缺血性疾病治疗药的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于，提供即使全身给药也会特异性地仅聚集在病变部位、具有高蛋白质表达率、在治愈的同时从病变部位消失的基因转运载体以及使用了其的缺血性疾病的治疗方法。通过提供由厌氧性菌形成的基因转运载体、包含该基因转运载体的药物组合物、以及利用了这些基因转运载体的缺血性疾病的治疗方法，从而解决了上述课题，所述厌氧性菌能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少1种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质。
【专利说明】缺血性疾病治疗药
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够特异性地治疗缺血性疾病部位的基因转运载体、药物组合物以及使用了这些基因转运载体的缺血性疾病的治疗方法。
【背景技术】
[0002]近年来，在恶性肿瘤的治疗方法中，使用遗传转化厌氧性菌作为基因转运载体的方法受到瞩目，例如，提出了使用进行了遗传转化的梭状芽胞杆菌，将硝基还原酶的表达基因转运至肿瘤部位的方法等，所述梭状芽胞杆菌是将抗肿瘤物质的前体药物转换成抗肿瘤物质的酶(参照专利文献I~3)。
[0003]但是，出于以往这些目的而使用的微生物均是将病原性的菌变异成低毒性而成的，不能否认其进行回复突变而恢复至原来的病原性菌、从而发挥有害性的可能性，进而由于运动性、侵袭性，因此不仅在疾病组织中、还会在正常组织中表达作用，从而可能产生全身性的副作用症状等，担心安全性方面的问题性。
[0004]因而，作为在人肠道内存在而形成菌群的非病原性肠道细菌、且极其安全的专性厌氧性细菌而已知的双歧杆菌受到瞩目，从而开发了用于表达胞嘧啶脱氨酶的进行了遗传转化的双歧杆菌，所述胞嘧啶脱氨酶是将抗肿瘤物质5-氟尿嘧啶的前体药物即5-氟胞嘧啶转化成5-FU的酶(参照专利文献4、5)。
[0005]该遗传转化双歧杆菌具有如下特长:将其静脉给药至厌氧性疾病的实体肿瘤动物模型时，该遗传转化双歧杆菌会在低氧状态的厌氧性疾病组织中特异性地生长、增殖，并在非厌氧环境下的正常组织中迅速消失(参照非专利文献1、2)。
[0006]另一方面，在缺血性疾病的治疗、尤其是重症缺血的治疗中，尝试了通过推进血管新生、侧支循环，从而恢复血流这样的血管新生疗法。血管新生疗法大致分为细胞移植、蛋白给药以及基因治疗这三种治疗方法，但从低侵袭性的观点出发，近年来尤其是基因治疗受到瞩目。在基于基因治疗的血管新生中，将用于编码例如肝细胞增殖因子(hepatocytegrowthfactor:HGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor:VEGF)等的基因通过肌肉内注射、动脉内注入而导入患部附近，促进患部附近的血管新生，从而使血流恢复(例如参照非专利文献3、4)。
[0007]对于因小动脉程度的损害而无法进行血液循环再建或效果不充分的患者、因侵袭性的问题而无法进行外科治疗的患者等而言，这些血管新生疗法作为选择项之一而受到瞩目，尤其是对基于基因治疗的血管新生疗法，近年来进行了多个临床试验。
[现有技术文献]
专利文献
[0008]专利文献1:美国专利第6416754号说明书 专利文献2:美国专利第6652849号说明书
专利文献3:美国专利申请公开2003/0103952号说明书 专利文献4:日本特开2002-97144号公报专利文献5:国际公开第2007-136107号 非专利文献
[0009]非专利文献1:Yazawaetal., CancerGeneTherapy, Vol.7, N0.2, 2000:pp269-274
非专利文献 2:Yazawaetal., BreastCancerResearchandTreatment, Vol.66, 2001:p
P165-170
非专利文献 3:Guptaetal.，Circ.Res.2009 ； 105:724-736
非专利文献 4:Morishitaetal., ArteriosclerThrombVascBiol.2011 ；31:713-720
【发明内容】
发明要解决的问题
[0010]本发明的目的在于，提供由厌氧性菌形成的基因转运载体、包含该基因转运载体的药物组合物、以及利用了这些基因转运载体的缺血性疾病的治疗方法，所述厌氧性菌能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质。
用于解决问题的方案
[0011]如上所述，利用 了基因治疗的血管新生疗法对缺血性疾病的治疗是有用的，但利用了现有基因治疗的血管新生疗法依然存在几个问题点。第一，现在使用的基因转运载体没有病变部位特异性，在全身给药时会全身播散，因此导入基因的给药主要使用肌肉内注射或动脉内注入，但这些给药方法不能说是对缺血疾病部位特异性给药且对疾病部位均匀地给药，进而在缺血部位和非缺血部位混合存在的情况下，由于向非缺血部位大量传送导入基因、促进非缺血部位的血管新生，因此，结果可能产生缺血部位的血液循环进一步恶化之类的、被称为盗血现象的现象。
[0012]第二，该治疗方法的前提是:利用载体进行基因导入，从而使目标蛋白质在疾病部位进行表达，因此可列举出难以控制基因导入效率、导入基因的表达时间。因此，存在如下问题:即使给药也不会充分地导入从而不发挥效果、导入基因的表达在疾病缓解前消失、缓解后导入基因也会继续表达。
[0013]第三，可以认为，对于老年人、糖尿病患者等而言，血管新生疗法因其低侵袭性而比其它治疗方法具有较大优势，对于这些患者而言，例如糖尿病患者具有糖尿病性视网膜病、老年人具有恶性肿瘤等会因血管新生而导致症状恶化的并发症，因此疾病部位特异性低的现有血管新生疗法的适用存在限制。
[0014]本发明人等想到:通过即使全身给药也会特异性地仅聚集在病变部位、具有高蛋白质表达率、在治愈的同时从病变部位消失的载体，可全部解决这些问题，从而重复进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
(I) 一种基因转运载体，其是由能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的厌氧性菌形成的。
[0015](2)根据(I)的基因转运载体，其中，厌氧性菌是用遗传转化用质粒进行遗传转化而成的，该质粒包含用于编码对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的DNA序列。
(3)根据⑴或(2)的基因转运载体，其中，缺血性疾病为慢性缺血性疾病。(4)根据(I)~(3)的基因转运载体，其中，厌氧性菌是非病原性的肠道细菌。
(5)根据(I)~(4)的基因转运载体，其中，厌氧性菌是双歧杆菌。
[0016](6)根据(5)的基因转运载体，其中，双歧杆菌是选自由青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、高卢双歧杆菌、鸡双歧杆菌、球双歧杆菌、蜜蜂双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、殊形双歧杆菌、乳双歧杆菌、Bifidobacterium lactentis、自由双歧杆菌、长双歧杆菌、大双歧杆菌、反会动物双歧杆菌、最小双歧杆菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒双歧杆菌、假链状双歧杆菌、伪长双歧杆菌、嗜冷双岐杆菌、雏 双歧杆菌、栖瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、世纪双歧杆菌、Bifidobacteriumscardov1、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌、以及嗜热双歧杆菌组成的组中的I种。
