在肺动脉高血压的治疗中调控microrna的方法
【专利摘要】本发明提供一种在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压的方法，即对该受试者施用miR-145表达或活性的抑制剂。还公开了用于治疗肺动脉高血压的包含miR-145抑制剂的药物组合物和试剂盒。
【专利说明】在肺动脉高血压的治疗中调控MICRORNA的方法
发明领域
[0001]本发明涉及肺动脉高血压的治疗和预防，即施用调控一种microRNA(miRNA)的活性或表达的药剂。具体地，本发明提供用于治疗或预防肺动脉高血压的方法，即抑制有此需要的受试者的细胞中miR-145的表达或活性。[0002]发明背景
[0003]肺动脉高血压(PAH)是肺小动脉(PA)的一种疾病，其特征在于PA压和血管重塑的增加，从而导致肺血管阻力的进行性增加(Rich等，1987)。血管闭合(obliteration)的后果是右心衰竭和高死亡率(Jeffery等，2002; Voelkel等，1997)。在约70%的患有可遗传形式的PAH(hPAH)的患者中已鉴定出编码骨形态发生蛋白(BMP) 2型受体(BMPR2)(—种针对转化生长因子(TGF)-13超家族的受体)的基因中的种系突变(Morrell等，2001)。而且，在缺乏此基因中突变的情况下，PAH病例中BMPR2表达也显著降低(先天性ΡΑΗ，?ΡΑΗ)，表明此受体途径在PAH形成中的更广泛的作用。在肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中，BMPR2中的突变与对BMP和TGF-β的异常生长应答有关。在内皮细胞中，这些突变增加了细胞对凋亡的易感性(PAEC) (Morrell等，2001)。在一些家族中和大多数iPAH病例中不存在BMPR2突变表明，仍然需要鉴定出另外的、可能与TGF-β超家族有关的病理学机制。
[0004]对于所有PAH形式来说共同的一个主要的组织病理学特征是表达平滑肌特异性α-肌动蛋白(SMA)的细胞在周围肺动脉中的积累。这包括SMA阳性细胞在新内膜(neointima)中的出现和SMA阳性细胞到正常没有平滑肌的前毛细管肺微动脉中的扩张(Mandegar等，2004)。负责PA的该远端部分的肌肉化(muscularization)的细胞过程尚不清楚，但这些观察表明PASMC在PAH形成中的重要作用。
[0005]MicroRNA (miRNA)是一类小的内源性非编码RNA，其能够通过靶向特定的信使RNA(mRNA)并诱导它们的降解或翻译抑制来负性调苄基因表达(Ambros, 2004;Bartel, 2009)。最近的研究已将mRNA降解定义为miRNA:mRNA靶物的主要机制性作用(Guo等，2010)。数项最近的研究评估了 miRNA在血管炎症中以及血管病理形成中的直接作用(Kartha和Subramanian, 2010;Urbich等，2008)。在一项最近的研究中，显示miR-145在血管壁中丰富表达(Cheng等，2009)。MiR-145被转录为编码人5号染色体上(Lio等，2010)和小鼠18号染色体上的miR-143和miR-145两者的长初始!1^1?應(?1^-1^1?應)，其受到保守SRF结合位点的调节(Xin等，2009)。miR-145到血管壁的定位显示在平滑肌层中相比于外膜(adventitial)成纤维细胞和内皮细胞的高表达(Cheng等，2009)。因此，miR-145被视为一种平滑肌细胞表型标志物和调控物，它能够经由它的靶基因KLF-5及其下游信号分子心肌蛋白(myocardin)调节平滑肌细胞(SMC)成熟和增殖，以及血管新内膜损伤形成(Cheng等，2009;Elia等，2009)。已显示TGF-β超家族中的激动剂经由Smad依赖性途径激活miR-143/145簇(Davis-Dusenbery等，2011; Long等，2011)。而且，对miR-145、miR-143和miR-143/145敲除(ko，-/-)小鼠的分析显示主动脉和其它周围动脉的明显更薄的平滑肌层，这是由于肌动蛋白丝的破坏诱导降低的SMC大小(Elia等，2009)。这导致miR-145-/-小鼠中应答损伤产生中度系统性低血压和缺乏新内膜形成(Xin等，2009)。而且，从单ko和双ko动物分离的血管平滑肌细胞(VSMC)显示高增殖活性和更高的向源自血小板的生长因子(TOGF，VSMC的一种已知的化学引诱剂)迁移的能力(Elia等，2009; Xin等，2009)。此外，对miR-143 (145) ko小鼠血管系统的药理学分析揭示了对血管加压(vasopressive)刺激的减弱应答(Elia等，2009;Xin等，2009)。总之，这些发现显示VSMC在miR-145ko和miR-143/145双ko小鼠中的去分化表型。
[0006]尽管对基础遗传学的理解有所改善，但PAH仍然是一种严重且经常致命的疾病。小肺动脉的广泛重塑，包括肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖，表征其病理学。目前对PAH的治疗无法适当处理PAH病理学根本性的平滑肌增殖。如此，本领域中需要开发出对PAH的新疗法。据报告在血管重塑中起作用的miCToRNA代表了一种在开发针对PAH的有效治疗中的潜在的新治疗靶物。
[0007]发明概述
[0008]本发明部分基于以下发现，即miR-145在PAH的小鼠模型中调节异常而在患有PAH的特发性和可遗传形式的人的肺组织中上调。在发育中敲除动物中消除miR-145表达赋予免于PAH形成的保护。因此，本发明提供一种在有此需要的受试者中治疗或预防PAH的方法，即对该受试者施用miR-145表达或功能的抑制剂。
