病毒试剂的递送的制作方法

病毒试剂的递送的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种附着有噬菌体的植物材料，其中该噬菌体保持着感染性。该植物材料包括水果、蔬菜、叶、茎、花、根、块茎、幼苗和种子。可以治疗植物病害和动物疾病。一单独的组合物包含载体以及共价附着其上的噬菌体，载体选自（i）细丝，（ii）平面材料和（iii）颗粒和/或小珠，其中，所述噬菌体保持着感染性，对深部伤口中的治疗或预防细菌感染是有用的。
【专利说明】病毒试剂的递送
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以可持续的有活力状态和不同的方式来递送病毒试剂(如噬菌体或其他病毒)的方法，所述方式适合用于防止和控制微生物感染、定殖和/或污染。还提供了一个作为一种方法的系统，其将适于递送特定基因/蛋白的经遗传修饰的有活力的病毒进行定位和递送，以用于治疗或免疫。本发明可用于抵抗微生物/细菌在几乎任何情况的生长和/或定殖，所述情况中存在或可能发生微生物/细菌的污染、定殖或感染，以及在所述情况处，保持病毒如噬菌体的抗菌活性是有利的。
【背景技术】
[0002]如今，普遍接受的是微生物/细菌的污染或感染(infection)是影响许多生物系统和过程中正常生物/生理功能(例如，愈合或生长)和分解速度的主要原因。在伤口愈合过程中，防止伤口感染是伤口护理和修复的至关重要方面。因为所有的伤口都容易受到感染，伤口护理最好的实践是争取将此纳入考虑。通常，清洗伤口来清除可能藏匿有细菌的外来碎屑，而当组织遭受严重创伤时，常常是通过缝合来帮助组织的修复。在重大的外科手术，如髋关节置换中，这涉及多个组织层的修复，随后通常可用一种无菌的伤口敷料。无菌的伤口敷料通常是用在皮肤表面，用来帮助清洁和防止感染的。
[0003]尽管有这些预防措施，但是在受伤过程中，或非故意地，在不同医疗程序/外科手术中通过材料的入口可形成感染。而且，伤口感染的问题并不限于深部伤口。尤其对于老年人、糖尿病患者或体弱者，感染可能从相对轻微的损伤转变成慢性伤口，逐渐引起重大的健康问题。
[0004]除了伤口清洁以外，已有采用多种不同方法来尝试防止深层伤口感染的建立。通常，整体或局部地施用抗生素，或使用强烈的化学消毒药品(例如，在牙重建中)来尝试处理深部伤口，使其摆脱感染细菌。令人遗憾的是，即使采用强烈的抗菌化学药品也经常不能成功防止感染的建立或复发。这在很大程度上是由于消毒试剂不能完全消灭所有的问题细菌。此外，众所周知的是，现在许多的细菌对抗生素是有抗性的，并且抗生素的效力随时间推移而被削弱。
[0005]因此，需要更有效的方法来抵抗细菌的感染和污染。一种方法是涉及使用噬菌体(攻击并消灭细菌的病毒)，并且许多团体已经报道过他们成功的应用例子。与采用噬菌体作为抵抗感染方法相关的核心问题是获得合适的递送方法，同时要确保噬菌体保持足够长时间的稳定和有活力，以发挥出它们强大的抗菌效果。
[0006]在许多情况下，液体形式使用时是不现实或不实用的。需要一种递送的方法，其大体上适用于噬菌体充当杀菌剂的应用，并且其在许多情况下，包括伤口护理中具有实用性。由于噬菌体容易退化和脱水，因此理想地，这种方法也应该赋予增强的活力(viability)和稳定性。
[0007]许多传统敷料采用一种旨在吸收伤口中过量液体的材料；因为这种液体通常富有营养并且能支持大量细菌的生长。由于外科手术口或皮肤表面是很少完全没有细菌的，所以敷料或绷带材料很快就提供了生长的细菌群体。细菌不仅能造成严重的感染，还会释放有害的毒素引起在伤口处理方面的明显问题。一种解决方式是为了防止细菌积聚，定期地更换伤口敷料或绷带，但这并不总是令人满意的和/或可行的。
[0008]另一种方式是采用一种旨在限制微生物生长的试剂来处理敷料。然而，很多这类试剂一旦接触到伤口渗出液就会从敷料中滤出，因此限制了敷料的效力，并且活性试剂确实会造成刺激或破坏周围组织的问题。