[0017](7)根据(6)的基因转运载体，其中，双歧杆菌为长双歧杆菌。
(8)根据(I)~(7)的基因转运载体，其中，对缺血性疾病的诊断是有用的蛋白质为荧光蛋白质。
(9)根据(I)~(7)的基因转运载体，其中，对缺血性疾病的治疗是有用的蛋白质为选自由成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)血管生长因子(AGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、转化生长因子β (TGFii)、血管生成素、肝配蛋白等具有血管新生促进活性的蛋白质；前列腺素类等与血管扩张有关的因子；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3等神经营养蛋白；胰岛素样生长因子(IGF)组成的组中的一种。
[0018](10)根据⑵~(9)的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒为非穿梭质粒。
(11)根据(2)~(10)的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒还包含用于编码分泌信号妝的基因序列。
(12)根据(2)~(11)的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒包含pTB6r印单元。
(13)根据(2)~(12)的基因转运载体，其中，遗传转化质粒具有表达盒，所述表达盒包含用于编码P37启动子、HU终止子、以及FGF2的基因。
(14)根据(2)~(13)的基因转运载体，其中，遗传转化质粒包含用于编码具有序列号40中记载的序列的多肽的DNA序列。
(15)根据(2)~(14)的基因转运载体，其中，遗传转化质粒为pFGF12a(序列号38)。
(16)一种缺血性疾病用药物组合物，其包含(I)~(15)的基因转运载体。
(17)根据(16)的药物组合物，其通过全身给药进行给药。
(18)—种诊断或处置缺血性疾病的方法，其包括给药厌氧性菌，所述厌氧性菌能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质。
(19)根据(18)的方法，其中，给药为全身给药。
发明的效果
[0019]本发明的基因转运载体是厌氧性菌，因此在处于厌氧环境下的缺血性疾病部位特异性地生长、增殖，在该疾病组织中，能够产生、分泌具有缺血性疾病的治疗活性的蛋白质，作为缺血性疾病治疗剂是极其有用的，能够期待其作为高品质的基因转运载体。另外，由于其在缺血性疾病部位特异性地生长，因此即使静脉注射等全身给药也会特异性地聚集在缺血性疾病部位，从而发挥效果。因此，不需要大量给药、多次给药，能够减轻给药对象的负担。进而，在持续缺血的期间，缺血性疾病部位的厌氧环境得以维持，因此会长期生长，一旦缺血得到缓解而不再是厌氧环境时，就无法生长并迅速消失。
[0020]进而，本发明的基因转运载体由于基因转运载体本身就能够表达对治疗有用的蛋白质，因此不需要像以往那样考虑向缺血性部位或其附近的细胞导入基因的效率，能够一直发挥高蛋白质表达效率。进而，由于其是特异性地向缺血性部位转运的载体，因此并发症的危险性也小。因此，能够实施与以往相比进一步低侵袭性且副作用也少、安全性高的血管新生治疗。进而，通过使本发明的基因转运载体同时表达标记物，还能够用于缺血性部位的诊断、处置的监控。进而，本发明的基因载体能够同时转运多个基因，可以认为通过组入给药多个有效的增殖因子，能够进行更有效且非侵袭的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是表示a)下肢缺血模型小鼠(ischemicmodel)的基于激光多普勒血流量计的测量图像和b)血流量比(患肢/健康肢)的变化的图表。
图2是在ischemicmodel中对给药本发明的B.1ongum菌的组和未给药本发明的B.1ongum菌的组的血流量比的变化的图表。在给药组与非给药组中未观察到血流量变化的明显差异。
图3是检测从ischemicmodel局部给药组的患肢和健康肢所采取的样品中存在的本发明的B.1ongum菌的照片。对患肢给药后即使经过168小时也观察到大量菌，与此相对，在健康肢中基本上观察不到菌。
图4中分别用图表表示ischemicmodel局部给药组的给药后经过168小时时的患肢和健康肢的菌数。
[0022] 图5中用图表表示ischemicmodel全身给药组的健康肢的经过规定时间时的B.1ongum菌的菌数变化示于图表。即使在全身给药组中，经过48小时时也基本观察不到菌，经过72小时时未观察到菌。
图6中用图表表示ischemicmodel全身给药组的患肢的、相对于经过时间的血流比变化和菌数变化。随着给药后时间的经过，菌数增加，随着血流向缺血部位的恢复，可观察到菌数减少的样子。
图7是ischemicmodel全身给药组的、给药后经过4日时的肌肉组织的革兰氏染色像。健康肢中未观察到革兰氏染色菌，与此相对，患肢中观察到多个革兰氏染色菌。
图8是表示下肢缺血模型小鼠(ischemicmodel)和下肢坏死模型小鼠(necroticmodel)的患肢/健康肢血流比的时间变化的图表。可知:necrotic model的缺血状态持续时间更长、恢复程度也低。
[0023]图9中用图表表示necroticmodel全身给药组的患肢的、相对于经过时间的血流比变化和菌数变化。随着给药后时间的经过，菌数增加，在缺血状态持续的期间，B.1ongum菌生长/增殖，随着血流向缺血部位的恢复，可观察到菌数减少的样子。
图10是对necroticmodel全身给药组的患肢的、B.1ongum菌数相对于患肢/健康肢血流比进行标绘的图。表示随着血流比的增加、菌数减少的样子。
图11是表示ischemicmodel全身给药组的患肢、肺、肾脏、肝脏、脾脏以及心脏中的B.1ongum菌检测试验的结果的照片。上部左上为缺血肢、上部中间为肺、上部右侧为肾脏、下部左为肝脏、下部中间为脾脏、下部右为心脏的检测结果。即使是全身给药，在除了缺血性疾病部位即患肢以外的脏器中也未观察到所给药的B.1ongum菌。
图12是表示necroticmodel全身给药组的患肢、血液、肾脏、肝脏、脾脏以及心脏中的、各经过时间的B.1ongum菌数的图表。可知刚给药后观测到少量菌，但其后迅速消失。从血液中未检测出菌。
[0024]图13是表示心肌梗塞模型的结扎部位和菌的给药部位的模式图。
图14是表示心肌梗塞模型小型猪的心脏的染色像的图。a)为TTC染色像，梗塞部位(图中箭头所示的部分)未被染色，表示为梗塞部位。b)、c)分别表示正常心肌部位和梗塞部位的MT染色像、HE染色像。各染色像均可观察到梗塞部位中的心肌细胞的脱落和纤维化的推进。
图15是表示心肌梗塞模型中的B.1ongum菌给药后经过4日和7日时的、梗塞部位和健康部位的B.1ongum 菌数的图表。经过4日时，即使在健康部位也观察到微量菌，但经过7日时，仅在梗塞部位观察到菌。
[0025]图16是表示对本发明的基因转运载体进行遗传转化的遗传转化质粒的一个方式即pFGF12a构筑的方案的图。
