Mfg-e8及其用途

Mfg-e8及其用途
【专利摘要】本发明公开了使用乳脂球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)治疗脑缺血症的方法，同样地公开了重组人MFG-E8及其在用于治疗缺血/再灌注后炎症和器官损伤、以及脓毒症和肺损伤的药物组合物、产品和方法中的用途。
【专利说明】MFG-E8及其用途
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求保护2011年4月28日提交的美国临时专利申请N0.61/480，031的利益，将其内容通过引用整体并入本文。
[0003]政府资助声明
[0004]本发明是在国立卫生研究院授予的基金号GM057468由政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。
[0005]发明背景
[0006]在整个本申请中，在括号中提及各种出版物。这些参考资料的完全引用可见于说明书的结尾。将这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中以更全面地描述本发明所属的领域。
[0007]炎症和细胞凋亡在缺血损伤后脑梗塞的演化中起着至关重要的作用。在脑梗塞核心的坏死细胞死亡后，相对低灌注的半阴影中的细胞死亡通过炎症和细胞凋亡机制随时间发生。炎症过程牵涉NF-K B介导的可引起细胞损伤的细胞因子(例如TNF-α )的释放(Dirnagl等人1999)。细胞凋亡包括促细胞凋亡分子例如bax的释放和半胱天冬氨酸蛋白酶的激活，从而导致DNA片段化和细胞死亡。被缺血激活的细胞损伤机制被细胞存活机制(包括抗细胞凋亡分子例如bcl-2的上调)抵消(Antonsson2004)。过氧化物酶体增生物激活受体-Y (PPAR-Y)是已显示通过下调细胞因子释放而对抗炎症的配体诱导性转录因子(Ricote和Glass2007)。炎症和细胞凋亡的治疗性抑制可在缺血性卒中后拯救半阴影。
[0008]脓毒症是最盛行的疾病之一，占据重症监护室(I⑶)接收者的20% (Angus，等人，2001)。证据表明仅在美国，每年就有超过750，000人发生脓毒症，总体死亡率为28.6%(Angus，等人，2001)。尽管已在脓毒症患者的治疗中取得进展，但大量此类患者死于紧接着发生的脓毒症休克和多器官衰竭(Ferrer,等人，2008; Strehlow,等人，2006;Martin,等人，2003;Guidet,等人，2005)。医院记录分析表明已死于脓毒症的患者的总数实际上在不断增加(Martin,等人，2003)。随着美国人口老龄化，脓毒症的发病率预计将增加，因为脓毒症的发病率和死亡率随年龄增长而稳定上升(Angus，等人，2001;Martin,等人，2003)。因此，存在对脓毒症患者的有效新型疗法的紧迫而未满足的医学需要。
[0009]乳脂球表皮生长因子VIII(MFG_E8)，也称为乳粘素(lactadherin)，是最初在小鼠乳和乳腺上皮中发现的66-kDa糖蛋白(Stubbs等人1990)。其为抑制肠病原体结合和感染性的重要乳黏液蛋白相关防御组分(Yolken，等人，1992)。随后发现MFG-E8广泛地分布 在小鼠和其它哺乳动物物种包括人的不同组织中(Aziz等人2009;Hanayama等人2004; Larocca等人1991)。在脑中，MFG-E8在星形细胞(Boddaert等人2007)和小神经胶质细胞中表达(Fuller和Van Eldik2008)。MFG-E8包含两个N-末端表皮生长因子(EGF)样重复，和两个C末端盘菌素(discoidin)/F5/8C结构域。MFG-E8通过第二个EGF结构域中包含的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序结合ανβ3/5整联蛋白异二聚体(Andersen等人1997)。[0010]最近的研究已显示MFG-E8还可由活化的巨噬细胞和未成熟树突细胞分泌，并且已与凋亡细胞的调理作用关联(Hanayama,等人，2002;Hanayama,等人，2004;Miyasaka,等人，2004; Thery,等人，1999; Oshima,等人，2002)。MFG-E8 的第二个 F5/8C 结构域对阴离子膜磷脂例如磷脂酰丝氨酸具有高亲和力，所述磷脂在细胞凋亡过程中变得外露(Andersen等人1997; Shao等人2008)。已显示MFG-E8通过在凋亡细胞上暴露的磷脂酰丝氨酸与吞噬细胞上的α νβ 3/5整联蛋白受体之间充当桥接分子来促进凋亡细胞的吞噬去除。凋亡细胞的这种增强的清除阻止了会释放导致组织损伤的促炎介质的继发性坏死(Hanayama等人2002)。MFG-E8还在组织损伤中产生其它有益效应，例如在肠缺血(Cui等人2010)和阿尔茨海默病(Fuller和Van Eldik2008)中抑制炎症和细胞凋亡。
[0011]先前的研究已显示含大鼠MFG-E8的外来体(exosome)或重组鼠MFG-E8 (rmMFG-E8)的施用会增加凋亡细胞的吞噬作用，减少促炎细胞因子，和在由盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的脓毒症的大鼠模型中改善存活(Miksa，等人，2008;Miksa，等人，2009c)。然而，一个阻碍将MFG-E8开发为患者的治疗剂的障碍是动物蛋白质在人中的潜在免疫原性。
[0012]本发明特别地使用重组人MFG-E8 (rhMFG_E8)来解决对治疗脑缺血症和脓毒症以及其它疾病和障碍的需求。
[0013]发明概述
[0014]本发明提供了预防和/或治疗受试者的脑缺血症的方法，包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量给受试者施用乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)。
[0015]本发明还提供制备用于预防和/或治疗脑缺血症的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量在药物组合物中配制乳脂球表皮生长因子-因子 VIII(MFG-E8)。
[0016]本发明还提供了包含以用于预防和/或治疗脑缺血症的剂型存在的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0017]本发明还提供了药品，其中包含在药学上可接受的载体中配制的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8);和提供关于施用MFG-E8以预防和/或治疗脑缺血症的说明的包装说明书。
