用于再生医药和用于组织支持物的生物相容的并且可生物降解的梯度层系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，其包含至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联聚合物的层组和至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层，其中优选地形成有关至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联聚合物的层组和／或至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层的一层或多层的机械和／或物理性能的梯度。至少一个支持层优选地包含生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物和／或生物相容的和可掺入的材料。此生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可用作用于再生医药，特别是作为伤口敷料或用于组织支持物的生物材料。本发明也提供了利用所述发明的梯度层系统的方式和用于生产其的方法。
【专利说明】用于再生医药和用于组织支持物的生物相容的并且可生物降解的梯度层系统
[0001]本发明涉及生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，其包含至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层，其中优选地形成关于至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和/或至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层的一层或多层的机械和/或物理性能的梯度。至少一个支持层优选地包含生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物和/或生物相容的和可掺入的材料。此生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可用作用于再生医药，特别是作为伤口敷料(dressing)或用于组织支持物的生物材料。本发明也提供了利用所述发明的梯度层系统的工具和生产所述梯度层系统的方法。
[0002]在再生医学中，上皮灼伤案例的发生率日益增长。这些大伤口的治疗一般通过完全去除受损组织进行。随后，将健康皮肤从患者的未受影响区域移植到待治疗的伤口处。移植皮肤移植物必然需要侵入性手术并涉及大面积的皮肤。因此这些治疗不仅痛苦，而且具有感染、形成疤痕的风险，由于伤口的尺寸过大还可能伴随伤口愈合困难。
[0003]新方法已显示，这些伤口也可通过开发的用于再生医药的新材料，特别是伤口敷料材料治疗。在此上下文中，用于再生医药的生物材料不仅应具有包括去除溢泌物和保护伤口的能力，而且也应具有足够的机械性能，因为它们必须抵抗一般在组织和移植物中局部出现的剪切力。可满足这些要求的理想的伤口敷料材料的若干其他特征为，例如用于气体渗透的高孔隙率和用于保护伤口免于感染和脱水的良好屏障。基于这些要求，开发的用于再生医药的候选生物材料，特别是伤口敷料材料必须通过评估以验证其既是良好屏障又具有良好的氧气渗透性。另外，这样的材料应理想地支持新组织在伤口上的生长，并因此优选地与待替换的组织的脚手架结构或至少与允许脚手架结构的细胞内向生长和/或新生血管形成的脚手架结构类似。
[0004]可适用于这些目的的用于再生医药的生物材料优选地由生物相容性材料组成。在本领域存在许多生物相容性材料的例子，但由于各个材料的机械和物理限制，仅可有效使用其中的一部分。
[0005]通常在本领域中使用的材料可分为天然存在的聚合物和合成的聚合物。天然存在的聚合物一般显示良好的生物相容性和生物降解性。合成的聚合物部分也显示良好的生物相容性和部分生物降解性。然而，这些合成聚合物的制备经常需要应用细胞毒性物质例如催化剂、细胞毒性溶剂，和/或这些聚合物可能包含单体或有机溶剂。这些杂质不能被完全去除，因此可能在最终聚合物中以细胞毒性成分残留。特别地，这些杂质可能导致周围组织的炎性反应，待治疗患者在移植位点的有害免疫反应，甚至导致移植物的变态反应或移植排斥反应。
[0006]—种提供非常好的生物相容性和甚至更优选地，良好生物降解性的卓越的天然存在的聚合物是明胶。明胶是广泛用于药物和食物工业的蛋白质，其以相对低的价格大规模生产。其也显示了对水蒸气的有限屏障，这特别有利于制备有效的伤口敷料材料。由于其功能性质，其已被进一步用于生产可食用和/或可生物降解的膜。然而和大多数基于蛋白质的膜类似，其具有有限的机械性能并显示对剪切力的糟糕的稳定性和抵抗，使其难以应用于用于再生医药的生物材料。
[0007]因此本领域的许多研究试图提供基于明胶的改进的生物材料，通过在组合的聚合物溶液中混合明胶和合成的、机械上更稳定的聚合物以得到良好或改进的机械稳定性。这些合成的、机械上更稳定的聚合物是，例如聚己内酯(PCL)，聚交酯(PLA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚氨酯(TO)，等等。然而这些混合的聚合物显著降低了明胶和其他天然存在聚合物的优越品质，因为它们降低了对水蒸气的有限屏障，降低或甚至破坏了明胶的优秀的生物相容性能，甚至可能导致周围组织的炎性反应，待治疗患者在移植位点的有害免疫反应，甚至导致移植物的变态反应或移植排斥反应，原因是使用已在单独的合成聚合物中讨论的细胞毒性溶剂。 [0008]在例如美国专利申请US2002 / 0090725A1中讨论了一种这样的方法，其中公开了电处理的胶原和电处理的混合的聚合物组合物，所述组合物包含胶原与合成聚合物的组合，所述合成聚合物为例如聚氨酯，聚硅氧烷或聚硅酮，聚乙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯，聚N-乙烯基吡咯烷酮，聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙烯醇，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，聚乙二醇，合成的聚阳离子(例如聚乙烯亚胺)，合成的聚阴离子(例如聚苯乙烯磺酸盐和聚甲基丙烯酸)，聚甲基丙烯酸，聚交酯(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，尼龙，聚酰胺，聚酸酐，聚乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)，聚己内酯，聚乙酸乙烯酯(PVA)，聚环氧乙烷(PEO)和聚原酸酯或其他类似的可开发的生物相容的合成聚合物。不幸地是，这些合成聚合物只有一部分是可生物降解的，因此如果它们不能或不永久掺入体内的话则需要在应用后去除。因此这些不可生物降解的聚合物适合临时应用。另外，尽管US2002 / 0090725A1的混合的聚合物可能显示了增强的机械性能，它们没有去除如上讨论的可能的有害副作用的缺点。此外，这些材料和由其制成的聚合物基质仅提供了有关细胞向内生长、水和蒸气渗透性等的有限的能力。
[0009]在US2003 / 0232746中的另一种方法涉及稳定化的交联的水凝胶基质，其包含第一闻分子量组分和第二闻分子量组分。两种闻分子量组分共价交联，其中第一闻分子量组分和第二高分子量组分分别选自多聚糖和多肽，优选任意组织来源或合成产生的多肽，例如胶原或胶原来源的明胶，更优选葡聚糖和明胶。组合物还含有至少一种稳定剂或增强剂。尽管提供了多种不同功能和改进的机械性能，US2003 / 0232746的稳定化的交联的水凝胶基质在制备基质时需要交联剂，所述交联剂在交联后可能不能充分去除，因此保留在最终的聚合物基质中。如上所述，这些残留物可能导致如上讨论的周围组织的变态反应和炎性反应，还可能由于未反应的交联剂化合物导致细胞毒性作用。
[0010]另一篇文件，Lelkes等人(US2006 / 0263417)公开了作为组织工程脚手架的天然和合成聚合纤维的电纺丝掺合物。如在Lelkes等人中开始讨论的，将共纺作为首先的方法，各个材料在不同的注射器中，通过电纺丝在支持物上同时应用材料以提供在机械上改进的但仍然多孔的基质。然而作者放弃了此方法。作者反而意识到展示较低密度纤维网络的材料可能是有利的。作为此问题的解决方案，Lelkes等人(US2006 / 0263417)提出了包含不经交联的至少一种合成聚合物和至少两种天然聚合物的电处理的掺合物的纤维。优选地，至少两种天然聚合物之一是弹性蛋白或弹性蛋白的前体形式或弹性蛋白样材料。Lelkes等人(US2006 / 0263417)预期这些基质比现有技术基质展示更多孔的脚手架，并观察到其在细胞培养基中维持稳定。然而，Lelkes等人(US2006 / 0263417)青睐的不同的天然存在材料和合成材料的掺合物，由于如上已经讨论的在一种聚合物混合物中掺合这些聚合物显著改变和损害了这些聚合物的优越品质。
[0011]Carvalho 等人(见 Carvalho 等人，Brazilian Journal of ChemicalEngineering,第 23 卷，N0.01,第 45-53 页，January-March, 2006)报导了改进明胶的机械性能的另一种方法，虽然是在另一种情况下。如文中讨论的，制备明胶膜用于可食用和/或生物降解的膜，其中进一步交联明胶。结果，交联度的增加通过扩散性降低导致水蒸气渗透性的降低和机械特征的改进。然而，较不优选高交联比，因为其导致特别小的孔并显著降低可能的细胞的向内生长。
[0012]在Lee等人(US2008 / 0233162A1)中描述了和前面讨论的类似的方法。Lee等人公开了用于组织再生的纤维状多孔三维脚手架，其包含聚合物和/或低分子纤维。此聚合物和/或低分子纤维是由一种或多种合成的可生物降解的脂肪族聚酯或一种或多种天然聚合物组成的可生物降解的聚合物。聚合物通过电纺丝在三维网络结构上形成，并可单独使用或在聚合物的混合物中使用。然而Lee等人(US2008 / 0233162A1)没有提供可克服根本问题的其他替代物。
[0013]Kim 等人(见 Kim 等人,Biomed.Mater.4, (2009) 044106 (Ilp))公开了惨合的纳米纤维脚手架，其分别使用合成和天然聚合物，聚氨酯(PU)和明胶，使用电纺丝法制备用于伤口敷料的材料。他们测定了此明胶/PU掺合的纳米纤维脚手架的性能，发现这些纳米纤维的平均直径是均匀地电纺成的，范围从0.4至2.1 μ m。根据结果，当掺合的溶液中的明胶量降低时，接触角增加且脚手架的水摄入同时降低。在机械试验中，掺合的纳米纤维脚手架是有弹性的，且弹性随PU总 量的增加而增加。此外，当明胶总量增加时，相同培养时间下的细胞增殖增加。然而，尽管此明胶/PU掺合的纳米纤维脚手架在作为伤口敷料中具有潜在应用，将脚手架的天然聚合物与其他聚合物掺合仍然损害了脚手架的天然聚合物的优越性倉泛。
[0014]US2010 / 0129450涉及组合物和用于制备包含至少一种天然生物材料组分和至少一种合成聚合物材料的电纺丝基质的方法。天然组分使基质高度生物相容，而分子量聚合物成分可通过增加电纺丝期间溶液的粘度和纺丝特征赋予脚手架额外的机械强度和/或改进制备的容易度。与讨论的本领域的其他方法和脚手架类似，US2010 / 0129450在电纺丝基质的制备中利用不同聚合物的掺合物。如已经陈述的，这样的掺合物通过将脚手架的天然聚合物与其他聚合物掺合可损害脚手架的天然聚合物的优越性能，并因此可仅提供有关例如气体渗透和脱水的有限性能，或可能不足以允许细胞向内生长和新组织结构的形成。
[0015]综上，现有技术方法提供的生物材料仍然具有若干缺点，例如糟糕的细胞向内生长，不足的机械稳定性，细胞毒性等等。因此，本发明的目的是提供用于再生医药，优选用于伤口敷料和组织支持物的新生物材料，其允许在其脚手架结构中有效培养细胞，显示良好的机械性能，用于气体渗透的高孔隙率和用于保护伤口免于感染和脱水的良好屏障，但不损害应用的天然或合成聚合物的优越品质。此外，这样的生物材料应有效支持细胞的向内生长和新组织结构(例如细胞外膜或功能器官组织)的形成。[0016]本发明的此目的通过本发明公开内容随附的权利要求解决。
[0017]优选地，根据第一实施方案，本发明的目的通过生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统解决，所述梯度层系统包含至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层，其中优选地形成关于至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和/或至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层的一层或多层的机械和/或物理性能的梯度。优选地，通过改变发明的梯度层系统的至少一个层或层组内或若干个层或层组之间的机械和/或物理性能形成梯度。优选地，机械和/或物理性能包括例如机械强度、孔大小、纤维强度、纤维长度等。纤维强度特别地表示纤维的宽度或直径，其一般进而决定纤维的机械强度。在本发明的上下文中，术语“纤维强度”因此优选地指如本文定义的纤维的宽度或直径。生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统优选地是水不溶性的。