图17表示使用了用pFGF12a进行遗传转化的长双歧杆菌105A的培养上清的Western印迹的结果。作为阴性对照而使用了用pBEshuttle进行遗传转化的长双歧杆菌105A,作为阳性对照而使用了 hFGF2。在20kDa附近确认到带，可以认为这是hFGF2。
图18表示使用了用pFGF12a进行遗传转化的短双歧杆菌JCM1192的培养上清的Western印迹的结果。作为阴性对照而使用了用pBEshuttle进行遗传转化的短双歧杆菌JCM1192，作为阳性对照而使用了 hFGF2。果然在20kDa附近确认到带，可以认为这是hFGF2。
[0026]图19是向下肢缺血模型的小鼠静脉注射包含本发明的基因转运载体即长双歧杆菌105A/pFGF12a的药物组合物，并观察下肢缺血部位的血流变化的图表。在第3日血流恢复已经产生微小差异，在第6日以后，给药了本发明的基因转运载体的组的血流明显恢复。
图20是向下肢缺血模型的小鼠静脉注射包含本发明的基因转运载体即短双歧杆菌JCM1192/pFGF12a的药物组合物，并观察下肢缺血部位的血流变化的图表。在第4日血流恢复已经产生微小差异，在第8日以后，给药了本发明的基因转运载体的组的血流明显恢复。
【具体实施方式】
[0027]本发明涉及一种基因转运载体，其是由能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的厌氧性菌形成的。
[0028]在本发明中，“缺血”是指由于血管的狭窄、阻塞，供给至组织的动脉血量减少从而导致组织缺乏氧/营养的状态，持续的缺血会产生组织的萎缩、变性、坏死等。
本发明的基因转运载体主要在血管新生治疗、脏器的保护等用于改善由缺血引起的不优选状态的处置方法中使用。因此，在本说明书中，“缺血性疾病”是指无论有无自觉症状，由于动脉的狭窄、阻塞而导致的组织持续缺血的状态或者由所述缺血引起的不优选状态。作为缺血性疾病，不限定于此，例如可列举出心绞痛、心肌梗塞等缺血性心疾病；脑梗塞等脑缺血；烟雾病等慢性脑缺血；脊髄缺血、缺血性大肠炎、肠系膜动脉阻塞症等缺血性肠疾病；阻塞性动脉硬化症等下肢缺血；糖尿病视网膜症等视网膜缺血等。
[0029]在本说明书中，“缺血性部位”是指因缺血而导致动脉血量、营养以及氧减少的状态的部位，“缺血性疾病部位”或”缺血性疾病组织”可互换使用。
在本说明书中，“厌氧性菌”是指具有厌氧性质的细菌，“厌氧性质”是指能够在氧少或无氧条件下生长的性质。一 般来说，厌氧性菌可分类为:即使在氧存在下也能够生长的兼性厌氧性菌、以及在氧存在下无法生长的专性厌氧性菌，在本发明中，优选为专性厌氧性菌。本发明的厌氧性菌所具有的厌氧性质可以是细菌生来具有的性质，也可以是通过遗传转化得到的性质。
[0030]本发明的基因转运载体由厌氧性菌形成，因此能够在处于厌氧条件下的缺血性疾病部位特异性地生长、增殖。于是，基因转运载体本身具有基因的转录、翻译功能，因此在生长于缺血性疾病组织的时刻能够表达对诊断或治疗有用的蛋白质，并供给于该疾病组织。因此，本发明的基因转运载体包含用于编码对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的DNA序列。
[0031]在本发明的一个方式中，基因转运载体用遗传转化用质粒进行了遗传转化。作为遗传转化用质粒，只要在基因转运载体的菌中发挥作用、且无损该菌的厌氧性质，则可以使用任意的质粒。
如上所述，本发明的基因转运载体即厌氧性菌所具有的厌氧性质可以是通过遗传转化而得到的，因此，在本发明的一个方式中，厌氧性菌以成为专性厌氧性菌的方式进行了遗传转化。
[0032]在本发明的优选方式中，基因转运载体通过具有用于编码对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的DNA序列的质粒而进行了遗传转化。通过遗传转化来赋予表达对缺血性疾病的诊断或治疗有用的蛋白质的能力，从而根据质粒的设计可表达任意的蛋白质。
[0033]在本发明中，缺血性疾病包括:由于因缺血导致的氧浓度的急剧降低，对组织造成损伤的急性缺血性疾病；以及由于长时间持续的氧浓度降低，从而引起组织变性、坏死等的慢性缺血性疾病。本发明的基因转运载体在给药后会选择性地转运至疾病部位并生长，停留在转运部位而发挥效果，因此优选用于改善慢性的缺血状态。在本说明书中，“慢性的缺血状态”可与“慢性缺血性疾病”互换使用，但不限定于此，例如可列举出心绞痛、心肌梗塞等缺血性心疾病；烟雾病等慢性脑缺血；阻塞性动脉硬化症等下肢缺血等。作为慢性缺血性疾病的改善处置，不限定于此，例如可列举出血管新生疗法等。
[0034]本发明的基因转运载体以体内给药作为前提，因此所使用的厌氧性菌需要不具有毒性或者毒性低。因此，在本发明的一个方式中，基因转运载体可以是将病原性的菌变异成低毒性而成的。然而，变异成低毒性的细菌有可能进行回复突变而恢复至原本的病原性菌，从而发挥有害性，因此优选为天生的非病原性细菌。因此，在本发明的优选方式中，厌氧性菌使用非病原性的肠道细菌。
[0035]作为本发明中能够使用的非病原性肠道细菌，可优选列举出双歧杆菌属菌(双歧杆菌)。作为双歧杆菌属细菌，例如可列举出青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、高卢双歧杆菌、鸡双歧杆菌、球双歧杆菌、蜜蜂双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、殊形双歧杆菌、乳双歧杆菌、Bifidobacteriumlactentis、自由双歧杆菌、长双歧杆菌、大双歧杆菌、反会动物双歧杆菌、最小双歧杆菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒双歧杆菌、假链状双歧杆菌、伪长双歧杆菌、嗜冷双岐杆菌、雏双歧杆菌、栖瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、世纪双歧杆菌、Bifidobacteriumscardov1、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等，最优选为长双歧杆菌。
[0036]这些菌均已经市售或者能够容易地从保藏机构获取。例如，长双歧杆菌ATCC-15707、两歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等可容易地从ATCC (TheAmericanTypeCultureCollection,美国典型培养物保藏中心)获取。
[0037]另外，关于各菌的株也没有特别限定，例如，关于长双歧杆菌的株，可列举出长双歧杆菌105-A株、长双歧杆菌aE-194b株、长双歧杆菌bs-601株、长双歧杆菌M101-2株，其中，优选为长双歧杆菌105-A株。
[0038]关于短双歧杆菌的株，例如可列举出短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-Ι株、短双歧杆菌1-53-8W株，其中，优选为短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS_l株。
[0039]关于婴儿双歧杆菌的株，例如可列举出婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌1-10-5株，其中，优选为婴儿双歧杆菌标准株、婴儿双歧杆菌1-10-5株。
