒的细胞、感染胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞。T细胞激活巨噬细胞和自然杀伤细胞，使它们能够破坏胞内病原体，并刺激细胞分泌各种细胞因子，所述细胞因子影响到参与适应性及固有免疫应答的其它细胞的功能。细胞介导的免疫主要涉及在吞噬细胞中存活的微生物和感染非吞噬细胞的微生物。它在去除感染病毒的细胞方面非常有效，而且也参与抵抗真菌、原生动物、癌症和胞内细菌。
[0004]在传统上，按照世界卫生组织的定义，疫苗是通过刺激抗体的产生而产生针对疾病的免疫力的任何制品。疫`苗包括例如经灭活或减毒的微生物悬液，或者微生物的产物或衍生物。给予疫苗的最常见方法是通过接种，但有些通过口或鼻喷入而给予。
[0005]目前的疫苗技术依赖于大剂量的抗原和/或再接种(加强接种)而且并非是针对所有感染性因子都具有保护作用。因此，需要新的疫苗，以获得针对目前无有效疫苗的感染性因子的保护作用。还需要施用更安全、生产更便宜、和/或无需加强接种的新型疫苗。无需加强接种将会增加免疫的依从性。最后，某些人群(例如老年人)，对接种产生总体较弱的应答，更有效的疫苗能更好地保护这类持续增加的疫苗接受者。
[0006]发明概沭
在某些实施方案中，本发明提供化合物，所述化合物包含共价结合到抗体-识别表位(ARE，也称为“抗体识别元件”或“抗体反应表位”)上的至少一个抗原。在某些实施方案中，本发明提供包含IPALTAVETGA (SEQ ID NO:1)的长度为大约11_28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位。在某些实施方案中，所述表位的长度为大约18-28个氨基酸并包含IPALTAVETGA (SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，所述表位由或基本由IPALTAVETGA (SEQID NO:1)组成。
[0007]在某些实施方案中，所述表位的长度为大约11-28个氨基酸并包含ALTAVETGAT(SEQ ID NO: 3)。在某些实施方案中，本发明提供包含ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3)的长度为大约18-28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位。在某些实施方案中，所述表位由或基本由ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3)组成。在某些实施方案中，所述表位的长度为18-28个氨基酸，并包含、基本由或由AHSKEIPALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2)组成。
[0008]在某些实施方案中，本发明提供化合物，所述化合物包含共价结合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原，其中所述ARE是上述的VP-1表位。在某些实施方案中，所述抗原通过a-Gal连接的方式结合到所述ARE上。在某些实施方案中，所述抗原通过接头分子的方式结合到所述ARE上。在某些实施方案中，所述接头分子是甲醛、戊二醛、MBS (m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)和/或磺基-MBS。在某些实施方案中，所述抗原是感染性因子抗原。在某些实施方案中，所述感染性因子是细菌、真菌、寄生虫、病毒或朊病毒因子。在某些实施方案中，所述感染性因子是细菌因子或病毒因子。在某些实施方案中，所述抗原是癌抗原。
[0009]在某些实施方案中，所述抗原进一步缀合到抗体上，形成抗体:抗原复合物。如本文所用，术语“抗体”包括scFv、人源化、完全的人抗体或嵌合抗体、单链抗体、双抗体和抗体的抗原结合片段(例如Fab片段)。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体是单链Fv或scFv片段。
[0010]在某些实施方案中，将半抗原操作性连接到所述抗原上，形成半抗原化的抗原。在某些实施方案中，将半抗原操作性连接到另外的抗原上。
[0011]在某些实施方案中，本发明提供包含操作性连接到缀合分子上的化合物的复合物，所述化合物包含共价缀合到抗体-识别表位(ARE)的至少一个抗原。在某些实施方案中，所述缀合分子是并非所述抗原或ARE的肽、核酸或多糖。
[0012]在某些实施方案中，本发明提供包含化合物和生理上可接受的无毒溶媒的组合物，所述化合物包含缀合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原。在某些实施方案中，所述组合物还包含佐剂。