[0018]由于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，本发明有效允许本系统适用于伤口治疗中出现的多种不同情况。发明的梯度层系统提供了具有良好生物相容性的新的和有弹性的生物材料，广泛应用于烧伤泊疗，由于手术治疗、癌症或其他疾病的损伤或伤口的治疗，以及慢性伤口的治疗和重建整形外科。发明的梯度层系统还可容易地适应于例如待治疗的伤口或损伤的不同生物力学需要。发明的梯度层系统还可补充多种不同化合物，例如生长因子、白介素等。由于发明的梯度层系统在其不同层或层组中的可调节的机械强度，其另外显示了适时的体内延迟降解。这允许补充了这样的发明的梯度层系统的组织在伤口的短期或长期治疗期间通过生长进入所述人工组织或脚手架有效取代发明的梯度层系统。其也允许发明的梯度层系统的缓慢降解，优选地用于软组织结构，和/或发明的梯度层系统的掺入，优选地用于硬组织结构。由于发明的梯度层系统的一致结构，发明的梯度层系统本身也允许有效和全面地在层组或层上培养例如自体细胞。这有效允许制备人工组织构建体甚至人工器官，包括 在所述人工构建体或器官中建立功能性血管系统。此外，可将抗菌聚合物(AMP)整合进聚合物或电纺丝聚合物纤维中。
[0019]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可用作用于再生医药，特别是用作伤口敷料或用于组织支持物，特别是用于软和/或硬组织支持物的生物材料。其优选地是生物相容的、可生物降解的、水不溶性的并有效支持细胞向内生长进入其脚手架结构并形成新的组织结构，例如细胞外基质和/或膜，功能器官组织或任意其他组织。其还显示良好的机械性能且不损害应用的天然或合成聚合物的优越品质。
[0020]本发明的第一实施方案定义了生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，其包含至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组。
[0021]在此上下文中，可优选地将术语“层组”解释为例如聚合物纤维或任意其他化合物的至少一个“单层”的三维排列。因此，这样的“层组”可由一个或多个“单层”组成，即层组可包含例如 1,2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10，1-15,10-25，15-30，10-50 或 10-100 个或甚至更多个“单层”。因此，由于这样的“层组”的生产，在此上下文中可将“层组”理解为近似无纺绒布、垫子或绒布样或垫子样的结构，其包含一个或多个单层，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，1-15，10-25，15-30，10-50 或 10-100 或甚至更多层。
[0022]此外，将术语“梯度层系统”优选地理解为包含如本文定义的层或层组的层系统，其中这些层或层组在发明的梯度层系统的至少一个层或层组内或在几个层或层组之间形成有关机械和/或物理性能的梯度。优选地，形成关于至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层的机械和/或物理性能的梯度，优选地通过改变、增加或降低一个或多个这样的层或层组的机械和/或物理性能，例如机械强度、孔大小、纤维强度、纤维长度等。因此，这样的梯度可在一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组内，从一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组到另一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，从至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组到至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层，从至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层到至少另一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层等，及其组合之间改变。
[0023]根据一个方面，通过改变一个或多个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组的机械和/或物理性能，在一个或多个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组内或之间形成这样的梯度。这优选地通过改变(增加或降低)包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的至少一个层组内或若干个层组(例如2，3，4，5或甚至更多个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组)之间的机械和/或物理性能例如机械强度、刚度、孔隙率、纤维强度等实现。至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组优选地充当组织样脚手架结构，其允许细胞培养和向内生长和形成组织样结构或细胞外样膜。
[0024]根据一个具体的方面，可通过改变在如上定义的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个层组内的机械和/或物理性能形成梯度。在此上下文中，可通过在同一个层组中的聚合物纤维的改变的(例如增加的或降低的)纤维强度，优选宽度或直径优选地形成梯度，其中优选地在从单层到单层之间改变纤维强度。可通过改变用于此目的的聚合物的粘度和/或交联比，优选地在应用前立刻或应用期间，例如通过在应用前立刻加入交联剂使得在应用期间继续交联并增加粘度和交联比，实现纤维强度，优选宽度或直径的改变。例如， 可通过增加用于此目的的聚合物的交联比，特别优选在应用过程中进行，实现纤维强度的增加。同样地，可通过增加用于此目的的聚合物的粘度，特别优选在应用过程中进行，实现纤维强度的增加。在单层或层组的制备中，这样增加聚合物的粘度和/或增加的交联比一般导致增加的纤维强度，优选宽度或直径。同样地，可通过降低用于此目的的聚合物的粘度和/或降低交联比实现纤维强度的降低。在制备整个层组期间，也可机械地调节制备过程以产生改变的，优选增加或降低的纤维强度。
[0025]通过改变，优选增加或降低根据本发明定义的纤维强度形成的梯度可对应随层或层组的高度和/或数目的纤维强度的改变，优选增加或降低。优选地，宽度或直径随层或层组的高度和/或数目而增加。此随层或层组的高度的纤维强度的改变，优选增加或降低可出现在如本文定义的一个层或层组内，或甚至在具有其不同的层或层组的整个发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中。优选地，纤维强度，更优选地纤维宽度或直径可在如本文定义的一个层或层组内，或甚至在具有其不同的层或层组的整个发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中改变，优选增加或降低例如约0.0001 μ m-约2 μ m每μ m层或层组高度，优选约0.0001 μ m_约I μ m每μ m层或层组高度，更优选约
0.001 μ m-约0.01 μ m每μ m层或层组高度,甚至更优选约0.005 μ m_0.01 μ m每μ m层或层组高度。
[0026]可选或另外地，这样的梯度可通过层或层组的制备过程确定，例如通过在所述制备中按照时间增加或降低纤维强度，优选纤维的宽度或直径。例如，通过在制备过程中增加或降低至少一个层组的纤维强度，优选纤维的宽度或直径约Iym /至约500nm / h，约100 μ m / h 至约 500nm / h,约 Inm / h 至约 500nm / h,或约 IOnm / h 至约 500nm / h,优选地约 IOOnm / h 至约 400nm / h，例如约 100，150，200，250，300，350 或 400nm / h，例如280nm / h确定梯度。 [0027]可选地，可通过不同的层组形成梯度，每个层组优选地包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物。在此上下文中，在同一层组内的聚合物纤维的纤维强度可在上述定义中保持恒定，但相对下一个/其他层组改变，其中聚合物纤维优选地展示不同的强度。
[0028]优选地，如本文定义的聚合物纤维，优选具有本文定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的单层或至少一层或具有生物相容的并且优选可生物降解的支持层的聚合物纤维，可展示在约Inm至约500 μ m,约Inm至约250 μ m,约Inm至约100 μ m,约 Inm 至约 50 μ m,约 IOnm 至约 500 μ m,约 IOnm 至约 250 μ m,约 IOnm 至约 100 μ m,约 IOnm至约50 μ m,约50nm至约500 μ m,约50nm至约250 μ m,约50nm至约100 μ m,约50nm至约50 μ m之间的强度，优选宽度或直径。
[0029]根据第一实施方案，生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统包含至少一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。在此上下文中，适合作为生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的聚合物一般选自技术人员已知的生物相容的并且可生物降解的任何聚合物。这样的聚合物优选地包括任意天然存在的聚合物或多肽，优选细胞外基质蛋白质或多糖。细胞外基质蛋白质是在此上下文中合适的优选多肽类别。实例包括但不限于胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等等。这样的多肽可从天然来源得到，例如从动物，优选哺乳动物，例如奶牛、猪、绵羊等等。这些多肽和分子各自的多种类型是天然存在的。同样地，这样的多肽可合成制造或通过基因工程产生。例如，存在许多形式和类型的胶原，并且本文涵盖所有这些类型和子集。
[0030]在此上下文中合适的特别优选的多肽的组是任意类型的胶原或其片段或产物。胶原是动物的细胞外基质的主要蛋白质组分。胶原组装成复杂的纤维状组织。原纤维组装成形成纤维的束。原纤维由处于交错排列的5条微原纤维构成。每条微原纤维是胶原棒的聚集。每根胶原棒是右手三股螺旋，每条链自身是左手螺旋。胶原原纤维通过共价的分子内和分子间交联加固，这使成熟动物的此基质不溶于冷水。优选地，在如上陈述的术语的完整含义内的胶原可包括全长胶原、胶原片段和/或类似物，包含相对任意类型或种类的胶原的保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代和/或具有非天然存在的氨基酸或残基的取代的胶原。在本发明中使用的胶原可源自天然来源，可合成制造，可通过基因工程产生，或可通过任意其他方式或其组合产生。天然来源包括但不限于，活生物组织产生或含有的胶原。例如，在本发明中使用的胶原可包括但不限于，自体胶原、来自同种器官的胶原或来自另一物种的胶原。可使用的一些胶原包括但不限于1，11，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII，XIV，XV，XVI，XVII，XVIII和XIX型胶原。一些优选的胶原包括I和III型。合成的胶原可包括通过任意人工手段产生的胶原。产生胶原和其他蛋白质的多种方法是本领域公知的。可使用特异性序列制备合成的胶原。例如，可使用与天然胶原不同的特定的期望氨基酸序列制备基因改造的胶原。可通过任意方式，包括例如肽、多肽或蛋白质合成产生改造的胶原。例如，可体内或体外基因改造细胞以产生胶原或能够形成胶原或胶原亚结构域的分子，然后可收获期望的胶原。在一个说明性的方面，可包括比在天然胶原中存在的量更多的期望序列，其在胶原蛋白上形成细胞或肽的结合位点。本文使用的胶原也可由胶原自身或由形成胶原结构的任意其他材料在制备由其形成的各个层期间形成。实例包括但不限于，氨基酸、肽、变性的胶原例如明胶、多肽和蛋白质。可在制备各个层前、期间或后形成胶原。例如，可在制备各个层前、期间或后通过组合前胶原和前胶原肽酶形成胶原。当使用合适的处理时，可提取和溶解胶原棒，其中胶原棒保持其三股螺旋的构象。这是变性的胶原，与胶原的天然形式不同，但还未经历足够的热或化学处理以破坏在胶原中存在的分子内稳定化共价键。当彻底加热胶原溶液，或当含有天然胶原的组织经受化学和热处理时，稳定胶原螺旋的氢键和共价键被破坏，分子采用无序构象。通过破坏这些氢键，极性氨基和羧酸基现在能够结合来自其他来源或自身的极性基团。此材料是明胶，一种变性胶原形式，通过动物皮肤、白色结缔组织或骨骼来源的胶原的部分水解得到。明胶可源自酸处理的前体或碱处理的前体。源自酸处理的前体的明胶被称为A型，而源自碱处理的前体的明胶被称为B型。在化学和部分热水解中与胶原降解相关的大分子结构改变基本相同。在热和酸催化的降解的情况下，在个体胶原链内主要是水解切割。在碱水解中，主要是分子间和分子内交联的切割。因此，本文使用的多肽也可包含选自A型和B型明胶的明胶。胶原和由其制备的明胶优选地具有约2，OOO至约5，000, OOODa,更优选地约10，OOODa至约1，000, OOODa,例如约20，OOODa至约80，OOODa,或约30，OOODa至约70，OOODa的分子量范围。