另外，关于 Bifidobacteriumlactentis 的株，例如可列举出 Bifidobacteriumlactentis 标准株(JCM1220)。
[0040]本发明的基因转运载体在缺血性疾病部位特异性地生长，因此通过检测该基因转运载体的存在，能够诊断缺血性疾病部位。基因转运载体的检测例如可以通过标记基因转运载体来简便地进行。从用于疾病诊断这一观点出发，检测优选侵袭性小，优选标记对转运对象的不良影响小。因此，在本发明的优选方式中，基因转运载体表达荧光蛋白质来作为对诊断有用的蛋白质。作为荧光蛋白质，可列举出各种绿色荧光蛋白质(GFP)、红色荧光蛋白质(RFP)等。作为其它优选方式:
[0041]本发明的基因转运载体在缺血性疾病部位特异性地生长，因此在生长部位表达出的蛋白质必然被特异性地转运至缺血性疾病部位。因此，通过使本发明的基因转运载体表达用于治疗缺血性疾病的蛋白质，能够有效地处置缺血性疾病。因此，在本发明的优选方式中，基因转运载体表达对缺血性疾病的治疗有用的蛋白质。
[0042]作为对缺血性疾病的治疗是有用的蛋白质，不限定于此，例如可列举出具有血管新生促进活性的蛋白质、与血管扩张有关的蛋白质等。作为具有血管新生促进活性的蛋白质，不限定于此，例如可列举出成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管生长因子(AGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、转化生长因子β (TGFi3)、血管生成素、肝配蛋白等，作为与血管扩张有关的因子，可列举出前列腺素类等。作为其它对治疗有用的蛋白质，可列举出粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3等神经营养蛋白；胰岛素样生长因子(IGF)等。
[0043] 如上所述，本发明的基因转运载体的遗传转化中能够使用的质粒只要在基因转运载体的菌中发挥作用、且无损该菌的厌氧性质，则可以是任意质粒。然而，在转运对象的体内，遗传转化中使用的质粒可能向例如大肠杆菌等体内的其它细菌中水平转运，此时，质粒在水平转运的其它细菌中被复制，其结果，无法否认质粒所编码的蛋白质在不期望的部位进行表达的危险性。因此，在优选方式中，遗传转化质粒为非穿梭质粒。
[0044]在本说明书中，“穿梭质粒”是指能够在两种以上不同的宿主中复制的质粒，可与“穿梭载体质粒”互换使用。因此，”非穿梭质粒”是指仅能够在一种宿主中复制的质粒。
[0045]本发明的基因转运载体在菌体中产生利用遗传转化质粒所编码的蛋白质，所述蛋白质在菌体外释放而首次起到治疗效果，因此，为了使用通常不会分泌到菌体外的蛋白质来发挥治疗效果，需要将菌杀灭破坏。为了解决该问题，在优选方式中，遗传转化用质粒还包含用于编码分泌信号肽的基因序列。
[0046]在本说明书中，“分泌信号肽”是指具有使在菌体内产生的蛋白质分泌到菌体外的功能、且存在于蛋白质末端的肽序列。作为能够使用的分泌信号肽，不限定于此，例如可列举出青春双歧杆菌的amyB ;短双歧杆菌的Seel、Sec2、Sec3 ;通过序列号I~22中记载的DNA序列所编码的肽等。
[0047]本发明的基因转运载体例如可以如下操作来制作。
例如，按照通常的方法，通过在具有对遗传转化菌和遗传转化菌以外的菌、例如双歧杆菌和大肠杆菌分别起作用的复制起始位点的穿梭质粒中插入至少I种用于编码对期望的缺血性疾病的诊断或治疗有用的蛋白质的基因，能够制作穿梭质粒。
[0048]而且，可以根据期望通过从该穿梭质粒中去除遗传转化菌以外的菌的复制起始位点，从而制作非穿梭质粒。
进而，根据期望，将启动子基因用至少对双歧杆菌起作用的分泌信号及其启动子基因代替，将终止子基因用对前述双歧杆菌起作用的分泌信号肽的终止子基因代替，从而能够制作还包含用于编码分泌信号肽的基因序列的质粒。
[0049]需要说明的是，上述各工序中的操作可以基于基因工学领域的公知方法来进行。 而且，使用上述遗传转化用质粒，按照基因工学领域的公知方法对要进行遗传转化的
任意厌氧性菌进行遗传转化，从而制作。
[0050]本发明还涉及包含上述基因转运载体的缺血性疾病用药物组合物。
本发明的药物组合物在含有本发明的基因转运载体的范围内，就没有特别限定。关于本发明的基因转运载体，可以包含至少I种，也可以包含2种以上。进而，本发明的药物组合物可以与包含本发明的基因转运载体以外的显示缺血性疾病治疗效果的化合物的药物组合物、缺血性疾病治疗剂组合使用。
[0051 ] 另外，本发明的药物组合物在不妨碍本发明的效果的范围内，除了本发明的基因转运载体之外，还可以含有任意的成分。作为这样的任意成分，例如可列举出药理学上可允许的载体、赋形剂、稀释剂等。
本发明的药物组合物的剂型没有特别限定，例如可列举出含有本发明的基因转运载体的 液体制剂或固体制剂。液体制剂可以如下制造:将本发明的基因转运载体的厌氧性菌的培养液提纯，根据需要向其中添加适当的生理盐水或辅助液或医药添加物，并填充到安剖或小瓶等中，从而制造。另外，固体制剂可以如下制造:向液体制剂中添加适当的保护剂，在填充到安剖或小瓶等中后，进行冷冻干燥或L干燥，或者向液剂中添加适当的保护剂再进行冷冻干燥或L干燥，然后将其填充到安剖或小瓶等中，从而制造。
[0052]作为本发明的药物组合物的给药方法，口服给药、非口服给药均可，优选为非口服给药，例如可以进行静脉注射、皮下注射、局部注入、脑室内给药等，最优选为静脉注射、即全身给药。
本发明的药物组合物的基因转运载体的给药量只要是能够在疾病部位生长、且对于表达有效治疗量的活性蛋白质而言充分的量，就没有特别限定，从经济方面的观点和尽可能避免副作用的观点出发，优选的是，在能够获得所需的治疗效果的范围内尽可能少。
[0053]本发明的药物组合物中的基因转运载体的给药量根据疾病程度、患者的体重、年龄、性別进行适当选择，可以按照改善程度进行适当增减。
例如，在使用本 发明的药物组合物时，根据要使用的厌氧性菌的菌自身所显示的疾病治疗活性、要使用的厌氧性菌所产生的具有疾病治疗活性的蛋白质等的种类、以及要使用的厌氧性菌的该活性蛋白质的产生量等进行适当设定。
[0054]具体而言，在例如静脉内给药的情况下，尤其是要求降低由菌块导致的塞栓等风险，因此，优选的是，尽可能将低浓度的注射用制剂分多次进行分注，或者用适当的辅助液稀释后持续注入。例如，在成人的情况下，将本发明的厌氧性菌的菌体以平均Ikg体重为IO6~IO12Cfu的量、I日I次~分多次连续或隔开适当间隔地给药I日~多日。更具体而言，将包含IO4~101(lCfu/mL本发明的双歧杆菌菌体的制剂以每I个成人为I~1000mL的量直接或用适当辅助液稀释后、I日I次~分多次连续给药I日~数日。
[0055]另外，在直接向疾病组织给药的局部给药的情况下，由于要求菌尽可能在疾病组织整体生长、增殖，因此期望将高浓度的注射剂给药至疾病组织的多个场所。例如，在成人的情况下，将本发明的双歧杆菌的菌体以平均Ikg体重为IO6~IO12Cfu的量、I日I次~多次根据需要连续或隔开适当间隔地给药I日~多日。更具体而言，将包含IO4~101(lCfU/mL本发明的双歧杆菌菌体的制剂以每I个成人为I~1000mL的量、I日多次根据需要直接连续给药I日~多日。
[0056]在治疗期间中确认到疾病组织中的菌已经消失的情况下，暂时中断治疗，与上述同样操作来给药菌。
需要说明的是，本发明中的“X与Y组合而成”包括以下任意情况:x与Y为不同形态、X与Y为相同形态(例如含有X和Y的形态)。另外，在X与Y为不同形态的情况下，还包括X、Y均含有其它成分的情况。