[0013]在某些实施方案中，本发`明提供在预先免疫的(pre-1mmunized)动物中引发免疫应答的方法，所述方法包括将上述组合物引入所述动物。在某些实施方案中，所述组合物的引入发生在预先免疫(pre-1mmunization)后的至少15天。在某些实施方案中，所述方法还包括弓丨入上述第二组合物。在某些实施方案中，所述方法还包括引入重复剂量的所述组合物。在某些实施方案中，所述动物是人。
[0014]在某些实施方案中，本发明提供产生对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括将上述组合物或复合物引入所述动物。在某些实施方案中，所述方法还包括将所述组合物或所述复合物的第二剂量引入所述动物。
[0015]在某些实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括将上述组合物或复合物给予患者。
[0016]在某些实施方案中，本发明提供预防或治疗感染或感染性疾病的方法，所述方法包括将上述组合物或复合物给予患者。
[0017]在某些实施方案中，本发明提供化合物，所述化合物包含缀合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原，所述化合物用于预防性或治疗性治疗感染性因子或癌症。
[0018]在某些实施方案中，本发明提供包含缀合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原的化合物，所述化合物用于制备用于在哺乳动物中治疗感染性因子或癌症的药物。[0019]本发明提供化合物，所述化合物包含共价结合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原，其中所述抗原是来自甲型流感病毒H5N1 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)的核壳蛋白(NP) (Genebank蛋白检索号#ABI36003)，所述ARE是包含 IPALTAVETGA (SEQ ID NO:1)的长度为大约11-28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位，并且其中所述ARE直接地共价结合到该NP上。
[0020]在某些实施方案中，本发明提供编码上述VP-1表位的核酸，其操作性连接到编码抗原的核酸上。
[0021]在某些实施方案中，本发明提供表达盒，所述盒包括邻接连接到编码上述VP-1表位的核酸上的启动子，所述核酸操作性连接到编码抗原的核酸上。在某些实施方案中，所述启动子是组织-特异性启动子。在某些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在某些实施方案中，所述启动子是CMV、RSV, EFa-1或T7启动子。
[0022]在某些实施方案中，本发明提供包含上述表达盒的载体。在某些实施方案中，所述载体是腺伴随病毒(AAV)载体。
[0023]附图简沭
图1提供了针对Ab-识别元件(ARE)缀合Ag的增强的细胞免疫应答的所提出的机制。小鼠组I和组II对AgA具有体液应答。然后，组I用缀合到AgA衍生的ARE上的AgB免疫。相比之下，组II针对未缀合的AgB而免疫。识别ARE缀合的AgB的AgA特异性体液应答增强了组I的B-特异性适应性免疫应答，超过了组II。
[0024]图2显示记忆⑶8 T细胞应答。
[0025]图3显示当小鼠接受抗原注射时的时间线以及采血用于检测Agl和半抗原-特异性抗体的天数。`
[0026]图4显示测试分泌的Ig的作用的体外实验设计和用于可溶性Ig在增强的免疫应答中的作用的体内实验设计。
[0027]图5显示连续的ARE-conj接种的时间线和同时ARE_conj接种的时间线。
[0028]图6显示免疫银行(Immune Banking)，其利用了针对ARE半抗原2，4，6，三硝基苯基(TNP)的先存在的Ab应答，提供了针对流感诱导的死亡的保护作用。
[0029]图7显示可溶性Ag-特异性的免疫球蛋白在增强的应答中的作用。将来自KLH或KLH-TNP免疫的小鼠的血清与TNP缀合的卵白蛋白一起孵育。将得到的含有卵白蛋白-TNP加上小鼠血清的混合物或卵白蛋白-TNP:抗体复合物注射到首次用于实验的小鼠(3只/组)中。卵白蛋白注射后7天，通过胞内细胞因子染色而测定ova-特异性的脾CD8 T细胞的百分率。注意到使用TNP作为ARE的免疫复合物的注射增强了针对疫苗的细胞应答。
[0030]图8显示ARE修饰的肽疫苗的功效测定。在接种和用流感攻击后，具有ARE特异性抗体的小鼠显示出较低的发病率。小鼠接受模拟接种(明矾w/PBS)或者针对肝炎B而使用人疫苗(HBsAg，在明矾中)接种。在试验组中针对HBsAg的血清转化后，两组小鼠接受肝炎ARE标记的流感核蛋白疫苗(共价结合到流感的核蛋白-NP-上的H印Pep-)。然后用毒性流感攻击这两组并通过减重测定发病率。IfepP印-ARE标记的疫苗组显示出比对照组更低的发病率。
[0031]图9显示化学连接到HBsAg上并作为免疫复合物提供的VP_1 ARE的结果。