[0031]同样地，用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个层组的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物可选自多糖，优选地包括糖胺聚糖(GAG)或葡糖胺聚糖。糖胺聚糖表示包含具有重复的二糖单位的无分支的(或分支的)多糖链的任意聚糖(即，多糖)，所述二糖之一总是氨基糖。这些作为携带高负电荷的化合物类别是强亲水的，一般被称为粘多糖。这组多糖包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。这些GAG主要存在于细胞表面和细胞外基质中。葡糖胺聚糖表示主要含有单糖衍生物的 任意聚糖(即，多糖)，其中醇羟基被氨基或其他功能基团例如硫酸或磷酸基团取代。葡糖胺聚糖的实例是聚N-乙酰葡糖胺聚糖，一般被称为壳聚糖。可用于本发明的示例多糖包括葡聚糖、乙酰肝素、肝素、透明质酸、藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶、支链淀粉、直链淀粉、糖原、淀粉、纤维素、几丁质、壳聚糖和多种硫酸化的多糖，例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素或硫酸角质素。多聚糖组分优选地具有约2，000至约8，000, OOODa,更优选地约20，000至约1，000, OOODa的分子量范围。
[0032]优选地，生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物选自胶原、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白、多糖、聚糖或多聚糖，或其组合。
[0033]可使用交联剂交联用于制备发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个层组的如上定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物。这样的交联剂的选择优选地取决于待交联的聚合物，优选如上定义的多肽或多糖。大体上，在本发明的上下文中合适的交联剂可包含，但不限于，酸酐、氮丙唳、epoxydes、醒、异己酮、氨基酸,例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸或其衍生物，或任意其他天然或非天然存在的氨基酸，儿茶酚胺，例如儿茶酚、肾上腺素、去甲肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺和携带儿茶酚或1，2-二羟基苯部分的任意其他化合物，优选甲醛、二醛，例如戊二醛、乙二醛、乙二醛三聚体二水合物、二甲基辛二亚氨酸酯和二甲基3,3' -二硫代双丙亚氨酸戍二醒(dimethyUd' -dithiobispropionimidadteglutaraldehyde),环氧化物(例如双环氧乙烧)、氧化的葡聚糖、对叠氮苯甲酰肼、N_[([α ]_马来酰亚胺乙酸基]琥珀酰亚胺酯、对叠氮苯基乙二醛单水合物、双(β-[4-叠氮水杨酰氨基]乙基)二硫化物、双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、1-乙基-3-[3_ 二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、选自半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸或其衍生物的二酰基氯化物氨基酸，如上定义的儿茶酚胺，和本领域技术人员公知的其他功能性交联剂。甲醛、乙二醛和戊二醛与氨基酸侧链，特别是与赖氨酸ε-NH2基反应，形成与SchifT碱的形成中类似的键。此外，合适的交联剂，优选地用于本文定义的一种或多种多肽的交联剂包括但不限于下述交联剂，如醛，例如戊二醛、碳二亚胺EDC(1-乙基-3(3 二甲基氨基丙基))、在暴露于特定波长的光或辐射(例如紫外光)后交联的感光材料，其选自四氧化锇、碳二亚胺盐酸盐和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)，和因子XIIIa。戊二醛是用于胶原或明胶的理想的交联剂。可选地，可通过加入纤连蛋白和或硫酸肝素，或通过赖氨酰氧化酶酶促级联交联胶原或明胶。同样优选地，可交联多糖和例如二酰基氯化物，以形成二酯交联物。另外，可使用酚类化合物，包括单酚和多酚化合物，优选多酚化合物作为本文定义的聚合物的交联剂。这样的酚类化合物，优选多酚化合物，优选地选自(i) 一般适度溶于水的化合物，(ii)具有约500-4000Da的分子量，(iii)优选地包含 > 约12个酚羟基，和(iv)优选地展示约5-7个芳香环/ 1000Da0具体优选的多酹化合物包括鞋质、没食子鞋质(Sigma-Aldrich),根据White-Bate-Smith-Swain-Haslam(WBSSH)定义而定义的化合物，优选原花色素例如矢车菊苷配基、可水解鞣质和phlorotannins,以及酹类化合物,特别是能够复合胶原和其他生物分子的酹类化合物，例如在 Quideau 等人，Angew Chem Int Ed Engl.2011, 50 (3):586-621 中定义的。酌.类化合物也包含例如姜黄素(curcumin),白藜芦醇(resveratrol),其相关衍生物，没食子酸(gallic acid),绿原酸(chlorogenic acid),咖啡酸，鼠尾草酹(carnosol),辣椒素(capsaicin) ,6-姜烯酮(shogaol) ,6-姜酮醇(gingerol)，及其相应的衍生物，类黄酮，黄烧醇(flavanol)，新类黄酮，酹酸，等等，例如熊果苷(arbutin)，洋蓟酸(cynarin)，疗黄素(apigenin)，isocuttelarein，木樨草素(Iuteolin)，川陈皮素(nobiletin)，桔皮素(tangeretin),杨芽黄素(tectochrysin),高良姜精(galangin),山柰酹(kaempferol),杨梅酮(myricetin),懈皮素(quercetin),芦丁(rutin),梓樣素(citrin), curcurocitrin,圣草酹(eriodictyol),橙皮苷(hesperidin),柚皮素(naringenin),柚皮苷(naringin),松属素(pinocembrin),槲皮苷(quercitrin),鹰嘴豆素 A (biochanin),白杨素(chrysin),大豆苷元(daidzein),雌马酹(equol),芒柄花黄素(formononetin),染料木素(genistein)，黄豆素(glycetein)，依普黄酮(ipriflavone), lactuin, lactuin，碧萝]E(pycnogenol),水飞蓟素(silymarin),木质素(Iignin),等等,或类姜黄素化合物,例如姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素等等。除了共价键合以外，可选或另外地，在酚类化合物和蛋白质之间也可存在氢键的形成和电相互作用。[0034]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组可通过交联如上定义的合适的(生物相容的并且可生物降解的)聚合物，优选如上定义的(生物相容的并且可生物降解的)多肽或多糖，并用交联的聚合物通过至少一个单层，优选一个或多个组成层组的单层形成层组来制备。
[0035]用生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物形成包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组可通过技术人员已知和合适的任意方法，更优选地通过电处理方法进行。在此上下文中，术语“电处理”优选地应被广义地定义为包括材料的电纺纱、电喷射、电喷雾、电沉积和电喷溅的所有方法，两种或多种这些方法的组合，和其中聚合物可通过流动、喷射、喷溅或滴落穿过电场并朝向靶的任意其他方法。电处理的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物可从一个或多个接底面的储库朝优选带电的基质方向经电处理，或从优选带电的储库朝接底面的靶经电处理。“电沉积”包括任意类型的通过电方式在靶上沉积如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物。为此目的，优选地从溶液形成纤维，或通过使优选带电的溶液流动熔化纤维，或通过孔口熔化纤维并沉积在靶上。“电纺丝”优选地表示从溶液形成纤维，或通过使优选带电的溶液流动熔化纤维，或通过孔口熔化纤维的过程。“电喷雾”优选地表示其中从溶液形成小液滴，或通过使优选带电的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物溶液熔化，或通过孔口熔化小液滴的过程。术语电处理不限于本文陈述的特定实例，并且其包括使用电场用于在靶上沉积材料的任意方式。优选地，可通过电纺丝进行用生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物形成层组。
[0036]适于通过任意上述方法将如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物电处理为至少一个层或层组的电处理装置包括电处理机械装置和靶。在优选的方面，电处理机械装置包括一个或多个容纳包含将待被电处理(例如电纺丝或电沉积)的如本文定义的生物相容的并且 可生物降解的交联的聚合物的一种或多种溶液的储库。一个或多个储库具有至少一个孔口、喷嘴或其他装置，以允许包含如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的溶液从储库流出。电处理的发生一般是由于在孔口或靶上存在电荷，而另一个接底面。在用于制备电处理的组合物的材料的电处理中，基底也可用作可变特征。具体地，靶可为用于制备电处理的基质的材料的实际基底，或沉积电处理的基质本身。可选地，可在靶和喷嘴之间放置基底。靶也可特定地沿预选的图式带电或接底面，使得从孔口流出的溶液朝向特定方向。可通过微处理器控制电场以制造具有期望的几何学的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的电处理的层或层组。可将靶和一个或多个喷嘴改造为可相对彼此移动的，从而允许另外控制待形成的电处理的层或层组的几何学。本发明允许形成具有预定形状，例如适合于例如待治疗患者的伤口的特定形式的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层或层组。
[0037]用生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物形成用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的层组可通过逐步制备一个或多个单层以形成如上定义的包含(可生物降解并且生物相容的)交联的聚合物的层组进行，优选地，其中在如上定义的前一层上形成每个新层，从而形成层组。
[0038]可在特定溶剂的存在下形成用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。在例如通过电处理，优选通过电纺丝形成层组前，这样的溶剂可优选地已用于溶解生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，或溶解如上定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物和任选地如本文定义的交联剂。这样的溶剂可选自但不限于，用于溶解或悬浮如本文定义的聚合物或多糖的溶剂。这样的溶剂可包含但不限于，水、乙酸乙酯、乙酸、水、乙酸乙酯和/或乙酸的混合物，2,2, 2_二氣乙醇、1,1,1,3,3, 3_六氣~2~丙醇(又称六氣异丙醇或HFIP)、尿素、乙酸、一氣乙酸、三氟乙酸、三氟乙酸酐，低级醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等，卤代醇、乙酰胺、N-甲基甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酸乙酯、乙腈、1，1，1-三氟丙酮、顺丁烯二酸、六氟丙酮、氯仿，和三氟乙醇(TFE)或其组合。由于电纺丝技术经常需要更特定的溶剂条件，可取决于使用的具体聚合物，例如如本文定义的多肽或多糖选择溶剂。例如，可在例如水、乙酸乙酯、乙酸，水、乙酸乙酯和/或乙酸的混合物，2, 2, 2- 二氟乙醇、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(又称六氟异丙醇或HFIP)或其组合的溶液或悬浮液中对胶原和明胶进行电纺丝。可从例如尿素、一氯乙酸、水、2，2，2-三氟乙醇、HFIP或其组合的溶剂中对纤维蛋白单体进行电纺丝。可在例如水、2,2,2-三氟乙醇、异丙醇、HFIP或其组合，例如异丙醇和水的溶液或悬浮液中，优选从含有250mg/ml弹性蛋白的70%异丙醇和30%水的溶液中对弹性蛋白进行电纺丝。任选地在存在交联剂的情况下，可通过在如上定义的溶剂中溶解至少一种如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物或至少一种如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物进行对应的溶液的制备。