[0018]本发明还提供了具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的重组人MFG-E8 (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8是非糖基化的。
[0019]本发明还提供了预防和/或治疗受试者的缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的方法，包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量给受试者施用重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0020]本发明还提供了治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效地减弱脓毒症的生理作用的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0021] 本发明还提供了治疗受试者的肺损伤的方法，包括给受试者施用有效地治疗肺损伤的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0022]还提供了制备用于预防和/或治疗受试者的缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0023]还提供了制备用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地减少脓毒症的生理作用的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0024]还提供了制备用于治疗受试者的肺损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地治疗肺损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述 rhMFG-E8 具有与人 MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0025]还提供了包含以用于预防和/或治疗缺血/灌注后炎症和/或器官损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。 [0026]还提供了包含以用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-ESWy^iihMFG-ES) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
[0027]还提供了包含以用于治疗肺损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0028]还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)的药物组合物；和提供关于施用rhMFG_E8以治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的说明的包装说明书，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0029]还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的受试者的说明的包装说明书，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0030]还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以治疗患肺损伤的说明的包装说明书的药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0031]附图概述
[0032]图1.表达和纯化的rhMFG-E8的SDS-PAGE分析。泳道I，纯化的rhMFG_E8 (lug);泳道2，纯化的rhMFG-E8 (0.5 μ g);泳道3，分子量标准(marker);泳道4，未纯化的细菌裂解物。
[0033]图2.表达和纯化的rhMFG_E8的Western印迹分析。所述特定抗人抗体通过western印迹分析识别MFG-E8。泳道I,纯化的rhMFG_E8 (lug);泳道2,分子量标记。
[0034]图3.rhMFG-E8增强对凋亡细胞的吞噬作用。pHrodo_SE-标记的凋亡胸腺细胞的荧光强度在被巨噬细胞吞食后增加。用FITC抗-⑶llb/c标记脾巨噬细胞，用pHrodo-SE标记胸腺细胞。将细胞共温育60分钟，收集细胞，在进行荧光显微镜术之前用1%PFA固定细胞。⑶llb/c+pHrodo+细胞的吞噬指数示于图中。数据表示为平均值土SE(n=6-9/组)并且通过单因素方差分析(one-way AN0VA)和Student-Newman-Keuls法进行比较:*Ρ〈0.05,相对单独的培养基。
[0035]图4a_4b.rhMFG_E8在 CLP后减少胸腺细胞凋亡。大鼠经历CLP以诱导实验性脓毒症，在CLP后立即人用白蛋白(载体)、rmMFG-E8 (20 μ g/kg BW)或rhMFG_E8 (20 μ g/kgBff)进行治疗。(A)在CLP后20h通过膜联蛋白V/PI染色和FACS分析评价胸腺细胞凋亡。数据表示为平均值土SE(n=4/组)，并且通过单因素方差分析和Student-Newman-Keuls法进行比较:*P〈0.05，相对Sham组；#P〈0.05，相对载体组。(B)在CLP后20h通过Western印迹法测定胸腺中切割的胱天蛋白酶-3的改变。提供了 2个独立的观察的代表性凝胶。
[0036]图5a_5b.rhMFG_E8减弱CLP后的器官损伤。大鼠经历CLP以诱导实验性脓毒症并且在CLP后立即用人白蛋白(载体)、rmMFG-E8 (20 μ g/kg Bff)或rhMFG_E8 (20 μ g/kg BW)进行处理。在CLP后20h测量乳酸(A)和IL_6(B)的血清水平。数据表示为平均值土SE(n=4-6/组)并且通过单因素方差分析和Student-Newman-Keuls法进行比较:*Ρ〈0.05，相对于Sham组；#Ρ〈0.05，相对于载体组。