[0057]本发明的基因转运载体在缺血性疾病部位特异性地生长、增殖，在非厌氧环境下的正常组织中不会增殖。因此，即使不是瞄准缺血性疾病部位的局部给药，也会向疾病部位特异性地转运基因。因此，从给药的简便性、侵袭性低等观点出发，优选将本发明的药物组合物进行全身给药。
[0058]本发明的一个侧面包含使用上述由厌氧性菌形成的基因转运载体来诊断或处置缺血性疾病的方法。通过使用本发明的基因转运载体，能够进行高效且高安全性的诊断或治疗。
在本发明的方法中，向具有缺血性疾病的对象给药本发明的基因转运载体。作为给药方法，口服给药、非口服给药均可，优选为非口服给药，例如可以进行静脉注射、皮下注射、局部注入、脑室内给药等，最优选为静脉注射、即全身给药。[0059]因此，在本发明的方法的一个优选方式中，全身给药本发明的基因转运载体。本发明的基因转运载体能够将基因特异性地转运至缺血性疾病部位，因此即使在不使用导管、肌肉内注射等而进行静脉注射等全身给药的情况下，也能够在缺血性疾病部位生长、增殖而发挥效果。因此，与现有的治疗方法相比能够进行侵袭性非常低的治疗。
[实施例]
[0060]以下，通过参考例和实施例来更具体地说明本发明，但本发明的技术范围不限定于这些例示。 [0061]例1:小鼠下肢缺血 模型实验
为了验证本发明的基因转运载体向缺血性疾病部位的特异性转运，制作下肢缺血的小鼠模型，给药本发明的基因转运载体并进行了研究。
(I)模型制作
实验动物使用8-9周龄、雄性C57BL/6小鼠(从CharlesRiverLaboratoriesJapan, Inc.获取)，按照以下步骤制作下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠。麻醉是向腹腔内注射3.6%水合氯醒(从NacalaiTesque, Inc.获取)0.3ml。从腹部去除下腿的毛后，将总股动脉至国动脉用7-0丙纶丝进行结扎，切除股动脉。创口内用生理盐水清洗后，将创口用5-0尼龙线进行缝合。
[0062](2)基于激光多普勒血流量计的血流测定
将小鼠麻醉后，使用激光多普勒血流量计(MoorInstruments制)，在(3)的下肢肌肉摘出前进行血流测定。在两侧对下腿部至指间的血流进行定量，用患侧/健康侧比进行表示。血流测定在模型刚制作前、刚制作后、1、2、3、4、5、7、10、14、21、28日后进行。
[0063]将结果示于图1和2。在所述下肢缺血模型中，患肢的血流量为术后健康肢的2成以下，但术后I周时恢复至4成左右，在术后4周时恢复至6成左右(图1)。在(3)中，对给药B.1ongum菌的组和未给药B.1ongum菌的组比较血流变化。已知:在给药组和非给药组中，未观测到术后的血流变化的举动存在显著差异(图2)，B.1ongum菌的存在不影响缺血状态。
[0064](3) B.1ongum菌的给药和检测
将用pBLESlOO质粒进行遗传转化而制成大观霉素耐性菌的B.1ongum菌用MRS培养基(从关东化学株式会社获取)继代培养2次。使用生理盐水将继代培养2次的培养液离心清洗，用生理盐水进行悬浊并使用。作为局部给药模型，在下肢缺血模型刚制作后向缺血肢和健康肢分别以I X 109cfu/ml X0.1ml X 2处的方式肌肉内注射给药上述B.Longum菌。作为全身给药模型，向尾静脉以lX109cfu/ml的浓度给药0.2mlB.1ongum菌。在给药了菌开始1、2、3、4、5、7、10、14日后，分别摘出各给药模型的左右下肢肌肉(各n = 5)。对各组织进行均质化后，涂布在BL板上，在37°C、厌氧条件下培养3日。培养后测定各板的菌落数，求出缺血肢和健康肢的菌数。
[0065]将结果示于图3~图6。在局部给药的情况下，在术后经过24小时的时刻，确认到与健康肢相比患肢中聚集更多的菌。健康肢中，随着之后的时间经过，可观察到菌数的减少，在术后经过168小时的时刻，基本上未观察到菌。与此相对，患肢中，即使在术后经过168小时的蚀刻也观察到大量菌。关于术后经过168小时的时刻的平均Ig肌肉组织的菌数，健康肢为4.8 X IO2个，与此相对，患肢为4.1 X IO6个，可观察到显著差异(P = 0.039、n=3)(图 3 和 4)。
[0066]同样的结果在全身给药的情况下可观察到。即，健康肢中，在术后经过24小时的时刻观察到约0.6 X IO3个的菌，但在术后经过48小时的时刻变成约0.1 X IO3个，在术后经过72小时的时刻未观察到菌。与此相对，患肢中，在术后24小时观察到约3.5 X IO5个的菌，随着时间的经过，该数量增加，在术后经过4日的时刻最大、观察到约2.7X IO6个的菌。其后，随着血流的恢复，菌数减少，在术后10日的时刻未观察到菌(图5和6)。与局部给药的情况相比，可知全身给药时菌的生长花费若干时间，但即使向静脉给药，也会在缺血性疾病部位特异性地生长。菌数在血流比达到最低的第4日显示最高值，其后随着血流比的改善，菌数降低，因此暗示了 B.1ongum菌可能根据缺血的程度而生长。
[0067](4)组织学的分析
与⑶同样地向小鼠给药B.1ongum菌后,在96小时后摘出下肢肌肉。将下肢肌肉浸溃在20%中性缓冲福尔马林中48小时，将组织固定。其后，用石蜡包埋，制成蜡块。将蜡块切成3μm的厚度，承载于载玻片，以44°C风干24小时，制成石蜡组织切片载玻片。在脱石蜡后进行革兰氏染色。革兰氏染色使用了革兰氏染色液neo-B&MWako (和光纯药工业株式会社)。染色后，用光学显微镜进行了观察。
[0068]将结果示于图6。在健康肢中未检出被革兰氏染色的菌，而在患肢中观察到被革兰氏染色的细菌，可确认所给药的B.1ongum菌已经生长。
[0069]例2:小鼠下肢坏死模型实验 (I)模型制作
例I中暗示了随着血流的恢复，B.1ongum菌的生长数量减少,但为了对其进行确认,制作了更重度的缺血状态的模型即下肢坏死模型(necrotic model)小鼠。实验动物使用6_7周龄、雄性 BALB/c 小鼠(从 CharlesRiver LaboratoriesJapan, Inc.获取)。麻醉是向腹腔内注射3.6%水合氯醒(Nacalai Tesque, Inc.)0.3ml。从腹部去除下腿的毛后,将总股动脉至浅股动脉用7-0丙纶丝进行结扎，切除股动脉。创口内用生理盐水清洗后，将创口用5-0尼龙线进行缝合。
[0070](2)基于激光多普勒血流量计的血流测定
与例I同样地测定血流。将结果示于图8。necroticmodel与ischemicmodel相比,可知:血流恢复的时刻慢，最终血流量与健康肢相比也为约30%左右，与血流恢复至约60%左右的ischemicmodel相比，恢复的程度也低至一半左右。
[0071 ] (3) B.1ongum菌的给药和检测
与例I同样地全身给药B.1ongum菌,检查健康肢和患肢肌肉组织。将结果示于图9和10。可知necroticmodel中，与ischemicmodel相比B.1ongum菌在患肢中存在更长时间。而且，与ischemicmodel同样地随着血流的恢复,菌数减少,在血流恢复至某种程度的时刻，无法观察到菌。由以上结果可知，无论在何种程度的期间内，B.1ongum菌均在缺血状态持续时在患肢中生长、增殖，随着血流的恢复(即从缺血状态恢复)，菌数开始减少。因此，B.1ongum菌具有如下性质:其被特异性地转运至处于缺血状态的组织，表达所导入的基因，随着缺血状态的恢复而消失，可期待其在缺血性疾病的诊断和治疗中发挥优异的效果O