[0039]形成用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组还可以如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物的熔化物形式进行。为此，一般将如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物加热至其熔点。熔化物可含有如本文定义的交联剂。可选或另外地，在制备层组后，可交联通过熔化物制备的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。
[0040]用于发明的生 物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的用交联的聚合物形成的层组优选地具有支持细胞粘附和铺展、生长、增殖、分化和发育或迁移的三维网络超微结构。层组的单根纤维之间的空间距离对细胞能够得到用于生长的营养物以及允许进行细胞-细胞相互作用或迁移起重要作用。因此，根据本发明的具体的方面，纤维之间的距离可为约Inm至约500 μ m,优选地约Inm至约100 μ m,约Inm至约500nm,约Inm至约IOOnm,约Inm至约50nm,约Inm至约30nm,或甚至约IOnm至约30nm,例如约50nm,约IOOnm,约150nm,约 200nm,约 250nm,约 300nm,约 350nm,约 600nm,约 750nm,约 800nm,约 850nm,约 900nm,约 950nm,约 1000nm (I μ m), 10 μ m), 10 μ m), 50 μ m),约 100 μ m)，约 150 μ m)，约 200 μ m)，约 250 μ m)，约 300 μ m)，约 350 μ m)，约 400 μ m)，约 450 μ m)，或约 500 μ m)。根据优选的方面，纤维之间的距离可包含所引用的范围或由上述数值中的任两个形成的任意范围之间的任意长度。
[0041]也可通过操纵电纺丝的参数控制用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的用交联的聚合物形成的层组的孔大小。根据特定的方面，用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的用交联的聚合物形成的层组具有足够小的孔大小，使得一种或多种细胞类型不能渗透。这样的孔大小优选地用于层组，其可用作发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的外表面，例如用于保护伤口、器官、特定组织免受外部影响或用于身体先天组织细胞的渗透。在一个方面，用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的用交联的聚合物形成的层组的平均孔直径为约Inm至约500 μ m,优选地约Inm至约100 μ m,约Inm至约500nm,约Inm至约IOOnm,约Inm至约50nm,约Inm至约30nm,或甚至约IOnm至约30nm,例如约500nm或更小。在另一个方面，层组的平均孔直径为约Iym或更小。在另一个方面，层组的平均孔直径为约2μπι或更小。在另一个方面，层组的平均孔直径为约5μπι或更小。在另一个方面，层组的平均孔直径为约8μπι或更小。有些方面具有不阻碍细胞渗透的孔直径。在另一个方面，层组具有在约Inm2至约500 μ m2,约IOnm2至约100 μ m2,约0.1 μ m2和约100 μ m2,等等之间的孔大小(面积)。在另一个方面，层组具有在约0.1ym2和约50μπι2之间的孔大小(面积)。在另一个方面，层组具有在约1.0 μ m2和约25 μ m2之间的孔大小(面积)。在另一个方面，层组具有在约
1.0ym2和约5 μ m2之间的孔大小(面积)。
[0042]当制备层组时，也可通过混合致孔材料和聚合物操纵用于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的用交联的聚合物形成的层组的孔隙率。这样的致孔材料可为，例如盐或其他可提取的活性剂，其的溶解将在基质中留下确定大小的孔。也可通过在基质中存在的交联的量控制孔大小。同样地，可通过随后使用如上定义的交联剂，与经电处理的，优选经电纺丝 的包含如本文前面定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物的层组的交联，操纵层组的孔隙率。此外，这样的层组的操纵可通过加入例如多酚化合物和因此进一步交联进行。这样的多酚化合物优选地选自(i) 一般适度溶于水的化合物，(ii)具有约500-4000Da的分子量，(iii)优选地包含 > 约12个酚羟基，和(iv)优选地每1000Da展示约5-7个芳香环。具体地优选的多酚化合物包括鞣质、没食子鞣质(Sigma-Aldrich)，根据White-Bate-Smith-Swain-Haslam(WBSSH)定义定义的化合物,优选原花色素例如矢车菊苷配基、可水解鞋质和phlorotannins,以及酹类化合物,特别是能够复合胶原和其他生物分子的酌类化合物，例如在 Quideau 等人,Angew Chem Int Ed Engl.2011, 50 (3):586-621 中定义的。用这样的多酚化合物修饰层组一般导致层的单根纤维之间的交联的显著增加，因此导致层的机械强度的显著改进。这样的经修饰的层组可用作(进一步的)支持工具，例如作为保护外层等等。层组的修饰可整体或部分进行，例如在层组的边缘、边界或其他选定部分修饰。
[0043]如上定义，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组可由一个或多个“单层”组成，即，层组可包含例如 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，1-15，10-25，15-30，10-50 或 10-100 个或甚至更多个“单层”。包含如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的这样的层或层组可包含几nm至约几μ m或甚至mm的厚度，优选地在约Inm至约5mm,约Inm至约4mm,约Inm至约3mm,约Inm至约2mm,或约Inm至约Imm,更优选地约IOnm至约Imm,约IOOnm至约Imm,约I μ m至约Imm,约I μ m至约500 μ m,约I μ m至约250 μ m,约I μ m至约100 μ m,或约IOOnm至约100 μ m等的范围内。
[0044]可一步制备至少一个包含如上定义的生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组，或以连续方式以单层逐层制备。此外，如果制备多于一个包含如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，每个层组优选地如本文定义的用于包含如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。如果制备了多于一个如上定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，可单独制备每个层组或以连续方式继彼此之后制备。可在合适的支持物上，已经制备的如上定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组上，在至少一个如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的支持层等等上，或适用于此目的的任意表面或支持物(例如钢板、纸、玻璃、载玻片或任意物品容器、平皿、特氟龙表面，例如特氟龙箔、封口膜、铝板、铝箔、塑料箔等)上制备如本文定义的层组。在此上下文中，支持物或表面可为模型或模具，其类似于要重构的组织片段等的三维结构。
[0045]如果制备多于一个如上定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，可在如上定义的支持物上制备第一层组。继制备了这样的第一层组之后，可制备第二层组，其中这样的第二层组可类似地在如上定义的支持物上制备，或可在第一层组上制备，以得到2个层组的交错的结构。
[0046]这样的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，优选地处于如上定义的交错结构的这样的层组，可以各自合适的方向朝向彼此。例如，如果制备2个层组，可将展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的第二层组的侧面置于展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的第二层组的侧面上。同样地，可将展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的第二层组的侧面置于展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的第一层组的侧面上，优选地关于纤维的宽度或直径。可选地，可将展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的第二层组的侧面置于展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的第一层组的侧面上。同样地，可将展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的第二层组的侧面置于展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的第一层组的侧面上。
[0047]可依照如上定义的用于制备这样的层组的交错结构的相同原理制备另外的如上定义的包含生物相容的并且 可生物降解的交联的聚合物的层组。例如，可相应地在随后的层组上制备另外的如上定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组，以形成包含例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或甚至10个或更多个不同的如本文描述的层组的交错的层组，其中每个层组可如前面举例描述的第一和第二层组一样朝向随后的层组。例如，所有层组可包含相同的方向，即可将展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的一个层组的侧面置于展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的另一个层组的侧面上。同样地，可将展示较小孔隙率、较小纤维长度和/或较大纤维强度的一个层组的侧面置于展示较大孔隙率、较大纤维长度和/或较小纤维强度的另一个层组的侧面上。
[0048]可使用在不同层组中的相同或不同的上面定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，例如约1，2，3，4，或甚至5种或更多不同的上面定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物制备这样不同的如上定义的包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。特别优选的组合包括明胶和弹性蛋白，但不限于此。
[0049]此外，可使用在每个层组中的一种或多于一种如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，例如2，3，4，或甚至5种或更多不同的如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物制备包含如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的如上定义的层组。可通过如上定义的任意方法，优选通过电处理，例如电纺丝或电沉积，更优选地通过共纺丝，即如上定义的电纺丝进行这样的层组的制备，其中同时使用不同的如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物制备单层(例如对每种聚合物使用单独的喷嘴)。这里也适用如上定义的层组的任何定义，特别是有关聚合物纤维的强度和层组的机械和/或物理性能的改变，以及有关层组的修饰，不同层组相对彼此的方向，等