[0037]图6.利用rmMFG-E8或rhMFG_E8的治疗改善了盲肠结扎与穿孔后第10天的存活率。在CLP后，给小鼠提供人白蛋白治疗(Vehicle)或rmMFG-E8(20y g/kg BW)或rhMFG-E8 (20 μ g/kg BW)治疗。每一个组中有20只动物。通过Kaplan-Meier法评价存活率，通过使用log-rank检验比较存活率。*P〈0.05，相对于载体组。
[0038]图7.由中脑动脉闭塞(MCAO)造成的局灶性脑缺血症后脑MFG-E8水平的改变。在MCAO后24h测量脑MFG-E8水平。数据表示为平均值土 SE，通过Student’ s t_检验分析所述数据。与Sham相比较，脑缺血症(MCAO)降低MFG-E8水平(n=4_5，*p〈0.05，相对于Sham)。
[0039]图8.rhMFG-E8治疗减少局灶性脑缺血症后神经学缺损。通过评价脑缺血症后24h感觉运动和反射行为缺陷来测定组合神经学缺损评分(组合神经评分)。数据表示为平均值土SE,并且通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法来进行分析。相较于Sham,脑缺血症在经载体和经rhMFG-E8处理的动物中引起显著的神经学缺损。相较于载体组，rhMFG-E8处理显著减少神经学缺损(n=6, *p〈0.05,相对于Sham, #p<0.05,相对于载体)。
[0040]图9a_9c.相比于脑缺血症后经载体和rhMFG_E8处理而言经sham-操作的大鼠
(Sham)的梗塞面积和脑组织病理学的改变。(a)用氯化三苯四唑翁| (TTC)对新鲜脑组织的2mm厚冠状切片进行染色，随后利用NIHImageJ软件进行数字分析。TTC染色的代表性图像示于条块的顶部。数据表示为平均值土SE，通过Student’ s t检验进行分析。利用rhMFG-E8的处理相较于利用载体的处理减小了梗塞面积(n=6, *p〈0.05,相对于载体)。(b)苏木精伊红(H&E)染色的切片的显微照片通过扫描切片(A、C、E)和通过在400x初始放大倍数(B、D、F)下的亮视野显微镜术来获得。Sham(A、B)仅显示正常的活的嗜碱性神经元(通过箭头显示的)。载体组(C、D)主要显示坏死的嗜伊红神经元(通过长箭头显示的)。rhMFG-E8处理(E、F)保护免受神经元坏死损伤，从而导致活的嗜碱性神经元和坏死的嗜伊红神经元的混合物。比例尺条棒(Scale bar) =50 μ m0 (c)每个H&E染色的载片测定6个随机视野中的完整神经元(嗜碱性神经元)的平均数目。数据表示为平均值土SE，通过Kruskal-Wallis单因素ANOVA进行分析。相较于Sham动物,在经载体和经rhMFG_E8处理的动物中脑缺血症(MCAO)引起完整神经元数目的显著减少。rhMFG-E8处理保护了神经元免受坏死(η=6, *ρ〈0.05,相对于Sham ；#ρ<0.05,相对于载体)。
[0041]图1Oa-1Od.脑缺血症后,相较于载体和rhMFG_E8处理而言经sham-操作的大鼠(Sham)中脑IL-6、TNFa和髓过氧化物酶的改变。(a)在MCAO后24h通过ELISA测量脑IL-6水平。数据表示为平均值土SE，通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法进行分析。脑缺血症(MCAO)在经载体和rhMFGE8-处理的动物中相较于Sham动物而言引起IL-6水平的升高。相较于利用载体的处理，利用rhMFG-E8的处理下调IL-6表达(n=6，*p〈0.05，相对于Sham ；#p<0.05，相对于载体)。(b)对脑组织的TNF- α进行免疫组织化学染色，在亮视野显微镜术下在400χ初始放大倍数下进行检查。经载体(B)和rhMFG-E8(C)处理的动物显示相较于Sham动物(A)而言增加的TNF-α表达。rhMFG_E8处理(C)相较于载体(B)而言减少了 TNF-α表达。比例尺条棒=50 μ m。(c)脑组织针对嗜中性粒细胞标志物髓过氧化物酶免疫组织化学染色， 并且以400X初始放大倍数在亮视野显微镜术下检查。Sham(A)动物未显示髓过氧化物酶的染色(无嗜中性粒细胞浸润)，然而载体(B)和rhMFG-E8(C)处理的动物显示髓过氧化物酶的染色。脑缺血症后的rhMFG-E8处理(C)相较于载体(B)而言减少了髓过氧化物酶染色。比例尺条棒=50 μ m。(d)通过髓过氧化物酶免疫组织化学进行的脑嗜中性粒细胞浸润的定量。嗜中性粒细胞在亮视野显微镜术中在400x初始放大倍数下被鉴定为小的圆形髓过氧化物酶染色细胞。将每个载片中6个随机视野内嗜中性粒细胞的平均值测定为嗜中性粒细胞计数/40x高倍视野(hpf)。数据表示为平均值土SE，通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法来进行分析。与Sham动物相比较,经载体和rhMFG-E8处理的动物显示增加的嗜中性粒细胞浸润。rhMFGE8处理相较于载体而言减少了脑嗜中性粒细胞浸润(η=4, *ρ〈0.05,相对于Sham ；#ρ<0.05,相对于载体)。
[0042]图1 la-1 Ib.脑缺血症后ICAM-1和过氧化物酶体增生物激活受体-Y (PPAR- Y )表达的改变。(a)脑ICAM-1基因表达通过RT-PCR来测量。数据表示为平均值土SE，并且通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法来进行分析。相较于Sham而言脑缺血症，在载体中导致ICAM-1表达的上调。rhMFG-E8处理减少了 ICAM-1表达，即使相较于载体而言并不显著(η=4_6, *ρ〈0.05,相比于Sham)。(b)MCAO后24h通过western印迹测定PPAR- Y蛋白水平。数据表示为平均值土SE，并且通过Kruskal-Wallis单因素方差分析来进行分析。与Sham相比较，脑缺血症下调载体组中的PPAR- Y。rhMFG_E8处理相较于载体而言上调PPAR- Y表达(n=6，*p<0.05，相对于Sham ；#p<0.05，相对于载体)。[0043] 图12a_12c.在大鼠的脑缺血症后，通过Bcl_2/Bax比率和TUNEL染色测量的rhMFG-E8处理对细胞凋亡的作用。(a)Bcl_2/Bax比率通过western印迹来测定。数据表示为平均值土SE,并且通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法来进行分析。