[0072]例3:安全件试齡对上述的下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠和下肢坏死模型(necrotic model)小鼠两者进行安全性试验。在给药了菌开始2、3、4、6、7日后，摘出各给药模型的肾脏、肝脏、脾脏、心脏(各η = 3)。另外，除了这些脏器之外，还摘除ischemicmodel的肺、necroticmode I的血液。对各组织进行均质化后,涂布在BL板上,在37°C、厌氧条件下培养3日。培养后测定各板的菌落数，求出各组织的菌数。
[0073]将结果示于图11和12。ischemicmodel中，在全身给药168小时后，在除了患肢以外的任意脏器中均未观察到B.1ongum菌。即使在necroticmodel中，截止至全身给药3日后在全身的各脏器中还会观察到B.1ongum菌，在6日后在除了脾脏以外的脏器未观察到菌。另外，将给药组与非给药组进行比较，未发现下肢溃疡形成率和脓肿形成率存在显著差异，也未从脓肿中明显地分离出B.1ongum菌。由以上的结果可知,B.1ongum菌在健康的脏器中迅速消失，另外也没有缺血状态本身或并发症的恶化等对疾病造成不良影响。
[0074]例4:小型猪心肌梗寒模型试验
作为其它代表性的缺血性疾病，可列举出心肌梗塞等缺血性心疾病，近年来针对缺血性心疾病也尝试了血管新生治疗、尤其是基于基因导入的血管新生治疗。然而，缺血性心疾病的治疗中也可列举出与其它缺血性疾病中的问题点相同的问题点。尤其是在缺血性心疾病中，作为局部给药法，使用了冠动脉导管的动脉注射、使用了冠动脉导管的局部注射、开胸下心肌内注射等侵袭性非常高的方法是必须的，尽管可以认为血管新生疗法特别适合于无法适用经皮冠动脉介 入治疗(PCI)、冠动脉旁路移植术(CABG)等其它治疗方法的对象，但在现在，主要还是与其它治疗方法并用。
[0075]因而，为了确认本发明的基因转运载体在心肌梗塞中也有效地发挥作用，进行以下的实验。
(I)模型制作
实验动物使用雄性哥廷根系小型猪(15kg)(从中外医科学研究所获取)。肌肉注射Ketaral (从三共株式会社获取)15mg/kg和硫酸阿托品(从田边制药株式会社获取)(25mg)后，通过吸入麻醉即FL0-THENE(从武田药品工业株式会社获取)(2%~5% )维持麻醉状态。开胸后，将左冠状动脉前降枝用3-0丝线进行结扎。手术中给药2%利多卡因(从AstraZeneca公司获取)(Iml~2ml)。闭胸前用Lactec (从大冢制药株式会社获取UOOml清洗心包内。
[0076](2)组织学的分析
为了确认心肌梗塞，进行了三苯基四唑化氯(TTC)染色、苏木精/伊红(HE)染色以及三色胶原(MT)染色。关于TTC染色，将在制作心肌梗塞模型7日后摘出的心脏切成5mm的厚度，在I % TTC液(从SIGMA公司获取)中以37°C孵育5分钟。其后，用肉眼观察。
关于苏木精/伊红(HE)染色，在脱石蜡后，用苏木精染色30秒~I分钟，用流水清洗10分钟,然后用0.5%曙红溶液染色30秒。染色后,进行脱水、清除(clearing)以及封入，用光学显微镜进行观察。
[0077]关于三色胶原(MT)染色，在将各切片进行布安固定后，进行10分钟的流水水洗。水洗后，在10%重铬酸钾10%三氯乙酸等量混合液中浸溃10分钟，然后在铁苏木精染色液中浸溃5分钟，进行5分钟的流水水洗。水洗后，在丽春红酸性品红偶氮焰红液中浸溃I分钟后，在2.5%磷钨酸溶液中浸溃10分钟。将切片在2%橙黄G液中浸溃5分钟后，用1%乙酸水溶液进行清洗，用Light Greensolution染色3分钟后,用I %乙酸水溶液进行清洗。脱水、清除、封入用与HE染色同样的过程进行。
[0078]将结果示于图14。在TTC染色中，在左室前壁和心室中隔的前壁发现穿壁性的梗塞部位。另外，用MT和HE染色发现同部位的心肌细胞的脱落和胶原纤维的增生，确认到心肌梗塞已完成。
[0079](3) B.1ongum菌的给药和检测
与例I同样地制备B.1ongum菌,在心肌梗塞模型刚制作后以lX109cfu/ml的浓度每隔Icm地等间隔向健康部位和梗塞部位心肌内给药0.1mlB.1ongum菌(参照图13)。在给药了菌开始4日和7日后(各η = 2)，摘出心脏，分为梗塞部位和健康部位，进行均质化后，涂布在BL板上，在37°C、厌氧条件下培养3日。培养后测定各板的菌落数，求出梗塞部位和健康部位的菌数。
[0080]与例I同样地制备B.1ongum菌，在心肌梗塞模型刚制作后以IX 109cfu/ml的浓度每隔Icm地等间隔向健康部位和梗塞部位心肌内给药0.1mlB.1ongum菌(参照图13)。在给药了菌开始4日和7日后(各η = 2)，摘出心脏，分为梗塞部位和健康部位，进行均质化后，涂布在BL板上，在37°C、厌氧条件下培养3日。培养后测定各板的菌落数，求出梗塞部位和健康部位的菌数。
[0081]例 5:hFGF2 分泌 Bifidobacterium 的构筑
(I)表达质粒载体P37的构筑
以质粒pCDshuttle (国际申请第2009/128272号)作为模型，使用CDvecF3引物(序列号23)和pUCoriR5引物(序列号24)进行PCR，将PCR产物作为载体。将Bifidobacteriumlonguml05A的基因组DNA作为模型,将用Pins37F引物(序列号25)和Pins37R引物(序列号26)进行增幅而成的PCR产物作为插入物。PCR按照常规方法实施。
[0082]使用In-FusionHDCloningKit 和 CloningEnhancer(TAKARABIC), Inc.)连接上述载体和插入物(以下记为in-fusion反应)，使用反应液的一部分,对大肠杆菌TOPlOchemicallycompetentcell (LifeTechnologiesJapanLtd.)进行遗传转化。详细按照制品说明书进行。将遗传转化大肠杆菌涂布在LB (含有75 μ g/mL大观霉素)琼脂培养基上，以37 °C静置培养一晚。
拾取在上述板上充分分离的菌落，用LB (含有75 μ g/mL大观霉素)液体培养基以37°C振荡培养一晚后，使用QIApr印SpinMinipr印Kit (QIAGEN公司)从其中提取质粒DNA。针对该质粒DNA的全长进行序列分析，确认了序列。将完成的质粒名记作p37(序列号39)。
[0083](2)hFGF2表达质粒(非分泌型)的构筑
人FGF2表达(非分泌型)质粒pFGF-P37的构筑概要示于图16。如下所示地制备载体。即，将质粒P37作为模型，使用FGFl引物(序列号27)和FGF7引物(序列号28)进行PCR，对包含P37启动子(序列号29)、Hu终止子、pTB6复制子(双歧杆菌中的质粒复制子)、AAD9cassette (大观霉素耐性基因表达单元)、pUCori部分(大肠杆菌中的质粒复制起点)的约3.Skbp的DNA进行增幅，将其作为载体。对引物进行设计，以使载体的末端15bp与以下示出的插入物末端15bp成为相同序列。DNA的增幅使用PrimeSTARHS (Premix)(TAKARABIO, Inc.)，PCR条件基于该酶的制品说明书。
[0084] 如下那样地制备插入物。即，基于hFGF2 (从GenBankAccessionN0.#NM_002006的AUG开始翻译的约18kDa的蛋白质)的氨基酸序列，对密码子最适合双歧杆菌用的DNA进行人工合成(委托GenScript公司)。此时，对DNA进行设计，以使hFGF2编码蛋白质的C末端融合组氨酸标签(序列号30)。将该合成DNA作为模型，用FGF3引物(序列号31)和FGF4引物(序列号32)与上述同样地进行PCR增幅，将约0.5kbp的DNA增幅产物作为插入物。