[0032]发明详沭增加亚单位疫苗免疫原性的技术开发对健康专家、军事人员和普通公众具有很大的吸引力。增加抗原的免疫原性的能力改善了现有疫苗和增强了新疫苗的开发，以降低感染相关的发病率和死亡率。除了与感染性疾病抗争之外，疫苗开发上的进展分别通过免疫治疗和免疫干预而使癌症患者和化学品依赖者(例如针对活性化学品例如可卡因的免疫接种)
-M-*.、/.犾碰。
[0033]成功的免疫导致包括B淋巴细胞(也称为“B细胞”)在内的适应性免疫细胞的活化。B细胞的活化诱导克隆扩增并分化为长寿Ab产生细胞(浆细胞)和记忆B细胞。因此，经免疫的个体表达可溶性Ab和维持记忆B细胞，这两者各自能识别原有疫苗中含有的特定Ag。
[0034]在某些实施方案中，本发明提供被称为“免疫银行的方法，该方法通过利用现有的体液应答而增强疫苗功效。免疫银行方法包括用分子标记来标记新抗原，所述分子标记已被个体内现有的抗体应答所识别。这种对带标记的疫苗组分的识别增强了对新疫苗的适应性免疫应答。先前的疫苗技术依赖于大剂量的抗原和/或再接种(加强接种)并且不能提供针对所有感染性因子的保护作用。因为免疫银行方法能够增强疫苗功效，所以可用于降低现有疫苗的剂量要求，降低生产成本，并减少对加强接种(这将会提高免疫依从性)的需要。免疫银行方法还能够产生新的疫苗以抗击新出现的感染性因子和癌症(对此还没有疫苗)。该方法还提高了用于研究用途或临床治疗的单克隆抗体和多克隆抗体的生产。因此免疫银行技术对于人用和动物用疫苗的生产者、生产用于实验研究的多克隆抗体和单克隆抗体的生物技术公司以及生产用于治疗疾病的单克隆抗体的医药公司而言都具有极大的吸引力。
[0035]在某些实施方案中，本发明扩大了疫苗反应`的功效，并因此扩大了响应特定疫苗的人数。还增加了疫苗在新生儿中的有效性。该方法的使用克服了现有疫苗使用中的多个难题，包括需要多次接种或“加强接种”、需要大剂量疫苗组分、不能接种新生儿、难于产生能免遭特定感染性因子的有效疫苗和在制备能免遭癌症的疫苗中的挑战。多项研究表明，通过将抗原(Ag)靶向或导向免疫细胞而增加疫苗功效将有助于解决这些问题。在实验室环境下已经通过将Ag与细胞-特异性配体或细胞-特异性抗体缀合，实现了将抗原靶向免疫细胞，但是这类疫苗的大规模生产和开发是成本不允许的并面对相当大的技术障碍。因此，将疫苗抗原靶向抗原呈递细胞(APC)的一个简单有效的、成本合算的方式就是最重要的。免疫银行方法通过利用先存在的体液免疫应答将疫苗抗原靶向或导向免疫细胞实现该目标，因此增强了对疫苗的免疫应答。
[0036]在本发明的某些实施方案中，针对已知抗原，预先免疫动物(例如人)，以产生起始免疫应答(即给予疫苗，所述动物的免疫系统产生免疫应答)。然后给予预先免疫的动物包含缀合到抗体-识别表位(ARE)上的至少一个抗原的化合物。免疫银行建立在以下事实上:动物和人按常规接受已知抗原的免疫接种。在某些实施方案中，所述免疫银行疫苗用半抗原化的抗原来修饰，和在某些情况下，免疫银行疫苗具有缀合其上的额外抗原。在某些实施方案中，所述ARE是包含IPALTAVETGA (SEQ ID NO:1)的长度为大约11_28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位。在某些实施方案中，所述ARE通过a-Gal连接的方式缀合到所述抗原。
[0037]通过先存在的体液应答改进疫苗免疫原性增加疫苗免疫原性改进了现有可用疫苗，并增强新疫苗的开发，以降低感染相关的发病率和死亡率。通过Ag与APC-特异性配体或Ab的缀合而靶向抗原呈递细胞(APC)的疫苗表现出增加的免疫原性。然而，这类疫苗的大规模生产和开发面对着成本和技术的障碍。缺乏将疫苗Ag靶向APC的简单、有效、成本合算的方式。成功的免疫导致B细胞活化，其诱导克隆扩增并分化为长寿Ab产生浆细胞和记忆B细胞。因此，经免疫的个体具有可溶性Ab和记忆B细胞，这两者各自能识别原始疫苗中的Ag。本发明人利用来自一次免疫的ARE修饰新Ag，因此通过利用现有的B记忆应答将其靶向APC。靶向APC的特异性Ag使用了现有的体液免疫应答，并改进了疫苗的免疫原性。这导致增加的疫苗功效和对重复免疫的需要的降低。
[0038]先存在的Ab对新Ab应答的调节(称为Ab反馈调节的现象)最初由Emil vonBerhing 描述于 1892 年(Hjelm, F.等人 2006.Scand J Immunol 64:177-184)。根据实验模型，新Ab应答的调节可以是正向(增强)或负向(抑制)的(Heyman, B.2000.Annu Rev Immunol 18:709-737)。尽管并未完全理解，但是认为增强的机制依赖于FcR介导的Ab: Ag复合物的摄取，然后由APC将Ag呈递给⑶4 T细胞。然后，这些T细胞能够给新Ag-特异性B细胞提供“帮助”,因此增强了 Ab应答(Heyman, B.2000.Annu Rev Immunol18:709-737 ;Getahun, A.和 B.Heyman.2006.1mmunol Lett 104:38-45)。有趣的是，虽然讨论超过了 100多年并认为包括了 T淋巴细胞，但是Ab对⑶4和⑶8 T细胞应答的反馈调节效应并未确定。本文概述的实验评价了先存在的体液应答对产生针对新Ag的T细胞应答的作用，和作为新的免疫增强策略的潜在用途。