Bcl_2/Bax比率在载体与Sham之间没有不同。相较于载体和Sham而言，rhMFG_E8处理显著升高了 Bcl-2/Bax比率(n=6，*p〈0.05，相对于载体和Sham)。(b)脑缺血症后的TUNEL染色。在200x初始放大倍数下的荧光显微镜下，凋亡细胞显示为更亮的荧光，然而碘化丙锭(PI)更暗的染色显示TUNEL反应产物的细胞核定位。Sham组(A、B、C)未显示细胞凋亡，因为对于TUNEL染色(A)无阳性细胞。载体组(D、E、F)由TUNEL阳性细胞数目增加显示增加的细胞凋亡(D)。TUNEL染色(D)和PI染色(E)的合并(F)显示载体动物的半影中大多数细胞是凋亡的。利用rhMFG-E8 (G、H、I)的处理减少了细胞凋亡，如相较于载体TUNEL染色⑶而言更少的TUNEL染色(G)显示的。rhMFG-E8TUNEL染色(G)和PI染色(H)的合并⑴显示相较于载体组(F)而言rhMFG-E8处理保护了脑细胞免受细胞凋亡。(c) TUNEL染色的定量。在200x初始放大倍数下对每一张载片捕获8个随机视野。计数TUNEL阳性细胞的平均数目，将其表达为TUNEL细胞/20x高倍视野(hpf)。数据表示为平均值土 SE，并且通过单因素方差分析和Student Newman Keul氏法来进行分析。相较于Sham动物,脑缺血症增加了经载体和rhMFG-E8处理的动物中的TUNEL-阳性细胞。利用rhMFG_E8的处理相较于载体组而言减少了 TUNEL阳性细胞的数目(n=4，*p〈0.05，相对于Sham ；#p<0.05，相对于载体)。
[0044]发明详述
[0045]本发明提供了预防和/或治疗受试者的脑缺血症的方法，包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量给受试者施用乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)。
[0046]受试者可以例如是患有脑缺血症的受试者或处于发生脑缺血症风险中的患者，例如，经历或即将经历手术的患者。脑缺血症可以是例如由堵塞脑血管的血块引起的局灶性脑缺血，或由向脑的血流减少引起的全脑缺血。
[0047]如本文中所用，“治疗”受试者的脑缺血症意指阻止或减少脑缺血症的生理影响。例如，给受试者施用MFG-E8可降低白细胞介素-6 (IL-6)的脑水平，和/或减少浸润的嗜中性粒细胞的数目，和/或减少脑炎症和/或细胞凋亡。优选地，MFG-E8的施用减少和/或防止脑组织的死亡。优选，受试者的存活概率通过MFG-E8的施用得到了提高。
[0048]本发明还提供了制备用于预防和/或治疗脑缺血症的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量在药物组合物中配制乳脂球表皮生长因子-因子 VIII(MFG-E8)。
[0049]本发明还提供了包含以用于预防和/或治疗脑缺血症的剂型存在的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0050]本发明还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8);和提供关于施用MFG-E8以预防和/或治疗脑缺血症的说明的包装说明书的药品。
[0051]在本文中描述的任何方法、组合物、产品或用途的一个优选实施方案中，MFG-E8是重组人MFG-E8(rhMFG-E8)。在不同的实施方案中，rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性，或与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性，或与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，MFG-E8是非糖基化的。
[0052]本发明还提供了具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列的重组人MFG-E8 (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0053]本发明还提供了预防和/或治疗受试者中缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的方法，包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量给受试者施用重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，其中rhMFG-E8是非糖基化的。缺血/再灌注可以例如是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或挤压肢体缺血/再灌注中的一种或多种。
[0054]优选地，所述方法阻止或降低了肿瘤坏死因子-α、白细胞介素_6、白细胞介素-1 β、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸或乳酸脱氢酶中一种或多种的血清升高。优选地，炎症被预防或治疗。优选地，器官损伤被预防或治疗，其中例如，所述器官是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或挤压肢体中的一种或多种。优选地，受试者的存活概率增加。 [0055]本发明还提供了治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效地减小脓毒症的生理作用的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子 VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。脓毒症的生理作用可以是例如血清TNF-α水平的升高，和/或血清IL-6水平的升高，和/或休克。优选地，rhMFG-E8的施用减轻了全身性炎症。
[0056]本发明还提供了治疗受试者的肺损伤的方法，包括给受试者施用有效地治疗肺损伤的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。在一个优选实施方案中，肺损伤是急性肺损伤。
[0057]除本文中公开的rhMFG_E8外的MFG-E8形式用于治疗脓毒症、缺血/再灌注和肺损伤的用途已进行了描述(US2009/0297498、W02009/064448)。