[0085]通过In-fusion反应连接上述载体和插入物。详细按照制品说明书进行。将In-fusion反应液用0.1 X TE适当 稀释，使用其中的2 μ L,对大肠杆菌TOPlOchemicalIycompetentcell (LifeTechnologiesJapanLtd.)进行遗传转化。详细按照制品说明书进行。将遗传转化大肠杆菌涂布在LB (含有75 μ g/mL大观霉素)琼脂培养基上，以37 °C静置培养一晚。
[0086]拾取在上述板上充分分离的菌落，用LB (含有75 μ g/mL大观霉素)液体培养基以37°C振荡培养一晚后，使用QIApr印SpinMinipr印Kit (QIAGEN公司)从其中提取质粒DNA。使用质粒DNA的一部分来确认hFGF2表达单元的DNA序列。序列反应使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit (Life TechnologiesJapanLtd.),详细按照制品说明书进行。序列反应液的电泳委托信州大学人环境科学研究支援中心器械分析部门。数据分析使用了Genetyx Ver.10。将完成的质粒名记作pFGF_P37 (序列号33)。
[0087](3)分泌型hFGF2表达质粒的构筑
人FGF2表达(分泌型)质粒pFGF12a的构筑概要示于图16。将上述质粒pFGF_P37作为模型，使用FGF35引物(序列号34)和FGF26引物(序列号35)进行PCR，将约4.2kbp的DNA增幅产物作为载体。
另外，将长双歧杆菌105A株的基因组DNA作为模型，用FGF45引物(序列号36)和FGF17引物(序列号37)进行PCR，将约0.2kbp的DNA增幅产物作为插入物。插入物包含分泌信号，B.breveUCC2003 的 Sec2 (参照 Shkoporov ANet.al., BiotechnolLett (2008) 30:1983-1988)的N末端序列保存良好。载体和插入物的增幅使用PrimeSTARHS(Premix)(TAKARABIO, Inc.)，PCR条件基于该酶的制品说明书。
[0088]如上述的FGF表达质粒(非分泌型)的构筑时同样地用In-fusion反应连接上述载体和插入物，对大肠杆菌TOPlO进行遗传转化，确认质粒的hFGF2表达单元部分的DNA序列，将完成的质粒名记作pFGF12a(序列号38)。hFGF2表达单元部分的构成如下所示。
?P37启动子:序列号38的碱基序号14~275、
?hFGF2编码区域的构成:序列号38的喊基序号276~902 ?信号序列:序列号38的碱基序号276~419
?hFGF2序列:序列号38的喊基序号420~881
?组氨酸标签序列:序列号38的碱基序号882~899 ?结束密码子:序列号38的碱基序号900~902
?Hu终止子:序列号38的喊基序号903~1016
[0089]另外，将该单元所编码的氨基酸序列示作序列号40，进而其构成如下所示。
?hFGF2编码区域的构成:序列号40的氨基酸番号I~208
?信号序列:序列号40的氨基酸番号I~48 (其中,氨基酸番号I~37为推测信号肽区域，氨基酸番号38~48为推测间隔物区域，氨基酸番号37与38之间为推定切断部位)?hFGF2序列:序列号40的氨基酸番号49~202 ?组氨酸标签序列:序列号40的氨基酸番号203~208
[0090](4)重组双歧杆菌的制作
按照 Rossietal., LettersinAppliedMicrobiology (1997) 24:33-36 中记载的方法制作长双歧杆菌105A株和短双歧杆菌JCMl 192株的感受态细胞。即，用PBS缓冲液清洗利用MR培养基培养至对数增殖期初期的上述双歧杆菌后，用KMR缓冲液进行悬浊，用液态氮急速冷冻后作为感受态细胞。将感受态细胞在冰上融解后，混合上述质粒pFGF12a或pBEshuttle(国际公开第2011/093465号中记载的mock载体、无FGF表达)，使用GenePulserII (Bio-Rad Laboratories, Inc.)进行电穿孔。电穿孔使用0.2cm裂缝的比色皿，在2kV、25 μ F、200 Ω的条件进行。将遗传转化后的双歧杆菌涂布在IMR (含有75 μ g/mL大观霉素)琼脂培养基，以37°C进行2日的厌氧培养。拾取在琼脂培养基上形成并充分分離的菌落，取得重组双歧杆菌。
[0091](5)蛋白质表达分析(Western印迹)
作为双歧杆菌培养用培养基，向MRS培养基(oxide) IOmL中添加包含350mg/mL的抗坏血酸和20mg/mL的L-半胱氨酸的维生素C/半胱氨酸溶液200 μ L和75mg/mL大观霉素溶液10 μ Lo对该制备培养基栽种上述重组双歧杆菌B.longuml05A/pFGF12a和B.longuml05A/pBEshuttle,以37°C进行24小时的厌氧培养(活化培养液)。将活化培养液栽种于向上述制备培养基中以达到166mM的方式进一步添加磷酸钠缓冲液而成的培养基，以37°C进行18小时的厌氧培养。
[0092]与上述同样地还实施了短双歧杆菌JCMl 192/pFGF12a和短双歧杆菌JCMl 192/pBEshuttle的培养。其中，未使用MRS培养基，使用了 RCM培养基。未添加维生素C/半胱氨酸溶液。
按照常规方法对上述重组双歧杆菌培养液上清进行三氯乙酸(TCA)沉淀，用I XSDS样品缓冲液进行再溶解。将其以95°C进行3分钟加热处理，供于Western分析。
[0093]使用Min1-PROTEANTGXgel (4 ~20 %、Bio-Rad 公司)，用 I X SDS 缓冲液对上述试样进行电泳。电泳装置使用了 MiniPROTEANTetraSystem(Bio-Rad公司)。使用iBlotGelTransferDevice将电泳后的凝胶转印到iBlotTransfer Stacks。将转印后的膜用TTBS进行约5分、3次的清洗后，用2%封闭液(Block Ace)进行封闭。作为一次抗体，添加 AntiFGF_2humanrabbitpoly (H-131、SantaCruzBiotechno logy Inc.),以 4 °C振荡一晚。在一次抗体反应后，用TTBS将膜清洗约5分，反复清洗6次，添加二次抗体Goatant1-rabbitIgGHRP(Santa CruzBiotechnologyInc.),在室温下振荡 3.5 小时。用TTBS 将膜清洗约 5 分，反复清洗 6 次后，用 ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKit (GEHealthcare制)内的发光试剂使其发光。将其用成像仪(Fluor_SMAX、Bio-Rad公司)进行检测(图17和图18)。
[0094](6)蛋白质表达分析(ELISA)
直至TCA沉淀工序之前用与上述相同的方法制备培养上清，用human FGF2ELISA试剂盒(Quantikine (R) ELISAHumanFGFbasicImmunoassay、R&Dsy stems > 目录编号:DFB50)对hFGF2量进行定量。
关于培养上清中的hFGF2量，B.longuml05A/pFGF12a为33，058pg/mL、阴性对照的B.longuml05A/pBEshuttle 为 Opg/mL。短双歧杆菌 JCM1192/pFGF12a 为 11，429pg/mL、阴性对照的短双歧杆菌JCM1192/pBEshuttle为Opg/mL。
[0095]例6:基于小鼠下肢缺血模型的体内治疗效果验证