[0009]因此，有需要提供抗菌敷料，其中的抗菌试剂不会容易地从敷料中释放，或者其中试剂的释放不会对处理的对象造成伤害。
[0010]W003/093462公开了一种用于将病毒，如卩遼菌体固定到一基质的方法，从而使病毒仍然保持感染性。
[0011]本发明的一个目的是为了提供一种将噬菌体引入到被污染区域和环境中的方法，使得噬菌体的稳定性增强，并保留它们的抗菌活性。这包括被感染的伤口，范围从表面损伤到深部伤口环境。
[0012]植物细菌感染能分别导致发芽率、生长和/或产量的降低。人们希望处理或防止那些感染，但是目前使用的方法冒着对另一影响植物生长的因子产生不利影响的风险。
[0013]本发明的另一个目的是为了对付植物的细菌感染，并根据本发明提供经过处理的植物材料及其用途。

【发明内容】

[0014]在本发明的第一个方面中，公开了一种将活病毒如噬菌体提供到期望的位置或其中，例如伤口或伤口中的器械，所述器械定义为一活病毒载体复合物(LVCC)，其包含附着(attach)在载体基质上的活病毒。当有利地，在所述病毒的生物作用能传递治疗或其他抗菌益处的情况中，可以使用这种LVCC。这通常需要病毒保持它们的生物学特性，而在噬菌体的例子中，需要保持它们能靶定、感染和破坏细菌细胞的能力。所述病毒可以是靶定造成伤口感染的细菌的噬菌体。在本发明中，它们附着在载体基质材料的表面，使得它们的生物学特性在感染的或污染的环境中能保持。
[0015]所述载体表面可由例如，细丝状材料、平面(片状)材料(例如是条料(strip))提供，或者由颗粒和/或小珠的表面提供，并且足以使病毒附着和固定，从而保持病毒的活力。
[0016]可单独或组合地将LVCC提供到深部伤口中或另一相关的部位，从而使附着的活病毒的有利特性如所需那样被提供和递送。载体/基质可以是任意材料，病毒能固定在其上面，同时维持活力和保持抗菌特性，以适于用作LVCC。
[0017]本发明的一种组合物包含载体以及共价附着其上的噬菌体，所述载体选自(i)细丝，(ii)平面材料和(iii)颗粒和/或小珠，其中，所述噬菌体保持着感染性。
[0018]合适地，所述载体是可生物降解和/或生物兼容的。其分别可以是组织兼容的和能原地被吸收的。
[0019]所述组合物的一个用途是治疗或防止深部伤口中的细菌感染,深部伤口意味着伤口不是在身体的暴露面上。深部伤口可以是内部的伤口，包括体表上手术缝合线缝合的内部损伤。一般地，本发明的组合物是置于深部伤口中，然后被封闭起来。因此，本发明的细丝可置于深部伤口，并留在其中。以下本发明的一实施例中更详细地描述，与对照相比，将噬菌体附着的细丝置于深部伤口中获得一愈合很好的伤口。
[0020]有利地，所述组合物的材料是可生物降解和/或生物兼容的材料，或者是由组织兼容性的并能在原位被吸收的聚合物或其他材料制成。降解随时间推移而发生，使得附着的病毒(例如，噬菌体)的抗菌作用或其他相关特性大体上不会受到影响。
[0021]本发明的一实施例中，LVCC附在不同的外科移植体上，如假体、支架、导管、用于手术修复的假膜(membrane)或支架材料，或用于再生目的用作支架或框架的材料、缝合锚、缝合线和其他伤口闭合器械(例如，粘合带或缝合钉(staples))、分流器、导管、留置套管、管(tube)以及类似的器械及其元件等。它们可附在表面上或纳入到支架或支撑材料中，这些材料单独地或组合地含有多种不可生物降解的聚合物、可生物降解的聚合物、胶原蛋白、角蛋白、纤维素、棉、丝和其他类似的基质(参见下面)。
[0022]本发明描述LVCC的构建，其通过将病毒固定到载体基质材料的表面，从而保持及延长在有害环境中的活力和生物学特性(对于噬菌体，这包括它们的杀菌特性)，有害环境将迅速使游离病毒(fee virus)变性(denature)。以下列出可单独或组合或作为混合物或作为共聚合物(co polymers)来使用并适于在LVCC中用作载体基质的材料的例子。