[0058]本发明还提供了制备用于预防和/或治疗受试者中缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少 95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0059]本发明还提供了用于制备用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地减小脓毒症的生理作用的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0060]本发明还提供了制备用于治疗受试者的肺损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地治疗肺损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少 95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0061]本发明还提供了包含以用于预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0062]本发明还提供了包含以用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0063]本发明还提供了包含以用于治疗肺损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0064]本发明还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和提供关于施用缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的说明的包装说明书的药品，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0065]本发明还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的说明的包装说明书的药品，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) ( SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG_E8是非糖基化的。
[0066]本发明还提供了包含在药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以用于治疗肺损伤的说明的包装说明书的药品，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的。
[0067]本发明还提供了乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)用于制备用于预防和/或治疗脑缺血症的药剂的用途，以及乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)用于预防和/或治疗脑缺血症的用途。
[0068]本发明还提供重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)用于制备药剂的用途，所述药剂用于预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤，或用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者，或用于治疗肺损伤，其中rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中rhMFG-E8是非糖基化的，还提供了 rhMFG_E8用于预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤，或用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者，或用于治疗受试者的肺损伤。
[0069]在重组人MFG-E8、方法、组合物、产品或用途的不同实施方案中，所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列，或rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E 8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。[0070]可将MFG-E8在包含药学上可接受载体的药物组合物中给受试者施用。可接受的药物载体的实例包括但不限于添加液(additive solution) _3 (AS_3)、盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液、乳酸盐林格溶液、Locke-Ringer溶液、Krebs Ringer溶液、Hartmann氏平衡盐溶液和肝素化柠檬酸钠右旋糖溶液。
[0071]无需过度实验即可配制包含MFG-E8的组合物以施用给受试者，包括人(视具体应用而定)。此外，使用标准剂量-反应方案，无需过度实验即可测定组合物的适当剂量。
[0072]因此，通过本领域内公知的方法，例如利用惰性稀释剂或利用可食用载体，无需过度实验即可制备设计用于口服、经舌、舌下、经颊和颊内施用的组合物。可将组合物封装于明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用目的，可将本发明的药物组合物与赋形剂整合在一起，以片剂、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、华夫、口香糖等形式使用。
[0073]片剂、丸剂、胶囊、糖锭等还可包含粘合剂、接受者、崩解剂、润滑剂、甜味剂和调味剂。粘合剂的一些实例包括微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些实例包括海藻酸、玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的实例是胶体二氧化硅。甜味剂的一些实例包括蔗糖、糖精等。调味剂的实例包括薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂等。用于制备这些不同组合物的材料应当是药学上纯的并且在使用的量上是无毒的。