为了验证本发明的基因转运载体在缺血性疾病部位的治疗效果，制作下肢缺血的小鼠模型，给药了人FGF2分泌双歧杆菌，进行了研究。
(I)模型制作
实验动物使用6-8周龄、雄性Balb/c小鼠(从CharlesRiverLaboratoriesJapan, Inc.获取)，按照以下步骤制作下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠。麻醉是向腹腔内注射3.6%水合氯醒(从NacalaiTesque, Inc.获取)0.3ml。从腹部去除下腿的毛后，将总股动脉、深股动脉、浅股动脉用8-0丙纶丝结扎，部分切除浅股动脉。创口内用生理盐水清洗后，将创口用5-0尼龙线进行缝合。 [0096](2)基于激光多普勒血流量计的血流测定
将小鼠麻醉后，使用激光多普勒血流量计(MoorInstruments制)，进行血流测定。在两侧对下腿部至指间的血流进行定量，用患侧/健康侧比进行表示。血流测定在模型刚制作后、3~4、6以及8日后进行。
[0097](3)基因重组B.1ongum菌的给药
作为人FGF2分泌双歧杆菌和对照，将非分泌双歧杆菌用MRS培养基(从关东化学株式会社获取)继代培养2次。使用生理盐水将继代培养2次的培养液进行离心清洗，用生理盐水进行悬浊并使用。在模型制作翌日，向眼窝静脉丛以lX109cfu/ml的浓度给药0.2ml菌，如上述(2)那样测定下肢血流。
[0098]将结果示于图19和20。图19示出人FGF2分泌B.1ongum菌的血流改善效果，图20示出人FGF2分泌B.breve菌的血流改善效果。在人FGF2分泌B.1ongum菌中，第6日以后与PBS相比显示显著的血流改善效果。(longumFGF12avsPBS ;在第6日，0.41±0.Ilvs0.14±0.02 ;在第 8 日，0.55±0.Ilvs0.32±0.08)。另外，人 FGF2分泌B.breve菌在第8日显示显著的血流改善效果。(breveFGF12avsbreve对照、0.67±0.1lvs0.38±0.02)。需要说明的是，在任意组中，FGF非分泌菌给药组(对照)与PBS给药组之间均未发现显著差异。
产业上的可利用性
[0099]通过本发明的基因转运载体，能够提供在缺血性疾病部位特异性地生长、增殖，随着疾病状态的改善而消失的基因转运载体。因此，与以往的方法相比，能够低侵袭且简便地进行血管新生疗法。另外，由于基因转运载体本身由细菌形成，因此基因向目标部位导入的效率等不会成为问题，与以往相比能够进行效率非常高的处置。由此，对于老年人等、本来血管新生疗法是有效的但由于侵袭性高或全身性副作用成为障害从而无法处置的对象等而言也能够有效地处置。
【权利要求】
1.一种基因转运载体，其是由能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的厌氧性菌形成的。
2.根据权利要求1所述的基因转运载体，其中，厌氧性菌是用遗传转化用质粒进行遗传转化而成的，该质粒包含用于编码对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因转运载体，其中，缺血性疾病为慢性缺血性疾病。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的基因转运载体，其中，厌氧性菌是非病原性的肠道细菌。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的基因转运载体，其中，厌氧性菌为双歧杆菌。
6.根据权利要求5所述的基因转运载体，其中，双歧杆菌是选自由青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、高卢双歧杆菌、鸡双歧杆菌、球双歧杆菌、蜜蜂双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、殊形双歧杆菌、乳双歧杆菌、Bifidobacteriumlactentis、自由双歧杆菌、长双歧杆菌、大双歧杆菌、反会动物双歧杆菌、最小双歧杆菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒双歧杆菌、假链状双歧杆菌、伪长双歧杆菌、嗜冷双岐杆菌、雏双歧杆菌、栖瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、世纪双歧杆菌、Bifidobacteriumscardov1、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌、以及嗜热双歧杆菌组成的组中的I种。
7.根据权利要求6所述的基因转运载体，其中，双歧杆菌为长双歧杆菌。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的基因转运载体，其中，对缺血性疾病的诊断是有用的蛋白质为突光蛋白质。
9.根据权利要求1~7中任一项所述的基因转运载体，其中，对缺血性疾病的治疗是有用的蛋白质为选自由成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)血管生长因子(AGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、转化生长因子β (TGFi3)、血管生成素、肝配蛋白等具有血管新生促进活性的蛋白质；前列腺素类等与血管扩张有关的因子；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3等神经营养蛋白；胰岛素样生长因子(IGF)组成的组中的一种。
10.根据权利要求2~9中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒为非穿梭质粒。
11.根据权利要求2~10中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒还包含用于编码分泌信号肽的基因序列。
12.根据权利要求2~11中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化用质粒包含pTB6rep 单兀。
13.根据权利要求2~12中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化质粒具有表达盒，所述表达盒包含用于编码P37启动子、HU终止子以及FGF2的基因。
14.根据权利要求2~13中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化质粒包含用于编码具有序列号40中记载的序列的多肽的DNA序列。
15.根据权利要求2~14中任一项所述的基因转运载体，其中，遗传转化质粒为pFGF12a(序列号 38)。
16.一种缺血性疾病用药物组合物，其包含权利要求1~15中任一项所述的基因转运载体。
17.根据权利要求16所述的缺血性疾病用药物组合物，其通过全身给药进行给药。
18.—种诊断或处置缺血性疾病的方法，其包括给药厌氧性菌，所述厌氧性菌能够在缺血性疾病部位特异性地生长、且能够表达至少I种对缺血性疾病的诊断或治疗是有用的蛋白质。
19.根据权利要 求18所述的方法，其中，给药为全身给药。
【文档编号】A61P9/10GK103958680SQ201280034792
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】和田有子, 嶋谷裕子, 清水瞳, 佐佐木贵之 申请人:阿内罗药物科学株式会社