[0009]在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用包含与miR-145序列(例如初始miR-145、前体miR-145或成熟miR-145)至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与人成熟miR-145序列至少部分互补的序列。反义寡核苷酸可含有一个或多个主链或糖修饰，如硫代磷酸酯连接、2’-O-烃基修饰和双环糖核苷修饰(例如，锁定核酸(LNA))。在一些实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸抑制剂的长度为约8至约18个核苷酸。在具体的实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸抑制剂的长度范围为约12至约16个核苷酸或长度为约10至约14个核苷酸。
[0010]在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸是antimiR。AntimiR是祀向并抑制miR-145的反义寡核苷酸。AntimiR可以是LNA antimiR。在一个实施方案中，antimiR革巴向成熟miR-145的碱基2-17。在另一个实施方案中，antimiR长度为16个核苷酸。在又一个实施方案中，antimiR是全部硫代磷酸化的(thiophosphate)。AntimiR可以是全部硫代磷酸化的并与miR-145的5’区完全互补。AntimiR还可以合成为LNA和DNA的混合物。
[0011]在本发明的另一个实施方案中，将miR-145抑制剂施用给诊断为或有风险形成肺高血压或肺动脉高血压(PAH)的受试者。受试者可能诊断为或有风险形成的肺高血压的形式包括但不限于，特发性PAH、遗传性或家族性PAH、和继发性肺高血压(例如起因于肺栓塞、肺气肿、肺纤维化和先天心脏病的高血压)。在一个实施方案中，受试者被诊断为患有特发性PAH或遗传性PAH。在一些实施方案中，有形成PAH风险的受试者在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。在一个具体的实施方案中，受试者是人。
[0012]可以经由各种路径将miR-145抑制剂施用给受试者，包括静脉内、动脉内、鼻、口腔，或经由肺部路径(例如通过经由鼻或口吸入)。在某些实施方案中，通过吸入路径经由肺部投递装置施用miR-145抑制剂。在这类实施方案中，miR-145抑制剂可配制为干粉末或液体气雾剂。
[0013]本发明还包括用于治疗或预防肺动脉高血压的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含如本文中描述的miR-145的抑制剂和施用装置。施用装置可设计为用于肺部投递，如吸入器、喷雾器(nebulizer)、吹入器(insufflator)、点滴器(dropper)和气雾器(aerosolizer)。在其它实施方案中，施用装置可设计为用于静脉内或动脉内投递，如导管。任选地，miR-145抑制剂可配制为存放在施用装置中。试剂盒还可包含用于对受试者(例如人)施用miR-145抑制剂以治疗或预防PAH的用法说明书。
[0014]附图简述
[0015]图1.MiR145探针对SMC的共定位。处理正常人肺切片用于miR145和SMA染色，如实施例中详述的。(A)miR145探针和SM肌动蛋白，(B)对照探针和SM肌动蛋白。10倍放大。(C)在正常人的肺和来自患有iPAH和fPAH的患者的肺中的分析。
[0016]图2.MiR-145在小鼠肺切片中的定位和在含氧量正常对缺氧小鼠中的表达。(A)显示miR-145在小鼠肺中定位的原位杂交。将石蜡切片再水合并与抗miR-145或作为阴性对照的混杂探针温育。对于共定位，在相同样品中使用免疫组化测定法检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像放大100或400倍=50 μ m。对含氧量正常和14天缺氧的野生型小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)10周龄小鼠的(B)整个肺或(C)右心室提取总RNA。分析6只小鼠/组。一式三份地测试每份样品。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用不配对t检验分析数据(***p〈0.001相对对照样品)。
[0017]图3.含氧量正常相对于缺氧小鼠中的MiR-143。对含氧量正常和14天缺氧的wt小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)10周龄小鼠的(A)整个肺或(B)右心室提取总RNA。分析6只小鼠/组。一式三份地测试每份样品。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用不配对t检验分析数据(*ρ〈0.05, ***ρ 〈0.001相对含氧量正常样品)ο
[0018]图4.在缺氧wt小鼠的脑、肾和脾中的MiR-145表达。(A、B、C分别)为来自含氧量正常(白色条)或缺氧(黑色条)小鼠。从每种器官中一式四份地提取总RNA并通过q-PCR分析。使用t检验分析数据但未鉴定出显著性。
[0019]图5.体外暴露于5%缺氧的SMC中的MiR-145表达。将原代远端肺动脉平滑肌细胞暴露于(A) 24h或(B) 72h，体外5%缺氧，并评估在有和无抑制剂SB203580 (p38抑制剂-5μΜ) ；SB431542(TGF-^ 抑制剂 _1 μ M) ；U0126(ERK 抑制剂 _1 μ Μ)存在下 miR145 在24的水平。
[0020]图6.对在miR-145-/-小鼠相比于wt小鼠中的miR-145表达的分析。ko小鼠中的miR-145消除由(A) q-PCR和⑶原位分析确认。图像均100倍放大，比例尺=100 μ m。