[0074]本发明的组合物可以例如通过静脉内、肌内、硬膜内或皮下注射来容易地胃肠外施用。胃肠外施用可通过将本发明的组合物掺入溶液或悬浮液来实现。这样的溶液或栓剂还可包括无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。胃肠外制 剂还可包括抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠以及螯合剂例如EDTA。还可添加缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可将胃肠外制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0075]直肠施用包括将药物组合物施用进入直肠或大肠。这可使用栓剂或灌肠剂来实现。栓剂制剂可容易地通过本领域已知的方法来制备。例如，栓剂制剂可通过将甘油加热至约120°C，将组合物溶解于甘油中，混合加热的甘油(随后可添加纯化的水)和将热混合物倾倒入栓剂模具中来制备。
[0076]经皮施用包括通过皮肤进行的组合物的经皮吸收。经皮制剂包括贴剂(例如公知的烟碱贴剂)、软膏、乳膏、凝胶、油膏等。
[0077]本发明包括经鼻给哺乳动物施用治疗有效量的组合物。如本文中所用，经鼻施用或鼻腔施用包括将组合物施用至患者的鼻道或鼻腔粘膜。如本文中所用，用于经鼻施用组合物的药物组合物包括待施用(例如以鼻腔喷雾、滴鼻剂、悬浮液、凝胶、软膏、乳膏或粉剂的形式)的通过公知方法制备的治疗有效量组合物。组合物的施用还可使用鼻塞或鼻腔海绵来进行。
[0078]受试者可以是人或另一种动物。
[0079]来自人或小鼠MFG-E8的氨基酸序列示于下文中。
[0080]SEQ ID 勵:2-人]\^648-来自 GenBank NP005919
[0081]I mqvsrvlaal cgmllcasgl faasgdfcds slclnggtcl tgqdndiycl cpegftglvc
[0082]61 netergpcsp npcyndakcl vtldtqrgdi fteyicqcpv gysgihcete tnyynldgey[0083]121 mfttavpnta vptpaptpdl snnlasrcst qlgmeggaia dsqisasyvy mgfmglqrwg
[0084]181 pelarlyrtg ivnawhasny dskpwiqvnl lrkmrvsgvm tqgasragra eylktfkvay
[0085]241 sldgrkfefi qdesggdkef lgnldnnslk vnmfnptlea qyirlypvsc hrgctlrfel
[0086]301 lgcelhgcle plglknntip dsqmsasssy ktwnlrafgw yphIgrIdnq gkinawtaqs
[0087]361 nsakcwlqvd lgtqrqvtgi itqgardfgh iqyvcsykva hsddgvqwtv yeeqgsskvf
[0088]421 qgnldnnshk knifekpfma ryvrvlpvsw hnritlrlel Igc
[0089]人MGF-E8蛋白合成为上文中显示的387个氨基酸的前体，其包含23个氨基酸的信号序列和364个氨基酸的成熟区域。本研究中表达的重组人蛋白是人MFG-E8的成熟分子(SP，Leu24-Cys387)，即 SEQ ID NO:2 的氨基酸 24 至 387，其在本文中称为 SEQ ID NO:1。
[0090]SEQ ID NO: 3-小鼠 MFG-E8-来自 GenBank NP032620
[0091]I mqvsrvlaal cgmllcasgl faasgdfcds slclnggtcl tgqdndiycl cpegftglvc
[0092]61 netergpcsp npcyndakcl vtldtqrgdi fteyicqcpv gysgihcete tnyynldgey
[0093]121 mfttavpnta vptpaptpdl snnlasrcst qlgmeggaia dsqisasyvy mgfmglqrwg
[0094]181 pelarlyrtg ivnawhasny dskpwiqvnl lrkmrvsgvm tqgasragra eylktfkvay
[0095]241 sldgrkfefi qdesggdkef lgnldnnslk vnmfnptlea qyirlypvsc hrgctlrfel
[0096]301 lgcelhgcle plglknntip dsqmsasssy ktwnlrafgw yphIgrIdnq gkinawtaqs
[0097]361 nsakcwlqvd lgtqrqvtgi itqgardfgh iqyvcsykva hsddgvqwtv yeeqgsskvf
[0098]421 qgnldnnshk knifekpfma ryvrvlpvsw hnritlrlel Igc
[0099]根据下列实验性详细内容，本发明将得到更好地理解。然而，本领域技术人员将容易地理解，所讨论的具体方法和结果仅举例说明本发明，其将在随后的权利要求中更全面地描述。
[0100]实验详细内容
[0101]实施例1.重组人MFG-E8和脓毒症的治疗
[0102]材料和方法
[0103] 重组人MFG-E8的表达:通过聚合酶链式反应扩增包含人MFG_E8cDNA的质粒模板获得编码人MFG-E8的成熟区域(364个氨基酸，R24-R387, SwissProt#:Q08431)的1095bp片段(SEQ ID NO: 3) ο将开放阅读框架克隆进入pET-28a(+)载体(Novagen，Madison, WI)的Sail和Not I位点，位于噬菌体T7RNA聚合酶启动子下游。终蛋白质产物包含融合至人MFG-E8的N末端的6个组氨酸。将质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。将细胞在37°C于含有卡那霉素的2YT培养基中(Invitrogen)中生长过夜。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)添加至终浓度1.01111来诱导^11^648蛋白质产生，并且将细胞在25°C继续生长5h。通过离心收获细胞,按照制造商的说明书(Novagen)纯化诱导的rhMFG-E8蛋白。将rhMFG_E8级分混合，使用Triton X-114通过相分离除去蛋白质溶液的内毒素(Aida和Pabst, 1990)。使用先前描述的(Li,等人，2004)鲎溶解物测定(Limulusamebocyte lysate assay) (BioWhittaker Inc, Walkersville, MD)测定样品中 LPS 的含量。在10-20%Tris-HCl凝胶上通过SDS-PAGE评价rhMFG_E8的纯度，并且使用GelCode Blue染色剂(Pierce, Rockford IL)进行显现。利用Amicon Ultra-15离心过滤设备将终产物浓缩至指定的浓度并且于_20°C贮存。