[0039]图1提供了针对ARE缀合的Ag的增强的细胞免疫应答的所提出的机制。小鼠组I和组II对AgA具有体液应答。然后，组I用缀合到Ag-A衍生的ARE上的AgB免疫。组II针对未缀合的Ag-B而免疫。识别ARE-缀合的AgB的Ag-A特异性体液应答增强了组I的淋巴细胞-特异性适应性免疫应答，超过了组II。
[0040]表1和图2显示针对ARE的先存在的体液应答增强了针对ARE-缀合的、新的免疫原的⑶8 T细胞应答。`
[0041]表1
【权利要求】
1.包含IPALTAVETGA(SEQ ID NO:1)的长度为大约11-28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位。
2.权利要求1的VP-1表位，其中所述表位为大约18-28个氨基酸长度并包含IPALTAVETGA (SEQ ID NO:1)。
3.权利要求1的VP-1表位，其中所述表位基本由IPALTAVETGA(SEQ ID NO:1)组成。
4.权利要求1的VP-1表位，其中所述表位由IPALTAVETGA(SEQ ID NO:1)组成。
5.包含ALTAVETGAT(SEQ ID NO: 3)的长度为大约11-28个氨基酸的脊髓灰质炎的VP-1表位。
6.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位为大约18-28个氨基酸长度并包含ALTAVETGAT (SEQ ID NO: 3)。
7.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位基本由ALTAVETGAT(SEQ ID NO: 3)组成。
8.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位由ALTAVETGAT(SEQ ID NO: 3)组成。
9.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位为18-28个氨基酸长度并包含AHSKEIPALTAVETGATA (SEQ ID NO: 2)。
10.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位基本由AHSKEIPALTAVETGATA(SEQ ID NO:2)组成。
11.权利要求5的VP-1表位，其中所述表位由AHSKEIPALTAVETGATA(SEQ ID NO: 2)组成。
12.包含与抗体-识别表位(A`RE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位。
13.权利要求12的化合物，其中所述抗原通过a-Gal连接的方式与所述ARE结合。
14.权利要求12或13的化合物，其中所述抗原通过接头分子的方式与所述ARE结合。
15.权利要求14的化合物，其中所述接头分子是甲醛、戊二醛、MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)和/或磺基-MBS。
16.权利要求12-15中任一项的化合物，其中所述抗原是感染性因子抗原。
17.权利要求16的化合物，其中所述感染性因子是细菌、真菌、寄生虫、病毒或朊病毒因子。
18.权利要求17的化合物，其中所述感染性因子是细菌因子。
19.权利要求17的化合物，其中所述感染性因子是病毒因子。
20.权利要求12-19中任一项的化合物，其中所述抗原是癌抗原。
21.权利要求12-20中任一项的化合物，其中所述抗原进一步结合到抗体上，形成抗体:抗原复合物。
22.权利要求21的化合物，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
23.权利要求22的化合物，其中所述抗体是人源化抗体。
24.权利要求23的化合物，其中所述抗体是完全人源化的抗体。
25.权利要求21的化合物,其中所述抗体是单链Fv或scFv片段。
26.权利要求12-25中任一项的化合物，其中半抗原操作性连接到所述抗原上，形成半抗原化的抗原。
27.权利要求26的化合物，其中所述半抗原操作性连接到另外的抗原上。
28.包含权利要求12-27中任一项的化合物的复合物，其操作性连接到缀合分子上。
29.权利要求28的复合物，其中所述缀合分子是并非所述抗原或ARE的肽、核酸或多糖。
30.一种组合物，包含权利要求12-27中任一项的化合物或权利要求28或29的复合物和生理上可接受的无毒溶媒。
31.权利要求30的组合物，还包含佐剂。
32.在预先免疫的动物中引发免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求30或31的组合物引入到所述动物。