[0023]合适的聚合物种类包括生物聚合物、导电聚合物、共聚物、含氟聚合物、多萜、酚醛树脂、聚酸酐、聚酯、聚烯烃(聚烯属烃)、橡胶、硅树脂、硅橡胶、超吸水性聚合物、合成橡胶、乙烯基聚合物、核酸、多肽、糖、聚乳酸(PLA)、聚3-羟基丁酸、无机聚合物、同素聚合物(homo-atomic polymers)、聚硅烷、聚错烧(polygermanes);聚锡烧(poIystannanes)、杂原子聚合物(hetero-atomic po lymers)、聚三硼三胺(polyborazylenes)、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基氢硅氧烷(PMHS)和聚二苯基硅氧烷；聚硅氨烷如全氢聚硅氮烷PHPS、聚膦腈、聚氮化硫、聚硫化物、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、常见的塑料、聚丙烯、聚酯(PES)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC) (Saran)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、高抗冲聚苯乙烯(HIPS)、聚酰胺(PA) (Nylons)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚碳酸酯(PC)、聚碳酸酯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(PC/ABS)、聚氨酯(PU)、专用的塑料、单体和聚合物(包括可生物降解的/可重吸收的材料)、乙烯甲基丙烯酸酯、三聚氰胺甲醛(MF)、可塑性淀粉材料、酚醛塑料(PF)或(苯酚甲醛)、聚已酸内酯(PCL)、聚对二氧环己酮(PD0或H)S)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酰亚胺(PEI) (Ultem)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚乳酸(PLA)的D和L型立体异构体、聚乳酸、聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三亚甲基碳酸酯(TMC)、聚碳酸酯、聚酸酐、聚(酰亚胺酸酐)(poly-(imide anhydrides))和聚正酯。
[0024]其他材料包括脲醛(UF)、磷酸三钙(TCP)、自然材料、木、陶瓷、岩石、粗砂和石头；角和角蛋白；骨头；皮；纸；丝；棉；大麻；玻璃、含铁和不含铁的金属和金属合金。
[0025]能使用的专门材料包括处理过的纤维素，如纤维或织布(羧甲基化的)、胶原蛋白、透明质酸、水解胶体、水凝胶、薄膜、泡沫、藻酸盐、乙基甲基丙烯酸酯、专门的玻璃(可生物降解的和不可生物降解的)、专门的尼龙、多糖。
[0026]本发明的另一个实施例中，病毒(例如，曬菌体)可直接固定到包含所述器械的材料的表面。本质上，形成所述器械的材料成为LVCC载体材料。例如，将噬菌体固定在外科手术缝合线上，同时就提供了一具有双重用途的LVCC，能封闭伤口，同时能递送有效的抗菌能力。手术缝合线可以是多种类型的，包括可生物降解的聚合物。
[0027]本发明的又一个实施例中，LVCC (作为细丝或条料，噬菌体已单独地或组合地附于其上)可被添加到伤口敷料和/或在其下面，或与有特定优势的其他类型敷料或器械结合使用，但是，作为同时使用LVCC的结果，那会获得增强的抗菌功能。