[0104]编码人MFG-E8的DNA序列(除去信号肽)(SEQ ID NO: 4):
【权利要求】
1.一种预防和/或治疗受试者的脑缺血症的方法，包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量给受试者施用乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者具有脑缺血症。
3.权利要求1的方法，其中所述受试者是处于发生脑缺血症的风险中的患者。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脑缺血症是由阻塞脑血管的血块引起的局灶性脑缺血。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脑缺血症是由至脑的血流减少引起的全脑缺血。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中施用MFG-E8降低了白细胞介素-6(IL_6)的脑水平。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中施用MFG-E8减少了浸润中性粒细胞的数目。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中施用MFG-E8减轻脑炎症和/或细胞凋亡。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中施用MFG-E8减少和/或预防脑组织的死亡。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中受试者的存活机会增加。
11.一种制备用于预防和/或治疗脑缺血症的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗脑缺血症的量在药物组合物中配制乳脂球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述MFG-E8是重组人MFG-E8(rhMFG_E8)。
13.权利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列。
14.权利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
15.权利要求12的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
17.一种药物组合物，其包含以用于预防和/或治疗脑缺血症的剂型存在的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8)和药学上可接受的载体。
18.—种药品，其包含在药学上可接受的载体中配制的乳脂球表皮生长因子-因子VIII (MFG-E8);和提供关于施用MFG-E8以预防和/或治疗脑缺血症的说明的包装说明书。
19.权利要求17的药物组合物或权利要求18的药品，其中所述MFG-E8是重组人MFG-E8(rhMFG-E8)。
20.权利要求19的药物组合物或药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列。
21.权利要求19的药物组合物或药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
22.权利要求19的药物组合物或药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
23.权利要求17-22中任一项的药物组合物或药品，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
24.乳脂球表皮生长因子-因子VIII(MFG-ES)用于制备用于预防和/或治疗脑缺血症的药剂的用途。
25.一种重组人MFG-E8(rhMFG-E8)，其具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
26.权利要求25 的 rhMFG-E8，其中所述 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
27.权利要求25 的 rhMFG-E8，其中所述 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)相同的氨基酸序列。
28.一种预防和/或治疗受试者的缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的方法，包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量给受试者施用重组人乳脂球表皮生长因子-因子 VIII (rhMFG-E8)，其中所述 rhMFG_E8 具有与人 MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
29.权利要求28的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
30.权利要求28 的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
31.权利要求28-30中任一项的方法，其中所述方法阻止或减少肿瘤坏死因子_α、白细胞介素_6、白细胞介素-1 β、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸或乳酸脱氢酶中的一种或多种的血清升高。
32.权利要求28-31中任一项的方法，其中所述受试者的存活机会增加。
33.权利要求28-32中任一项的方法，其中所述炎症被预防或治疗。
34.权利要求28-33中任一项的方法，其中所述器官损伤被预防或治疗。