33.权利要求32的方法，其中所述组合物的引入发生在预先免疫后至少15天。
34.权利要求32或33中任一项的方法，还包括引入权利要求30或31的第二组合物。
35.权利要求32-34中任一项的方法，还包括引入重复剂量的权利要求30或31的组合物。
36.权利要求32-35中任一项的方法，其中所述动物是人。
37.在预先免疫的动物中产生对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括将权利要求30或31的组合物引入到所述动物。
38.权利要求32-37中任一项的方法，还包括将第二剂量的权利要求30或31的组合物引入到所述动物。·
39.治疗癌症的方法，所述方法包括将权利要求30或31的组合物给予患者。
40.预防或治疗感染或感染性疾病的方法，所述方法包括将权利要求30或31的组合物给予患者。
41.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个纯化的抗原的化合物，其中所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，所述化合物用于预防性或治疗性治疗感染性因子或癌症。
42.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个纯化的抗原的化合物，其中所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，所述化合物用于制备用于在哺乳动物中治疗感染性因子或癌症的药物。
43.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述抗原是来自甲型流感 H5N1 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) Genebank 蛋白检索号 #ABI36003 的核壳蛋白(NP)，并且所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，其中所述ARE与所述NP直接共价结合。
44.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述抗原是来自甲型流感HlNl (A/Puerto Rico/8-V24/1934 (HlNl)) Genebank检索号ADY00024.1的核壳蛋白(NP)，并且所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，其中所述ARE与所述NP直接共价结合。
45.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述抗原是来自甲型流感 HlNl (A/Puerto Rico/8_V24/1934 (HlNl)) Genebank 检索号 ADY00020.1的血凝素蛋白(HA)，并且所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，其中所述ARE与所述NP直接共价结合。
46.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述抗原是来自乙肝病毒的乙肝表面抗原(HBsAg)，并且所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，其中所述ARE与所述NP直接共价结合。
47.包含与抗体-识别表位(ARE)共价结合的至少一个抗原的化合物，其中所述抗原是来自甲型流感 H5N1 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) Genebank 蛋白检索号 #ABI36003 的核壳蛋白(NP)，并且所述ARE是权利要求1-11中任一项的VP-1表位，其中所述ARE与所述TNP直接共价结合。
48.编码权利要求1-11中任一项的VP-1表位的核酸，其操作性连接到编码抗原的核酸上。
49.表达盒，所述盒包含连续连接到权利要求48的核酸上的启动子。
50.权利要求49的表达盒，其中所述启动子是组织-特异性启动子。
51.权利要求49的表达盒，其中所述启动子是诱导型启动子。
52.权利要求49的表达盒，其中所述启动子是CMV、RSV、EFa-1或T7启动子。
53.包含权利要求48-52中任一项的表达盒的载体。
54.权利要求53的载体，其`中所述载体是腺伴随病毒(AAV)载体。
【文档编号】A61K39/12GK103826657SQ201280027239
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年4月4日 优先权日:2011年4月4日
【发明者】G.比肖普, T.范登布什 申请人:衣阿华大学研究基金会