[0028]本发明的进一步实施例涉及将LVCC纳入作为伤口敷料的一部分。这可以是单独的(LVCC)组分，该组分被设计成敷料的一整体部分，或与其不同，被引入敷料中和/或敷料下面，以提供抗菌功能。或者，所述载体材料可以是敷料的一部分。可以采用不同的方式来设计LVCC或载体材料，如下所描述的，但其不解释为限制。
[0029]本发明的一特别的伤口敷料包含多种细丝，噬菌体附着其上，其中存在至少第一细丝和第二细丝，第一噬菌体附着于第一细丝，并且第二噬菌体附着于第二细丝，以及其中所述第一和第二噬菌体感染不同株或种的细菌。
[0030]所述第一和第二细丝可以是不同的颜色。这为敷料提供了颜色编码。因此，在使用中，通过给予的敷料，颜色可以用来识别可治疗或可防止的疾病，所述颜色始终地显示由附在细丝或敷料的部分上的噬菌体展示的细菌特异性。在一具体实施例中，一种颜色的细丝具有感染附着的金黄色葡萄球菌(s.aureus)的噬菌体，而第二种颜色的细丝具有感染附着的艰难梭菌(C.difficile)的噬菌体。
[0031]一般地，伤口敷料或绷带包含提供伤口保护和/或吸收伤口液体的敷料层，以及一伤口接触面，其至少一部分可包含 固定其上的病毒。
[0032]所述接触面可以是所述敷料层的一部分，或可以是另一组分的一部分，如包围或覆盖第一材料的覆盖物的一部分。在一个实施例中，所述接触面可以是有渗透性的，使得液体能够通过并进入所述敷料层。虽然可能不是直接的接触，但伤口的接触面通常是与待处理的伤口接触的材料的一部分。因此，例如，在伤口和其上固定有病毒的接触面之间可以进一步放置有渗透性的基质。如此，可能包含任何微生物媒介(microbial agent)的伤口液体可以渗透到有渗透性的基质，并与接触面上存在的固定的病毒接触。
[0033]事实上，所述接触面可将LVCC纳入作为一个组分，LVCC被设计成插入到敷料内形成的袋子等诸如此类中。如此，可以提供包含不同的固定病毒的不同插入物，并且根据待处理的伤口类型，可以选择理想的插入物并放置在敷料中。事实上，可检测伤口以查明哪种类型的微生物媒介存在，并且合适地选择插入物来靶定这些微生物。或者，可以采用包含能提供广谱性杀菌作用的多种噬菌体的LVCC。
[0034]在一个实施例中，一伤口敷料可包含三种组分:将敷料附着在皮肤上的外包层，例如通过绷带或粘合剂；一敷料中间层，其起抵抗敲击和磨损的缓冲作用，并且也能提供帮助愈合过程的功能一一个例子可以是有吸收能力的软麻布(lint)，已多年被用于基础敷料形式的材料；以及一形成接触面的内膜，其是接触伤口的。例如，这可包含一合成的聚合物，其编织成薄片或网，并且可能被一基质包覆，以确保敷料可以轻易清除。
[0035]在纳入噬菌体的敷料的一个简单例子中，噬菌体可附在内层(所述接触面)的表面上，或该内层作为LVCC引入，不同于敷料，但其被用于与伤口接触。常规定位可用作将噬菌体放置到细菌性伤口感染所在/可能建立的区域中，并且优化初始感染性噬菌体事件发生的可能性，从而启动一直扩大的灭菌循环。[0036]在一个实施例中，敷料或LVCC可被设计成有活性抵抗单种类型的细菌，因此就涉及有活性抵抗单种类型细菌的噬菌体(或多噬菌体)的固定。
[0037]另一个实施例可涉及横跨整个接触表面区域的噬菌体固定。然而，在某些情况下，这证实是不必要的，或对于固定或生产不是最经济的方法。可能可以是其他的形式。例如，噬菌体可以仅仅附在接触面的限定区域。这可通过仅活化部分表面，以及允许噬菌体进入整个表面但仅在活化区域发生固定的附着过程来实现。或者，噬菌体可采用打印技术的形式，仅直接进入活化的区域。这可能需要一种安排(与上面的相反)，其中，噬菌体在附着过程之前活化，然后，被“打印”到合适的表面上。或者，噬菌体和表面可同时活化，或当敷料携带多种噬菌体时，在不同时期活化——为生产携带多种类型噬菌体的敷料提供替代的方法。
[0038]以上的所有情况可能会涉及盛装在合适缓冲液中的病毒/噬菌体，该缓冲液可包含或不包含用于产品识别的染料，或作为指示剂的染料，为敷料到期更换与否提供信号。或者，作为指示剂的染料可单独用作标记，或用于区分病毒/噬菌体附着的具体区域。染料也可形成一连接物，以将病毒/噬菌体附着到某些表面。