35.权利要求34的方法，其中所述器官是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的肢体中的一个或多个。
36.权利要求28-33中任一项的方法，其中所述缺血/再灌注是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的肢体中的一个或多个的缺血/再灌注。
37.一种治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效地减小脓毒症的生理作用的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
38.权利要求37的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
39.权利要求37的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
40.权利要求37-39中任一项的方法，其中脓毒症的生理作用是血清TNF-α水平的升高或血清IL-6水平的升高。
41.权利要求37-39中任一项的方法，其中脓毒症的生理作用是休克。
42.权利要求37-41中任一项的方法，其中所述rhMFG-E8施用减弱全身性炎症。
43.一种治疗受试者的肺损伤的方法，包括给所述受试者施用有效地治疗肺损伤的量的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
44.权利要求43的方法，其中所述肺损伤是急性肺损伤。
45.权利要求43或44的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
46.权利要求43或44的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8) (SEQ IDNO:1)相同的氨基酸序列。
47.一种制备用于预防和/或治疗受试者的缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
48.一种制备用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地减轻脓毒症的生理作用的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
49.一种制备用于治疗受试者的肺损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地治疗肺损伤的量在药物组合物中配制重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
50.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
51.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
52.一种药物组合物，其包含以用于预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
53.一种药物组合物，其包含以用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8)和药学上可接受的载体，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8(hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
54.一种药物组合物，其包含以用于治疗肺损伤的剂型存在的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhM FG-E8)和药学上可接受的载体，其中所述rhMFG_E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
55.一种药品，其包括于药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤的说明的包装说明书，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8)(SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG_E8是非糖基化的。
56.一种药品，其包括于药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者的说明的包装说明书，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
57.一种药品，其包括于药学上可接受的载体中配制的重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII (rhM FG-E8);和提供关于施用rhMFG_E8以治疗肺损伤的说明的包装说明书，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
58.权利要求52-54中任一项的药物组合物或权利要求55-57中任一项的药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG_E8) (SEQ ID NO:1)具有至少99%的同一性的氨基酸序列。
59.权利要求52-54中任一项的药物组合物或权利要求55-57中任一项的药品，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
60.重组人乳脂球表皮生长因子-因子VIII(rhMFG-E8)用于制备药剂的用途，所述药剂用于预防和/或治疗缺血/再灌注后炎症和/或器官损伤，或用于治疗患有脓毒症的受试者或处于发生脓毒症的风险中的受试者，或用于治疗肺损伤，其中所述rhMFG-E8具有与人MFG-E8 (hMFG-E8) (SEQ ID NO:1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列，并且其中所述rhMFG-E8是非糖基化的。
【文档编号】A61K38/18GK103987401SQ201280028451
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年4月28日
【发明者】王平 申请人:范斯坦医药研究院