[0021]图7.野生型和miR-145-/-小鼠中应答缺氧的MiR-143表达。对含氧量正常和14天缺氧野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的q-PCR分析。从含氧量正常(黑色条)或缺氧(条纹条)10周龄小鼠提取总RNA。分析6只小鼠/组。将结果标准化至U6值并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(***ρ〈0.001相对对照样品)。
[0022]图8.miR-145消除对小鼠中PAH形成和血管重塑的影响。评估(A)右心室收缩压(sRVP, n=9-10)和(B)右心室肥大(RVH, n=9_10)。(C)用 Elastic-Van Gieson 染色的代表性肺动脉。图像均400倍放大，比例尺=50 μ m。(D)来自含氧量正常和缺氧野生型(WT)和miR-145-/-小鼠(n=5)的肺动脉重塑。使小鼠经受缺氧达14天。N,小鼠数。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p〈0.05相对WT含氧量正常小鼠)。
[0023]图9.在含氧量正常或缺氧条件下的野生型和miR-145-/-小鼠中对(A)全身动脉压(systemic arterial pressure, SAP, n=6_9)和(B)心率(HR, n=6_10)的评估。使小鼠经受缺氧达14天。N,小鼠数。使用双因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*ρ〈0.05, #ρ〈0.005, *#ρ〈0.001相对野生型含氧量正常小鼠)。
[0024]图10.对miR-145选定靶物的分析。通过q_PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的整个肺中评估(A)SMAD5，(B) SMAD4, (C)KLF4和(D)KLF5的表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据Ορ〈0.05, ***ρ〈0.001)。
[0025]图11.对WT和miR-145-/-缺氧雌性小鼠中KLF4和KLF5蛋白表达水平的分析。(A、D)通过western印迹在暴露于长期缺氧达14天的WT和miR-145-/-小鼠的整个肺中评估KLF4和KLF5的表达水平。分析4只小鼠/组,并使用特定软件(Scion Image software)测量western印迹条带的强度。所得定量条示意在(B)、(C)、(E)和(F)的图中。将结果标准化至GAPDH值并表达为倍数增加，其中将任意值I分配给WT组。使用不配对t检验来分析数据(**ρ〈0.005相比于wt小鼠)。
[0026]图12.微阵列数据的验证。通过q-PCR在wt和miR-145-/-小鼠(含氧量正常和缺氧)的肺动脉中评估(A)WIFl, (B)TGFB2, (C)FRZB, (D)DAB2, (E)ACE, (F)FSCNl, (G)CTGF, (H)Angptl4, (I)AP2B1和(J) ITGBLlI的表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni 事后检验来分析数据(*ρ〈0.05, ***ρ〈0.001)。
[0027]图13.在注射miRNA特异性的antimiR之后获得的对miR-145或miR-143的选择性敲低。将8周龄雌性小鼠用与成熟miR-143或miR-145序列之一的5’区完全互补的antimiR皮下注射，并接受长 期缺氧达14天。它们在缺氧8天后接受第二次注射。14天后，将小鼠杀死并从肺提取总RNA。含氧量正常的用媒介处理的动物，缺氧的用媒介处理的动物，和用混杂、miR-145或miR_143antimiR注射的缺氧动物中的(A)miR-145和(B)miR-143表达。(C)-(F)通过q-PCR对相同RNA的Northern印迹分析，其显示(C)-(D)miR-145或(E)-(F)miR-143表达水平。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*p<0.05, ***ρ〈(λ 001.miR-145和miR-143下调对所有其他组均是统计学显著的)。
[0028]图14.MiR-145或miR-143敲低对小鼠中PAH形成和血管重塑的影响。在用特异于miR-145或miR-143的antimiR、混杂的antimiR或媒介处理并暴露于长期缺氧达14天的C57B16小鼠中评估(A)右心室收缩压(sRVP，n=6 - 10)、(B)右心室肥大(RVH n=7_13)。(C)在相同组(n=4)中测量的肺动脉重塑。η=小鼠数。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据(*ρ〈0.05, **ρ〈0.005, ***ρ〈0.001)。(D)用 Elastic-Van Gieson 染色的代表性肺动脉。图像均40倍放大，比例尺=20 μ m。
[0029]图15.在用媒介处理的含氧量正常小鼠和用媒介、混杂的、miR-145或miR-143antiMir注射的缺氧小鼠中评估(A)全身动脉压(SAP, n=6 - 8)和⑶心率(HR, n=7-13)。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据。
[0030]图16.对iPAH和hPAH人肺中miR-145表达水平的评估。(A)对从iPAH(n=6)、hPAH (n=5)和对照患者(n=6)的石蜡包埋的人肺提取的RNA的q-PCR分析，其显示miR-145的表达水平。将所有样品均标准化至Rnu-48值并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用双因素ANOVA继之以Boneironi事后检验来分析数据(*p〈0.05, **p〈0.005)。(B)对从用于q-PCR分析的相同样品获得的石蜡切片中miR-145表达的原位分析。将混杂探针用作阴性对照。对于共定位，在相同样品中使用在连续切片上的免疫组化检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像显示在典型复杂损伤和新肌肉化的微动脉中α肌动蛋白和miR-145的增加的表达。图像均400倍放大，比例尺=50 μ m。(C)在hPAH患者的新内膜损伤中的miR-145下调。对于共定位，通过免疫组化检测α肌动蛋白表达。