[0039]此外，可将病毒/噬菌体附着到特定区域，并以不同的式样(pattern)应用，这样来降低生产中要求的病毒/噬菌体数量。再者，可在LVCC或敷料识别中采用式样和/或颜色标记。进一步地，可根据病毒/噬菌体的类型将病毒/噬菌体附着到预先染色的区域。或者将它们附着到没有颜色的区域。
[0040]在上述情况的一个变形中，病毒/噬菌体可附着在敷料的外围来阻止后来的微生物进入，或可在外围使用传统的抗菌剂(消毒剂或抗生素)。像这样，噬菌体可单独或与抗菌化合物(消毒剂、抗生素或其他)和/ 或酶一起应用到敷料或LVCC，为了特定的目的也可固定抗菌化合物和/或酶，以增强附着的噬菌体的效果、促进它们的作用，例如通过移除生物膜，或连同曬菌体一起应用来提供抗菌屏障。这样，敷料和LVCC可包含多于一种类型的抗菌试剂，以及可包含联合多种其他传统抗菌化学剂或酶的试剂的多种病毒/曬菌体。事实上，这些组合可协同发挥作用。
[0041]一个供替代的选择涉及将噬菌体附着到如上所描述的LVCC纤维或线股(strands)，纤维或线股可以被染色(也是如上所描述)，并且能附着到表面，或交错编织到表面中，或两者兼具。纤维可以不同的式样编织或附着来表示敷料或LVCC的类型。噬菌体可在纤维纳入到活化/接触面上/中之前/之后附着。此外，LVCC纤维可根据采用的噬菌体来染色，或替换地，不染色，但编织到敷料接触面的颜色打印区域中或敷料的其他区域中。
[0042]或者，纤维状的LVCC可包含两种或多种线股，染色或不染色，且使病毒/噬菌体附着到一种线股或两种线股上(如下面对多种噬菌体敷料的选择所描述)，并附着到敷料中，又或许完全整合到敷料中。
[0043]另一种选择是，通过根据上面方法中的任一种，将病毒/噬菌体附着到中间敷料层来纳入到敷料中，以便它们通过与伤口相邻布置的有渗透性的或网状的膜来接近靶标微生物。
[0044]另一实施例可涉及LVCC的纳入，LVCC包含附着在由不同屏障基质组成的颗粒和/或小珠上的噬菌体。这可通过直接附着在颗粒/小珠上，或固定在薄片或平面上来实现，所述薄片或平面能精细地划分以形成许多小的颗粒，或细的条料。颗粒可以通过雾化剂或喷雾器来给予，并且也可喷涂或打印在任意敷料或LVCC上，或直接喷涂或打印在需要的区域上/中。
[0045]此外，噬菌体可通过一个两阶段活化过程来附着在不同的表面，其中，噬菌体被固定到细丝、颗粒或小珠来产生LVCC。在第二步中，该LVCC本身被固定/附着到器械(如前所描述的那些)的表面。或者，噬菌体能固定其上的材料不可逆转地结合到器械(例如，假体)，然后进行第二活化步骤，将噬菌体固定到载体基质，所述载体基质结合到器械。
[0046]LVCC或敷料的结构有活性抵抗多种微生物/细菌是可能的。一种方法是涉及利用包含多种不同曬菌体类型的异类混合物(heterogeneous mixture),这被用作一团曬菌体源，用于固定在整个接触面上，或如上所描述的固定在特定位置。
[0047]一个替代的方法是涉及单独保存在不同匀质溶液中的特定噬菌体，将它们活化并且并行地分布——双(或多)喷射打印的一种类型。根据这个实施例，在病毒/噬菌体移动通过打印喷射口前或同时，它们被活化并做好用于固定的准备。
[0048]另一个实施例涉及通过多个表面活化步骤，以确定的顺序将特定的噬菌体类型固定到LVCC或敷料的接触面上。这个方法利用在起始固定过程后仍然保留的那些结合位点，以使得连续的活化和附着步骤不会影响先前固定了的噬菌体。
[0049]或者，根据需要治疗的类型，通过特定区域的连续激活，噬菌体可单独地或组合地附着在敷料接触面的特定区域。这些区域可以用颜色编码。