坐寸O
[0050]根据一个非常特定的方面，可使用下述步骤制备包含如上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的如上定义的层组: [0051](i)提供和制备用于电处理的聚合物溶液，优选地通过优选地在如本文定义的溶剂中，任选地在存在如本文定义的交联剂下，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，通过优选地在如本文定义的溶剂中，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物和如本文定义的交联剂，或通过任选地在存在如本文定义的交联剂下，熔化如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物；和
[0052](ii)电处理聚合物溶液中的至少一个层组，从而形成三维层组，其中当进行电处理过程时，优选地通过改变，更优选地增加或降低如本文定义的层组的纤维强度，形成如本文定义的梯度；并且任选地模塑产生的层组。如果使用溶剂，优选地在步骤(ii)中在电处理聚合物溶液的步骤期间使溶剂挥发。
[0053]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组可具有任意合适的形式。合适的形式包括但不限于，带、线、绒布、纤维、颗粒、滴状物或网或网眼样结构。合适的形式也可包含片、膜、箔或层压制件。优选地，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个包含可生物降解并且生物相容的交联的聚合物的层以绒布、网或网眼样结构存在。这些结构中的任一种可具有或不具有洞或腔。
[0054]作为另外的组分，根据本发明的第一实施方案的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统包含至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。这样的生物相容的并且优选可生物降解的支持层可包含生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物和/或可掺入的材料。在此上下文中可生物降解的并且优选生物相容的可熔化的聚合物可包括但不限于，适用于此目的的任意生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，例如聚酯、聚酸酐、多肽或聚氨酯例如聚己内酯PCL，优选聚ε -己内酯(PCL)、聚交酯PLA、聚乙醇酸交酯PGA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚癸二酸等，或生物聚合物例如明胶、藻酸盐、胶原、纤维蛋白等等。在此上下文中生物相容的并且可掺入的材料可包括但不限于，适用于此目的的任意生物相容的并且可掺入的材料，优选地例如陶瓷，例如用羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)等制成的陶瓷。如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的支持层也可包含这样的如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，所述聚合物含有如本文定义的可掺入材料。这样的生物相容的并且优选可生物降解的支持层优选地充当粘合剂和/或结构支持物以产生机械上稳定的生物复合材料。取决于期望的应用，这样的生物相容的可掺入的材料可用作硬支持物，用于例如硬组织补充或再生、骨修复
坐寸ο
[0055]在此上下文中，术语“可熔化”优选地表示在约20至25°C的室温和/或在待治疗的患者的正常体温，例如约37°C，可生物降解并且生物相容的可熔化的聚合物包含固态或半固态。因此，如本文定义的可生物降解并且生物相容的可熔化的聚合物可根据其熔点和玻璃化温度选择。如果在本文中用作支持层的可生物降解并且生物相容的可熔化的聚合物是有弹性的，可这样选择这样的聚合物的玻璃化温度，即使得聚合物在待治疗患者的正常体温处于其玻璃化点Tg之上。这允许聚合物链相对彼此移动，因此提供一定的弹性。另外，优选地这样选择聚合物，使其熔点在约20至25°C的室温和/或待治疗患者的正常体温，例如约37°C之上。例如，PCL的熔点为约60°C，其玻璃化温度为约_60°C。
[0056]可通过首先提供生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物制备根据第一实施方案的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。可选地，例如在如本文定义的溶剂中，优选地在聚乙烯醇(PVA)中，可提供如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液。根据另外的可选方案，可提供还包含如上定义的可掺入的材料的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物。然后可通过用熔化的聚合物，用如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或用可提供的还包含如上定义的可掺入的材料的可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物形成层，进行发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一层包含生物相容的并且优选可生物降解的支持层的制备。
[0057]在发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的上下文中，可通过技术人员公知的任意方法进行用熔化的聚合物，用如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或用任选地还包含如上定义的可掺入的材料的可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物，形成至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。这样的方法可包括如上定义的任意电处理方法，优选地材料的电纺丝、电喷射、电喷雾、电沉积和电喷溅法，两种或多种这些方法的组合，和其中聚合物可通过流动、喷射、喷溅或滴落穿过电场朝向靶的任意其他方法。电处理的聚酯可从一个或多个接底面的储库朝优选带电的基质方向经电处理，或从优选带电的储库朝接底面的靶经 电处理。
[0058]可选地和更优选地，在发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的上下文中，可通过快速原型技术，优选通过3D绘图(plotting)，例如使用3D绘图机(plotter)(例如Envisiontec公司的3D生物绘图机)进行用熔化的聚合物，用如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或用任选地还包含如上定义的可掺入的材料的可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物，形成至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。在此上下文中，优选地将快速原型理解为使用叠加制造技术(additive manufacturingtechnology)自动构建物体。这样的技术一般利用可熔化的聚合物的叠加制造用于计算机辅助设计(CAD)或动画建模软件的虚拟设计的快速原型，将其转化为薄的、虚拟的水平剖面，然后创建连续的层直到完成模型。
[0059]根据特别优选的方面，可从熔化的聚合物，用如上定义的可掺入材料的悬浮液或溶液，和/或用任选地还包含如本文定义的可掺入的材料的可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物，优选地使用3D绘图机，形成至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。可通过例如熔化聚合物或制备如本文定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，并在表面上提供熔化的聚合物或所述悬浮液或溶液，例如通过3D绘图机的分配器，随分配器的移动形成期望的单层，进行3D绘图。分配器通常将熔化的聚合物或悬浮液或溶液经分配器的喷嘴压或泵到如本文定义的表面上，例如通过气压。优选地，分配器可往任意期望的方向(上、下、左、右、前、后)移动，优选地具有可调节的速度，以形成期望的结构。在分配器移动期间，优选地将熔化的聚合物或悬浮液或溶液经喷嘴压出并提供例如纤维、带、点等或期望或得到的任意形式，优选地根据喷嘴的形式。在形成纤维、带、点等时，优选地形成预定的三维结构。这样的三维结构可包含聚合物或可掺入的材料的单层，或可由本文已公开的聚合物或可掺入的材料的若干单层组成。这样的单层也可形成包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的至少一个层组的如上文已定义的层组。这样的层组可由一个或多个“单层”组成，即层组可包含例如 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，1-15,10-25，15-30，10-50 或10-100个或甚至更多个聚合物或可掺入的材料的“单层”。这样的聚合物或可掺入的材料的层或层组可包含几nm至约几μ m或甚至mm的厚度,优选地在约IOOnm至约5mm,约IOOnm至约4mm,约IOOnm至约3mm,约IOOnm至约2mm,或约IOOnm至约Imm,更优选地约I μ m至约2mm,约I μ m至约1mm，约I μ m至约500 μ m,约Iym至约250 μ m,约IOym至约250 μ m,或约10 μ m至约100 μ m等的范围内的厚度。
[0060]在3D绘图期间，可适当调节温度。如果使用生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，任选地补充了如本文定义的可掺入材料的所述可熔化的聚合物，一般在使如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物以熔化的形式存在的温度进行3D绘图，其中一般调节温度以保持聚合物熔化直到经过喷嘴或针挤出。同样地，如果使用如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，一般不需要应用升高的温度。因此，一般根据如本文定义的每种生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物或可掺入的材料的具体要求选择应用和工作温度。为了应用熔化的聚合物和/或如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，可使用例如，高温或低温头/模块调节温度。可同样地冷却低温头/模块(例如〈(TC )，反之可加热高温头/模块直至达到期望的温度，例如直至50°C，100°C，150°C，200°C或甚至250°C或甚至更高。可以例如约I至约1000mm /分钟的驱动器速度移动喷嘴或针。X / y / z轴的分辨率可为约0.05mm,例如在约ΙΟμπι至约Imm之间。用于挤压熔化的聚合物或悬浮液或溶液的应用的压力可为约O至约5巴。
[0061]在发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的上下文中，可在任意合适的支持物上，已制备的包含如 上定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组上，至少一个如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的支持层上等等，或适用于此目的的任意表面或支持物上，例如钢板、纸、玻璃、载玻片或任意合适的容器、平皿、特氟龙表面，例如特氟龙箔、封口膜、铝板、铝箔、塑料箔等上实现用熔化的聚合物，用如上定义的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或用任选地还包含如上定义的可掺入的材料的可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物形成至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。在此上下文中，支持物或表面可为模型或模具，其类似于待重构的组织片段等的三维结构。优选地在特氟龙箔上进行熔化的聚合物的3D绘图，因为绘制的聚合物/支持层可容易地从此表面释放。