[0031]图17.对人BMPR2突变的PASMC的分析。(A)对PASMC中miR-145表达的qPCR分析。从具有BMPR2基因中突变的hPAH患者的PASMC提取总RNA。使用原代细胞的第4代传代。对于前体miR-145和成熟miR-145表达，相比于不受影响的对照分析cDNA。将结果标准化至(A) GAPDH (对于前体miR-145)和(B) Rnu-48 (对于成熟miR-145)，并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用不配对t检验来分析数据(**p〈0.005, ***p〈0.001相对对照样品)。(C)将从野生型和BMPR2突变的细胞提取的相同总RNA还用于northern印迹分析以确认q-PCR结果。印迹定量用Scion Image软件实施:建立感兴趣的miRNA的条带强度并标准化至相应的U6信号(D).使用不配对t检验来分析数据(***p〈0.001相对对照样品)。
[0032]图18.在经由siRNA下调BMPR2表达的人PASMC中的miR-143和miR-145上调。将原代人PASMC用能靶向并特异性抑制BMPR2表达的siRNA或用作为阴性对照的si混杂(siScramble)转染。在72h后，从这些样品和用于比较的未经处理细胞提取总RNA。BMPR2下调的效率由(A)TaqMan Real-Time PCR评估。在相同样品中还评估(B)miR_143和(C)miR-145表达。将结果标准化至GAPDH(对于BMPR2)和Rnu_48(对于miR-143和miR-145)，并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组。使用单因素ANOVA继之以Bonerroni事后检验来分析数据。**p〈0.005, ***p〈0.001相比于CTR或si混杂组,如指示的。
[0033]图 19.wt 和 BMPR2BMPR2R899X 小鼠中的 miR-145 表达。从 4 只 wt 或 BMPR2 突变小鼠的整个肺中提取RNA，并评估miR-14`5表达，所述评估通过(A) q_PCR，其中一式三份地分析每份样品，将结果标准化至U6并表达为相对倍数变化，其中将任意值I分配给对照组(***ρ〈0.001相对对照样品)；和(B)-(C)通过northern印迹。(D)显示miR-145在相同小鼠的肺中定位的原位杂交。将石蜡切片再水合并与抗miR-145或作为阴性对照的混杂探针温育。对于共定位，在相同样品中使用免疫组化测定法检测α肌动蛋白，其中以非免疫同种型IgG抗体作为阴性对照。图像200倍放大，比例尺=50 μ m。
[0034]发明详述
[0035]本发明部分基于以下令人惊讶的发现，即miR-145表达和功能在肺动脉高血压(PAH)的形成中起着关键作用。发明人显示，miR-145在应答长期缺氧的小鼠中显著上调，且对miR-145的遗传或药学抑制对小鼠中PAH形成是保护性的。在人组织中，发明人报告了从具有BMPR2基因中突变的PAH患者获得的肺组织和分离的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中前体和成熟miR-145形式相比于对照升高。如此，本发明提供将miR-145作为对PAH治疗干预的新靶物。
[0036]在一个实施方案中，本发明提供在有此需要的受试者中治疗或预防肺高血压，特别是PAH的方法，包括对受试者施用miR-145表达和/或活性的抑制剂。当肺中的肺动脉变得拥挤、阻塞或受损从而导致动脉压升高时发生肺高血压。右心室增强的工作负载导致心肌劳损并且能导致心力衰竭。PAH的症状包括但不限于，呼吸短促(开始时在运动时出现，最后在休息时也出现)、疲劳、头晕或晕眩(fainting spell)、胸部压迫或疼痛、下肢(踝和腿)和腹部中的肿胀、皮肤和唇带蓝色、以及快速脉搏或心悸。优选地，在患有PAH的受试者中施用miR-145抑制剂后，相比于未接受治疗的受试者，前述症状的一种或多种得到改善或消除，或者PAH的形成延迟。在一些实施方案中，受试者中的右心室收缩压在施用miR-145抑制剂后降低。
[0037]可用本发明的方法治疗的肺高血压的形式包括但不限于，特发性PAH、遗传性或家族性PAH、和继发性肺高血压(例如起因于肺栓塞、肺气肿、肺纤维化和先天心脏病的高血压)。PAH的家族性或遗传性形式与某些基因中的突变相关。例如，70%的具有可遗传形式PAH的患者在编码骨形态发生蛋白(BMP) 2型受体(BMPR2)的基因中具有突变(Morrell等，2001)。如此，在一些实施方案中，要用本发明方法治疗的受试者有形成PAH的风险。在一个实施方案中，有风险的受试者(例如人)在编码BMPR2的基因中具有突变。
[0038]如本文中使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如黑猩猩和其它猿和猴物种)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如犬和猫)、实验室动物(例如啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠)、以及鸟类(例如家禽、野生鸟类和猎鸟，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类(gallinaceous bird)、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受试者是人。