[0062]可适当地进一步调节生物相容的并且优选可生物降解的支持层的形状和厚度，优选地如本文对于至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组已描述的。特别地，任意这些参数，例如纤维之间的距离(如果产生纤维的话)、孔大小、厚度等等可应用于支持层或层组，如上文对于至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组已经讨论的。
[0063]根据另外的特别优选的方面，可使用如上定义的生物相容的可掺入的材料形成至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。为此目的，优选地在溶剂中溶解或悬浮生物相容的可掺入的材料并在表面上提供所述材料以形成预定的三维结构。根据实例，可通过在热的蒸懼水(aqua dest)中溶解聚乙烯醇(PVA) (10% (重量)，Mowiol28_99,Clariant GmbH, Frankfurt a.Μ., Deutschland)形成羟基憐灰石陶瓷支持层。然后，这样得到的溶液/悬浮液(例如2份)可与羟基磷灰石(例如1份，例如Typ SF超细粉C13-09，Chemische Fabrik Budenheim, Mainz, Germany)混合。然后优选地使混合物过筛以去除凝块或结块(100 μ m, Retsch, Haan, Germany)。然后优选地使用3D绘图机(Envisiontec,Gladbeck, Germany)将混合物应用于如上定义的表面。处理温度可为约室温。支持结构可具有例如如本文定义的形式，例如网或网眼样结构。可以例如冷冻形式储存支持结构，直至使用。优选地在制备了支持结构之后立即进行冷冻，例如最初在约_30°C，优选地降低温度至约-200°C并冷冻干燥支持结构(例如在Lyovac GT2, Amsco / Finn-Aqua, Hiirth,Germany中)。为了从支持结构中去除聚乙烯醇(PVA),优选地烧结或烘焙(例如约5h(约2至约IOh)，约350°C (约200°C至约600°C ))支持结构至少一次。在另外的步骤中，可再次烧结(例如约12h (约5至约20h)，约1100°C (约500°C至约2000°C ))支持结构，这优选地导致羟基磷灰石颗粒烧结为陶瓷支持层。 [0064]在使用发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的另外的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层或可生物降解并且生物相容的可熔化的聚合物或可掺入的材料之前，可储存、冷冻干燥、灭菌、等离子体灭菌至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。
[0065]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层可具有任意合适的形式。合适的形式包括但不限于，带、线、绒布、纤维、颗粒、滴状物或网或网眼样结构。合适的形式也可包含片、膜、箔或层压制件。优选地，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层为带、线、绒布、纤维、颗粒、滴状物、网或网眼样结构、片、膜、箔或层压制件的形式。这些结构中的任一种可具有或不具有洞或腔。
[0066]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层的制备可单独地进行并且独立于如上定义的至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组的制备。
[0067]根据非常具体的方面，可使用以下步骤制备如本文定义的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层:
[0068](i)提供熔化的如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，如本文定义的生物相容的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或任选地还包含如本文定义的生物相容的可掺入的材料的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物；和
[0069](ii)在如本文定义的表面上电处理或3D绘制熔化的如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，如本文定义的生物相容的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或任选地还包含如本文定义的生物相容的可掺入的材料的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物。
[0070]在发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中，至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和至少一个如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的支持层可排列在一起以形成发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统。这样的排列可包含如本文定义的任意种类和适合特定目的的任意数目的层或层组。
[0071]例如，可通过下述方法形成发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，所述方法提供至少一个层组(例如1，2，3，4，5个或甚至更多层组)作为第一元件，每个层组包含相同或不同的如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，并在此第一元件上应用如本文定义的至少一种生物相容的并且优选可生物降解的支持层或层组作为第二元件。
[0072]同样地，可通过下述方法形成发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统，所述方法通过提供至少一个包含相同或不同的如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组作为第一元件，通过在此第一元件上应用至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层或如本文定义的层组作为第二元件，并通过在第二元件上应用至少一个包含相同或不同的如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组作为第三元件。层的方向可为合适的，例如第一和三层组可彼此朝向相同的方向或反之亦然。同样地，第二层组可与第一或第三层组朝向相同的方向或反之亦然。
[0073]根据非常具体的方面，可使用以下步骤制备发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统:
[0074](i)任选地提供和制备用于电处理的聚合物溶液，优选地通过优选地在如本文定义的溶剂中，任选地在存在如 本文定义的交联剂下，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，通过优选地在如本文定义的溶剂中，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物和如本文定义的交联剂，或通过任选地在存在如本文定义的交联剂下，熔化如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物；
[0075](ii)任选地电处理聚合物溶液中的至少一个层组，从而形成三维层组，其中当进行电处理过程时，优选地通过改变，更优选地增加或降低如本文定义的层组的纤维强度，形成如本文定义的梯度；并且任选地模塑产生的层组。如果使用溶剂，优选地在步骤(ii)中在电处理聚合物溶液的步骤期间使溶剂挥发；
[0076](iii)提供熔化的如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，如本文定义的生物相容的可掺入的材料的悬浮液或溶液，和/或任选地还包含如本文定义的生物相容的可掺入的材料的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物；
[0077](iv)在如本文定义的表面上电处理或3D绘制熔化的如本文定义的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物，如本文定义的生物相容的可掺入材料的悬浮液或溶液，和/或任选地还包含如本文定义的生物相容的可掺入材料的生物相容的并且优选可生物降解的可熔化的聚合物的熔化物；
[0078](V)任选地提供和制备用于电处理的聚合物溶液，优选地通过优选地在如本文定义的溶剂中，任选地在存在如本文定义的交联剂下，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物，通过优选地在如本文定义的溶剂中，溶解如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物和如本文定义的交联剂，或通过任选地在存在如本文定义的交联剂下，熔化如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物；和
[0079](vi)任选地电处理聚合物溶液中的至少一个层组，从而形成三维层组，其中当进行电处理过程时，优选地通过改变，更优选地增加或降低如本文定义的层组的纤维强度，形成如本文定义的梯度；任选地模塑产生的层组。如果使用溶剂，优选地在步骤(ii)中在电处理聚合物溶液的步骤期间使溶剂挥发。
[0080]在制备了如上所述的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统之后，优选地洗涤梯度层系统至少I次、2次或甚至更多次(3，4，或5次或更多次)，优选地用水、缓冲液，例如用于培养本文描述的细胞的缓冲液，等等洗涤。
[0081]也可对如上所述的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统补充另外的包含如本文定义的生物相容的并且可生物降解的聚合物的层组和/或另外的至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层，其中所述至少一个层或层组已用如上定义的多酚化合物修饰。
[0082]可实现发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的任意其他形式。准确地说，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可含有任意数目和任意方向的任意不同层和/或层组，特别是任意至少一个包含生物相容的并且优选可生物降解的交联的聚合物的层组和/或任意至少一个生物相容的并且优选可生物降解的支持层。因此，应当注意，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统不受限于层或层组的任意具体排列。
[0083]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可还包含细胞。这样的细胞优选地包含但不限于，选自定向干细胞、分化的细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞、改造的或非 改造的干细胞、原代或永生化(细胞系)干细胞的(哺乳动物、人或非人)干细胞，优选间充质干细胞。在多个方面中使用的细胞的其他实例包括但不限于，软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、血管和角膜组织的内皮细胞、皮肤细胞、骨细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、所有结缔组织的成纤维细胞、齿龈和/或皮肤和角膜成纤维细胞(单独地或与牙周韧带成纤维细胞一起)、角化细胞，例如齿龈角化细胞和来自口腔和上呼吸消化道以及皮肤和眼表的角化细胞，成胶质细胞、生殖细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、结缔组织细胞、胶质细胞、激素分泌细胞、免疫系统细胞和神经元，以及例如中枢神经系统细胞、神经细胞、周细胞、肌细胞、脂肪细胞、星形胶质细胞、黑素细胞等等。在一些方面不需要预选择待使用的干细胞的类型，因为一旦被递送至给定器官后，可以器官特异性模式诱导许多类型的干细胞分化。例如，仅仅通过将干细胞置于肝内，递送至肝的干细胞就可被诱导成干细胞。基质中的细胞可起到提供脚手架或接种，产生特定的化合物或上述二者的目的。在上述意义中的细胞也可包含用于某些治疗用途的活组织细胞。优选但不是必要地，组织细胞来源于与将在治疗中使用发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统的相同类型的组织。活组织细胞可来源于自体组织来源、同种异体组织来源或异种组织来源。术语“自体”旨在指来源于相同的宿主的组织。术语“同种异体”旨在指来源于相同物种(即，人)但不同基因组成的来源的组织。术语“异种”旨在指组织来源于与宿主不同的物种。可与发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统组合使用的细胞类型的非限制性实例包括干细胞、骨细胞、肌腱细胞(tenocyte)、月旨肪细胞、心肌细胞、肝细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等等。在进行交联前、期间或后，可将组织细胞加至发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统。本文使用的细胞也可包含前面定义的细胞的混合物。