[0039]miR-145与miR-143 —起位于鼠18号染色体和人5号染色体上基因间区内的簇中。MiR-145和miR-143 (彼此不具有同源性)共转录为单一转录本。miR-145的前体miRNA(pre-miRNA)序列被加工为成熟序列和星号(即次要(minor))序列。星号序列从茎环结构的另一臂加工。下面给出了小鼠和人miR-145的前体miRNA(例如茎环序列)、成熟序列和星号序列:`[0040]人成熟miR-145 (SEQ ID NO:1)
[0041]5， -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3，
[0042]人miR-145*(SEQ ID NO:2)
[0043]5， -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3，
[0044]人前体miR-145 (SEQ ID NO:3)
[0045]5， -CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGC UAAGAU
[0046]GGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU-3，
[0047]小鼠成熟miR-145 (SEQ ID NO:4)
[0048]5， -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3，
[0049]小鼠miR-145* (SEQ ID NO:5)
[0050]5， -AUUCCUGGAAAUAC腳UCUUG-3，
[0051]小鼠前体miR-145 (SEQ ID NO:6)
[0052]5， -CUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUGGAUGCUAAGAUGG GGAUUCCU
[0053]GGAAAUAC腳UCUUGAG-3，
[0054]上文序列可以是核糖核酸序列或脱氧核糖核酸序列或这两者的组合(即包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的核酸)。理解包含任一种本文所述序列的核酸对于DNA序列将会把尿苷碱基替换为胸苷碱基，而对于RNA序列将会把胸苷碱基替换为尿苷碱基。
[0055]适于用在本发明方法中的miR-145表达或活性的抑制剂包括反义寡核苷酸、antagomir、合成性核酶或适体。在某些实施方案中,miR-145的抑制剂是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一个化学修饰(例如糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可包含一个或多个“构象受限的”或双环糖核苷修饰(BSN)，其对含有BSN的寡核苷酸与其互补性microRNA靶链之间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸”。锁定核酸(LNA)含有2’ -O, 4’ -C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块处于“锁定”构象中。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’，4’ -C-桥联的2’脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。参见，例如美国专利N0.6，403，566和Wang等(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol.9:1147-1150,两者均通过全文提述并入本文。在再一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的具有结构C中显示的结构的核苷。靶向miR-145的反义寡核苷酸可含有BSN(LNA、CDNA等)或其它经修饰核苷酸、和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。在一些实施方案中，靶向miR-145的反义寡核苷酸包含LNA和DNA核苷酸的组合。
[0056]
【权利要求】
1.一种在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压(PAH)的方法，包括对所述受试者施用miR-145的抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。
3.权利要求2的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与5’-GUCCAGUUUUCCCAGGMUCCCU-3’或5’ -GGAUUCCUGGMAUACUGUUCU-3’的序列至少部分互补的序列。
4.权利要求2或3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。
5.权利要求4的方法，其中所述至少一个糖修饰是2’-0_烃基修饰或双环糖核苷修饰。
6.权利要求5的方法，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。
7.权利要求2至6中任一项的方法,其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。
8.权利要求7的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