[0084]优选地用如本文定义的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统培养如上定义的细胞，例如在适于特定细胞类型的培养基中培养。也可将细胞置于构建体的腔或空间中，或植于发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统附近以协助生长。可选地，可将发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统置于生物反应器中。存在若干类型的可商购的生物反应器，即设计用于提供低剪切力、高营养物灌注环境的设备。直到最近，大多数可用的生物反应器悬浮培养细胞并通过鼓泡，通过使用叶轮，或其他搅拌工具递送营养物和氧气。
[0085]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统也可包含可体外培养的细胞，所述细胞来源于天然来源，经基因改造，或通过任意其他方式产生。可使用原核细胞或真核细胞的任意天然来源，例如如上定义的细胞。在将发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统植入生物的方面，可使用来自接受者的细胞，来自同种供体或来自不同物种的供体的细胞，或细菌或微生物细胞。包括在使用前从来源收获和培养的细胞。
[0086]根据一个特别的方面，在发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中含有的细胞可含有已经过基因改造的细胞。改造包括为细胞提供程序表达一个或多个基因，抑制一个或多个基因的表达，或上述二者。可用于本发明的基因改造的细胞的一个实例是产生并分泌一种或多种期望的分子的基因改造的细胞。当发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统包含基因改造的细胞并被植入或移植到生物中时，产生的分子可产生局部作用或全身作用，并且可包括上文鉴定为可能的物质的分子。在目的之一是使生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统产生免疫反应的方面中，细胞也可产生抗原性材料。细胞可产生辅助下述目的非包含性列表的物质:抑制或刺激炎症；促进愈合；抵抗免疫排斥；提供激素替代；替代神经递质；抑制或破坏癌细胞；促进细胞生长；抑制或刺激血管形成；增加组织；和补充或替代神经元、皮肤、一般上皮细胞、滑液、肌腱、软骨、韧带、骨、肌肉、器官、硬脑膜、血管、 骨髓和细胞外基质。基因改造可包括，例如对细胞增加或从细胞去除遗传物质，改变已有的遗传物质，或上述二者。在转染或改造细胞以表达基因的方面，可使用瞬时或永久转染的基因，或二者。基因序列可为全长或部分长度，克隆或天然存在的。
[0087]应当理解，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可组合或补充其他材料和/或物质。例如，当皮下植入时，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可组合或补充佐剂以增强免疫原性。同样地，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可组合或补充药剂。作为另一个例子，含有细胞的发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可组合或补充例如白介素和/或生长因子以刺激在梯度层系统中的细胞生长和分裂。
[0088]根据一个方面，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可包含药剂。本文中合适的药剂可为有机或无机的，并且可处于固相、半固相、液相或气相。分子可以与其他分子的组合或混合物存在，并且可为溶液、悬浮液或任意其他形式。可使用的分子类别的实例包括人或兽医治疗剂、化妆品、营养食品、农业用品例如除草剂、杀虫剂和化肥、维生素、盐、电解质、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂、核酸、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子、激素、神经递质、信息素、抑素、前列腺素、免疫球蛋白、单核因子和其他细胞因子、保湿剂、金属、气体、矿物质、塑化剂、离子、电和磁性反应材料、光敏感材料、抗氧化剂、酚类化合物、单酚或多酚化合物，优选地如上定义的单酚或多酚化合物，例如姜黄素，白藜芦醇，其相关衍生物，没食子酸，绿原酸，咖啡酸，鼠尾草酚，辣椒素，6-姜烯酮，6-姜酮醇，及其相应的衍生物，类黄酮，黄烷醇，新类黄酮，酚酸，等等，例如熊果苷，洋蓟酸，芳:黄素，isocuttelarein,木樨草素,川陈皮素,桔皮素,杨芽黄素,高良姜精，山柰酚，杨梅酮，槲皮素，芦丁，柠檬素，curcurocitrin,圣草酚，橙皮苷，柚皮素，柚皮苷，松属素，槲皮苷，鹰嘴豆素A，白杨素，大豆苷元，雌马酚，芒柄花黄素，染料木素，黄豆素，依普黄酮，lactuin, Iactuin，碧萝芷，水飞蓟素，木质素，等等，或类姜黄素化合物，例如姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素等等，儿茶酚胺(catecholamin)或儿茶酚胺(catecholamine),例如儿茶酹、肾上腺素、去甲肾上腺素(noradrenaline)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、多巴胺和携带儿茶酹或1,2- 二羟基苯部分的任意其他化合物,可作为细胞能量来源被代谢的任意分子，抗原和可引起细胞或生理反应的任意分子。可使用分子的任意组合，以及这些分子的激动剂或拮抗剂。
[0089]药剂可还包括任意治疗分子或物质，包括但不限于任意制药物质或药物。药物的例子包括但不限于，麻醉剂、催眠药、镇静剂和睡眠诱导物、抗精神病药、抗抑郁药、抗过敏药、抗心绞痛药、抗关节炎药、止喘药、，抗糖尿病药、止泻药、抗痉挛药、抗痛风药、抗组胺药、止痒剂、催吐剂、抗呕剂、止痉挛药、厌食剂、神经活性物质、神经递质激动剂、拮抗剂、受体阻断剂和再摄取调节物、肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、双硫仑和双硫仑样药物、肌肉松弛药、镇痛药、退热剂、兴奋剂、抗胆碱酯酶剂、拟副交感神经药、激素、抗凝剂、抗血栓剂、溶栓剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、激素激动剂/拮抗剂、维生素、抗菌剂、抗肿瘤药、抗酸药、消化剂、轻泻剂、泻药、防腐剂、利尿剂、消毒剂、杀真菌剂、杀外寄生物药、杀寄生虫药、重金属、重金属拮抗齐?、螯合齐?、气体和蒸汽、生物碱、盐、离子、内分泌物、毛地黄、强心苷、抗心律不齐药、抗高血压药、血管扩张剂、血管收缩剂、抗毒蕈碱剂、神经节刺激剂、神经节阻断剂、神经肌肉阻断齐?、 肾上腺素神经抑制齐?、抗氧化齐?、维生素、化妆品、抗炎药、伤口护理产品、抗血栓形成剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、麻醉剂、抗原剂、伤口愈合剂、植物提取物、生长因子、润肤剂、保湿剂、排斥/抗排斥药、杀精剂、调节剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗生素、镇定剂、降胆固醇药、止咳药、组胺阻断药、单胺氧化酶抑制剂。本发明的物质也包括美国药典列出的所有物质。
[0090]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统还可包含治疗物质，其选自但不限于抗肿瘤药、抗有丝分裂药、抗炎药、抗血小板药、抗凝剂、抗纤维蛋白、抗凝血酶、抗增殖药、抗生素、抗氧化剂和抗过敏药物以及其组合。这样的抗肿瘤药和/或抗有丝分裂药的例子包括紫杉醇(例如，Bristol-Myers Squibb C0., Stamford, Conn.的TAXOL?)、
多西他赛(docetaxel)(例如，Aventis S.A., Frankfurt, Germany 的Taxotere?)、甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、长春新碱、长春花碱、氟尿喃唳、盐酸阿霉素(例如，Pharmacia&Upjohn,Peapack N.J.的 Adriamycin?)和丝裂霉素(例如，Bristol-Myers Squibb C0.,
Stamford， Conn.的Mutamycin?"')。这样的抗血小板药、抗凝剂、抗纤维蛋白和抗凝血酶
的例子包括肝素钠、低分子量肝素、肝素类似物、水蛭素、阿加曲班、毛喉素、伐哌前列素、环前列腺素和环前列腺素类似物、葡聚糖、D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯代甲基酮(合成的抗凝血酶)、双嘧达莫、糖蛋白IIb / IIIa血小板膜受体拮抗剂抗体、重组水蛭素，和凝血酶抑制剂例如Angiomax?(Biogen, Inc., Cambridge, Mass.)。这样的细胞抑制剂或抗增殖剂的例子包括血管抑肽、血管紧张素转化酶抑制剂例如卡托普利(captopril)(例如，Bristol-Myers Squibb C0.， Stamford， Conn.的 Capoten? 和 Capozide?)，西拉普利(cilazapril)或赖诺普利(Iisinopril)(例如，Merck&C0.，Inc.，Whitehouse Station，N.J.的prinivU?和Prinzide?),钙通道阻断剂(例如硝苯地平)，秋水仙碱，成纤维细胞生长因子(FGF)拮抗剂，鱼油(ω3-脂肪酸)，组胺拮抗剂，洛伐他汀(1vastatin)(HMG-CoA还原酶抑制剂，降胆固醇药，商标名称Mevacor?，来自Merck&C0., Inc.,Whitehouse Station, N.J.),单克隆抗体(例如对于血小板源生长因子(F1DGF)受体的特异性的单克隆抗体)，硝普盐(nitroprusside),磷酸二酯酶抑制剂,前列腺素抑制剂,苏拉明(suramin),血清素(serotonin)阻断剂,类固醇,硫蛋白酶抑制剂,三唑并嘧唳G3DGF拮抗剂 )和一氧化氮。抗过敏药的例子是批喃司特(permirolast)钾。可使用的其他治疗物质或活性剂包括α -干扰素，经基因改造的上皮细胞和地塞米松(dexamethasone)。在其他例子中，治疗物质是在放射治疗程序中用于可包含设备用途的放射性同位素。放射性同位素的例子包括但不限于，磷酸(H3P32O4)，钯(PcT)，铯(CS131)和碘(I125)。
[0091]此外，发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可用其他组分或物质培养或可补充其他组分或物质。这样的组分或物质可包括例如，任意分子，例如有机或无机的，处于固相、半固相、液相或气相。分子可以与其他分子的组合或混合物存在，并且可处于溶液、悬浮液或任意其他形式。可使用的分子类别的实例包括人或兽医治疗剂、营养食品、维生素、盐、电解质、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂、核酸、糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子、激素、神经递质、信息素、抑素、前列腺素、免疫球蛋白、单核因子和其他细胞因子、保湿齐?、金属、气体、矿物质、塑化齐?、离子、电和磁性反应材料、光敏感材料、抗氧化剂、可作为细胞能量来源被代谢的分子、抗原和可引起细胞或生理反应的任意分子。可使用分子的任意 组合，以及这些分子的激动剂或拮抗剂。