9.权利要求2至8中任一项的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。
10.权利要求9的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂。
12.权利要求11的方法，其中所述抑制剂配制为干粉。
13.权利要求11的方法，其中所述抑制剂配制为液体气雾剂。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者是人。
15.权利要求14的方法，其中所述人在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。
16.一种用于治疗或预防肺动脉高血压的试剂盒，其包含miR-145的抑制剂和施用装置。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述施用装置是吸入器。
18.权利要求16或权利要求17的试剂盒，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含与5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3?或5’ -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3?的序列至少部分互补的序列。
20.权利要求18或权利要求19的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述至少一个糖修饰是2’-0_烃基修饰或双环糖核苷修饰。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。
23.权利要求18至22中任一项的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
25.权利要求18至24中任一项的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。
27.权利要求16至26中任一项的试剂盒，其中所述抑制剂配制为包含在所述施用装置内的粉末。
28.权利要求16至26中任一项的试剂盒，其中所述抑制剂配制为包含在所述施用装置内的液体气雾剂。
29.miR-145的抑制剂，其用于在有此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压(PAH)的方法，所述方法包括对所述受试者施用miR-145的抑制剂。
30.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29的用途，其中所述miR-145的抑制剂是包含与成熟miR-145序列至少部分互补的序列的反义寡核苷酸。
31.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30的用途，其中所述反义寡核苷酸包含与5’ -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’ 或 5’ -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3’ 的序列至少部分互补的序列。
32.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30或31的用途，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个糖修饰。
33.miR-145的抑制剂，其用于权利要求32的用途，其中所述至少一个糖修饰是2’ -O-烃基修饰或双环糖核苷修饰。
34.miR-145的抑制剂，其用于权利要求33的用途，其中所述双环糖核苷修饰是锁定核酸。
35.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30-34任一项的用途，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个主链修饰。
36.miR-145的抑制剂，其用于权利要求35的用途，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
37.miR-145的抑制剂，其用于权利要求30-36任一项的用途，其中所述反义寡核苷酸的长度为约8至约18个核苷酸。
38.miR-145的抑制剂，其用于权利要求37的用途，其中所述反义寡核苷酸的长度为约12至约16个核苷酸。
39.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29-38任一项的用途，其中通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂，或其中适于通过吸入施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂。
40.miR-145的抑制剂，其用于权利要求39的用途，其中所述抑制剂配制为干粉。
41.miR-145的抑制剂，其用于权利要求39的用途，其中所述抑制剂配制为液体气雾剂。
42.miR-145的抑制剂，其用于权利要求29-41任一项的用途，其中所述受试者是人。
43.miR-145的抑制剂，其用于权利要求42的用途，其中所述人在编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中具有突变。
【文档编号】A61K31/712GK103814131SQ201280034183
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年5月9日 优先权日:2011年5月9日
【发明者】A.贝克, M.麦克利恩, N.莫雷尔 申请人:格拉斯哥大学理事会, 剑桥企业有限公司