[0092]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中可含有的其他优选的组分涉及生长因子。可用于本发明的生长因子包括但不限于，转化生长因子("TGF-")，转化生长因子β (" TGF-β ")，血小板源生长因子，包括AA，AB和BB同种型("PDGF;/ )，成纤维细胞生长因子("FGF")，包括FGF酸性同种型I和2，FGF碱性形式2和FGF4，8，9和10，神经生长因子("NGF")，包括NGF2.5s，NGF7.0s和β NGF和神经营养因子，脑源神经营养因子，软骨源因子，骨生长因子(BGF)，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子(IGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，集落刺激因子例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，胰岛素样生长因子(IGF)I和II，肝细胞生长因子，胶质细胞神经营养生长因子(GDNF)，干细胞因子(SCF)，角化细胞生长因子(KGF)，转化生长因子(TGF)，包括TGFa，β，β 1，β2和β 3，骨骼生长因子，骨基质源生长因子和骨源生长因子及其混合物。一些优选的生长因子包括VEGF(血管内皮生长因子)，NGF(神经生长因子)，PDGF-AA，PDGF-BB, PDGF-AB，FGFb，FGFa 和 BGF。
[0093]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中同样可含有的细胞因子包括但不限于，心肌营养蛋白，基质细胞源因子，巨噬细胞源趋化因子(MDC)，黑色素瘤生长刺激活性(MGSA)，巨噬细胞炎性蛋白 Ια (ΜΙΡ_1α)，2，3α，3β，4 和 5，IL_1，IL_2，IL-3，IL-4, IL-5, IL-6, IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13， IL-15， IL-16， IL-17 和IL-18，TNF-a和TNF-β。可用于本发明的免疫球蛋白包括但不限于，IgG, IgA, IgM, IgD,IgE，及其混合物。发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统中可含有的其他分子包括但不限于，瘦素，白血病抑制因子(LIF)，GLP-1，内皮抑素，血管抑素，血小板反应蛋白，成骨蛋白-1，骨形态发生蛋白2和7，骨粘连蛋白，生长调节素样肽，骨钙素，干扰素a，干扰素aA，干扰素β，干扰素λ，干扰素la。 [0094]发明的生物相容的并且优选可生物降解的梯度层系统可还包含RGD肽或序列，优选重复的RGD结合肽，更优选地具有式(RGD)n，用于结合或粘附细胞。一般地，多功能融合蛋白的这样的重复的RGD结合肽可为含有至少一个RGD肽序列，优选至少2个RGD肽序列，或甚至3、4、5个或更多RGD肽序列的肽，即η可为1，2，3，4，5或甚至更大，优选地，η是I至5，1至4，1至3，2至5，2至4，2或3或3至5，3至4或4至5。在此上下文中，R⑶肽序列一般是含有3个(连续的)氨基酸RGD的序列，RGD是“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”的单字母氨基酸编码缩写，优选地处于指示的顺序。这样的RGD序列一般表示整合素对细胞外基质蛋白的识别序列的一部分。在此上下文中，整合素已知作为介导细胞和其周围组织，(例如其他细胞或细胞外基质(ECM))之间的附着的受体。整合素也在细胞信号传递中起作用，并从而定义细胞形状、移动性并调节细胞周期。可用于本发明的目的以允许细胞通过整合素结合多价融合蛋白的RGD序列一般来源于ECM蛋白或包含RGD肽序列的肽，或合成序列，在每种情况下包含氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(在单字母氨基酸编码中为"RGD")。可掺入发明的多功能融合蛋白中的这样的细胞特异性粘附序列是例如Hersel 等人(2003)综述和列出的(见 Hersel 等人,Biomaterials24(2003),4385-4415)。在Hersel等人(2003，同上)中的各自公开内容涉及这样的特定R⑶肽序列，并且优选地将如其中公开的特定RGD序列以其整体引入本文作为参考。甚至更优选地，这样的RGD序列可选自但不限于下述氨基酸序列中的至少一种:RGD(SEQ ID NO:1)，RGDS (SEQ ID NO:2)，(RGDS)n(SEQ ID NO:3)，其中 η 优选地是 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 或甚至更大，GRGD (SEQID NO: 4), RGDV (SEQ ID NO: 5), RGDT (SEQ ID NO:6),GRGDG(SEQ ID NO: 7),GRGDS(SEQ IDNO:8)，GRGDY(SEQ ID NO:9)，GRGDF(SEQ ID NO:10)，YRGDS(SEQ ID NO:11), YRGDG(SEQID NO: 12)，YGRGD(SEQ ID NO: 13)，GRGDSP(SEQ ID NO: 146)，GRGDSG(SEQ ID NO: 15)，GRGDSP(SEQ ID NO: 16),GRGDSY(SEQ ID NO: 17),GRGDVY(SEQ ID NO:18)，GRGDSPK(SEQ IDNO:19)，CGRGDSPK(SEQ ID NO:20)，CGRGDSY(SEQ ID NO:21)，YAVTGRGDS(SEQ ID NO:22)(R⑶模拟物酪氨酸脚手架)，AcCGGNGEPRGD(SEQ ID NO:23), YRAY-NH2 (SEQ ID NO:24)，AcGCGYGR⑶SPG(SEQ ID NO:25)，RGDSPASSKP(SEQ ID NO:26),AcGRGDSPASSKG(SEQ ID NO:27)，
[0095]或可选自环状RGD序列，例如
[0096]AXEPRGDNYRC(SEQ ID NO:28)，其中X代表修饰的氨基酸Dap (2，3_ 二氨基丙酸)，β A代表b-丙氨酸，此环状RGD序列具有以下结构:
[0097]
【权利要求】
1.生物相容的梯度层系统，所述梯度层系统包含至少一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组和至少一个生物相容的支持层，其中通过改变在发明的梯度层系统的至少一个层或层组内或在若干层或层组之间的机械和/或物理性能形成梯度。
2.根据权利要求1的梯度层系统，其中机械和/或物理性能包含例如机械强度、孔大小、纤维强度和纤维长度。
3.根据权利要求1或2的梯度层系统，其中在梯度层系统的至少一个层或层组内或在梯度层系统的若干层或层组之间纤维强度改变、增加或降低从约0.0OOl μ m-至约2 μ m每y m层或层组闻度。
4.根据权利要求1至3中任一项的梯度层系统，其中至少一个包含生物相容的交联的聚合物的层组的聚合物纤维的纤维强度表现出在约Inm至约500 μ m之间的强度。
5.根据权利要求1至4中任一项的梯度层系统，其中生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物选自胶原、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白，和纤连蛋白、多糖、聚糖或多聚糖，或其组合。
6.根据权利要求1至5中任一项的梯度层系统，其中至少一个生物相容的支持层包含选自聚酯类别、聚己内酯(PCL)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚酸酐、聚癸二酸、多肽、明胶、藻酸盐、胶原、纤维蛋白，或混合物或聚氨酯的可生物降解并且生物相容的可熔化的聚合物，和/或选自可掺入的陶瓷材料、由磷酸三钙(TCP)制成的可掺入的陶瓷材料或由羟基磷灰石(HA)制成的可掺入的陶瓷材料的可掺入的材料。
7.根据权利要求1至6中任一项的梯度层系统，其中使用交联剂交联生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物和/或生物相容的可熔化的聚合物，所述交联剂选自酸酐、氨基酸、氮丙啶、儿茶酚胺、印oxydes、醛、甲醛、二醛、戊二醛、乙二醛、乙二醛三聚体二水合物、戊二醛、异己酮、二甲基辛二亚氨酸酯和二甲基3，3' -二硫代双丙亚氨酸戊二醛(dimethyl3, 31 -dithiobispropionimidadteglutaraldehyde)、环氧化物、双环氧乙烧、氧化的葡聚糖、对叠氮苯甲酰肼、Ν-[ ([ α ]-马来酰亚胺乙酸基]琥拍酰亚胺酯、对叠氮苯基乙二醛单水合物、双(β-[4-叠氮水杨酰氨基]乙基)二硫化物、双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、1-乙基-3- [3- 二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、二酰基氯化物、单酚化合物和多酚化合物。
8.根据权利要求1至7中任一项的梯度层系统，其中至少一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组以绒布、网或网眼样结构的形式存在。
9.根据权利要求1至8中任一项的梯度层系统，其中至少一个生物相容的支持层以带、线、纤维、颗粒、滴状物、网或网眼样结构、片、膜、箔或层压制件的形式存在。
10.根据权利要求1至9中任一项的梯度层系统，其中梯度层系统接种了细胞。
11.根据权利要求10的梯度层系统，其中细胞选自从定向干细胞、分化的细胞、成体干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞、改造的或非改造的干细胞、原代或永生化(细胞系)干细胞、间充质干细胞选择的(哺乳动物、人或非人)干细胞，软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、血管和角膜组织的内皮细胞、皮肤细胞、骨细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、所有结缔组织的成纤维细胞、齿龈和/或皮肤和角膜成纤维细胞，单独地或与牙周韧带成纤维细胞一起、角化细胞、齿龈角化细胞、成胶质细胞、生殖细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、结缔组织细胞、胶质细胞、激素分泌细胞、免疫系统细胞、神经元、中枢神经系统细胞、神经元细胞、周细胞、肌细胞、脂肪细胞、星形胶质细胞、黑素细胞、组织细胞、来自自体组织来源、同种异体组织来源或异种组织来源的组织细胞、自体细胞、同种异体细胞、异种细胞、组织细胞、骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、平滑肌细胞、内皮细胞或如上面定义的细胞的混合物。
12.根据权利要求1至11中任一项的梯度层系统，其中梯度层系统还包含细胞因子、白介素、生长因子、免疫球蛋白、RGD肽、抗菌剂和其他药剂。
13.根据权利要求1至12中任一项的梯度层系统，其中还使用酚类化合物交联至少一个包含生物相容的并且可生物降解的交联的聚合物的层组。
14.根据权利要求1至13中任一项定义的梯度层系统，所述梯度层系统用于治疗烧伤，治疗由于手术损伤、软或硬组织的损伤的伤口，治疗由于肿瘤疾病的伤口，治疗大的慢性伤口，由疾病，例如癌症、11型糖尿病引起的伤口，治疗溃疡的伤口，治疗口腔中的伤口，治疗眼科学领域、牙周缺损包括牙周韧带领域的伤口或损伤，用于再生或重建损伤的或患病的或去除的组织，用于再生或重建由帕金森氏病或脊髓损伤或肿瘤病理或阿尔茨海默病导致的损伤的或患病的或去除的组织，治疗心血管病，治疗创伤疾病或损伤，治疗整形外科领域的疾病或病症，治疗、再生或重构软骨、软骨疾病或软骨病症、软骨病，构建膝盖中的软骨，和治疗关节病。
15.包含根据权利要求1至13中任一项的梯度层系统的生物材料，其中所述生物材料选自用于再生医药、用于伤口敷料或用于组织支持物或用于制备所述再生医药、伤口敷料或组织支持物的生物材料、生物改造的组织或器官构建体、或部分器官构建体、生物改造的心、生物改造的心脏瓣膜、生物改造的肝、生物改造的肾、生物改造的血管、生物改造的骨骼肌、生物改造的心肌、生物改造的神经导引、烧伤敷料、伤口敷料、外科敷料、皮肤贴片、筋膜鞘、血管构建体、血管移植物、血管、用于旁路或移植的冠状血管、股动脉、胭动脉、肱动脉、胫动脉、桡动脉或相应的静脉、支架、支架的内衬或外衬、心血管瓣膜、皮肤贴片、用于消化的锭剂、腹膜内植入物、皮下植入物、腱、角膜、韧带、假牙、肌肉植入物或神经导引、改造的组织或器官、修复学、组织脚手架、止血设备、用于组织修复和支持粘合剂的设备或结构、用于合成的植入物的天然涂料或组分；美容植入物或支持物、用于物质递送的生物材料、生物改造的平台、或用于检测物质对细胞的作用的平台。
16.根据权利要求1至13中任一项定义的梯度层系统用于制备如权利要求15中定义的生物材料的用途。
【文档编号】A61L27/34GK103648536SQ201280027492
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月4日 优先权日:2011年4月5日
【发明者】T·施泰因贝格, P·托马基迪, S·舒尔茨, M·安加拉诺, R·米尔豪特, M·法布里蒂乌斯 申请人:弗赖堡大学医院, 阿尔伯特路德维希的弗赖堡大学