[0050]此外，特定的病毒/噬菌体可附着在由单独的纤维或细条料组成的LVCC上，并附着到或编织到敷料表面中，或附着到其他器械上，如上所描述。纤维可具有已经固定其上的病毒/噬菌体，或一旦被纳入就被活化以接收病毒/噬菌体，或简单地接收活化了的噬菌体。
[0051]根据病毒/噬菌体的类型，可将纤维以颜色编码，然后扭成由两条或多条细丝(类似理发店的旋转立柱)的线股，然后将线股编织或附着(或两者兼具)到敷料或接触面。此外，可以加入(附着、编织或打印)着色了的指示剂条料，这样随时间推移，颜色的变化提示更换敷料的最佳时机。
[0052]如果不纳入纤维或条料，以上全部可通过纳入或附着到平面LVCC材料的敷料表面的“补丁”(以不同的形状)达到，该“补丁”可具有附着的或处于可附着的适当位置的病毒/噬菌体，以及其本身可由交错编织的纤维组成，或者这两者的组合。
[0053]接触面、纤维或条料可包含指示剂，如颜色标记等，从而使使用者了解附着的病毒类型和/或帮助使用者正确定位LVCC或敷料。
[0054]可以修饰固定了的病毒本身，使得它们能表达以标记蛋白，如绿色荧光蛋白或类似的，这样，当微生物被病毒侵染时，标记基因将会表达，并且产生标记蛋白。继而可以检测到，并使医生注意到伤口中存在微生物的事实。然后，医生可以在适当的时候更换敷料，以便在污染的位置保留活性的噬菌体群，并且持续这样做，直到观察到颜色没有改变，就表示伤口是没有微生物了。为了方便这一过程，该敷料优选地是透明的或部分透明的，这样就可以观察到伤口表面的染色。
[0055] 伤口可以是内部的伤口，或涉及多个组织层的伤口，或处于皮肤层内的伤口，或对象皮肤表面的伤口。已知许多类型的伤口，包括由创伤、手术、烧伤、割伤、擦伤、溃疡、压疮引起的那些伤口，以及由糖尿病、血液循环不良等引起的其他损伤。该术语也广泛地被用于包含其他应用，在所述其他应用中可能希望用于吸收体液并防止任何严重的细菌感染发生；一种这类应用可以是在妇女的卫生产品中，例如，卫生棉条，用于吸收月经并同时防止中毒性休克综合症或将其发展减低。也可包括实际的手术部位，因此，固定的噬菌体会将抗菌特性传递到通常放置在手术区域中的吸收材料，以吸收过量的液体，或传递到阻隔材料，如一次性产品。
[0056]所述对象可以是任何动物对象，如家畜或农畜，但特别地，可以是人。
[0057]本发明的一个实施例是提供一种吸收性医疗或卫生产品，其包含吸收性材料，固定的病毒附着到吸收性材料上，或附着在吸收性材料内，或附着到吸收性材料的可渗透表面覆盖物的至少一部分。这类产品包括卫生巾和卫生棉条、尿布、海绵、卫生湿巾等。上面和别处描述的吸收性材料可以是天然或合成的产品，其包含纤维素或棉、凝胶聚合物、羧甲基纤维素或任何其他合适的材料。
[0058]在另一个实施例中，LVCC可用于帮助易被微生物降解的材料和产品的储存、包装和运输。这可通过包含在媒介物中，或包装中，或帮助来改善材料和产品的储存。这类材料可包括器官和其他组织，或被用于移植的材料。一个例子是角膜移植，在使用前，角膜被储存和运输，其容易受微生物污染和降解，致使该组织无法使用。
[0059]在另一个实施例中，将LVCC应用到广泛的植物材料上，包括水果、蔬菜、叶、茎、花、根、块茎、幼苗和将用来食用或作为储存的种子储备(seed stock)的种子。根据本发明的实施例，噬菌体被直接固定到种子的表面，这样，种子仍然有活力，同时其表面实际上变成所述LVCC的载体组分，如此提供了对抗在储存、发芽、收获和运输销售过程中发生的细菌性植物疾病的方法。
[0060]因此，本发明提供了一种附着有噬菌体的植物材料，其中该噬菌体保持着感染性。
[0061]可以附着感染不同细菌的多种噬菌体，给予更广谱性的活性。
[0062]合适的植物材料包括水果、蔬菜、叶、茎、花、根、块茎、幼苗和种子。食用的种子，例如，动物或鸟吃的种子是一个例子。种子储备，例如，播撒前储存的种子是另一个例子。
[0063]本发明的植物材料可用于预防或治疗植物病害，或吃这些植物材料的动物的疾病，例如在胃肠道中的细菌感染。
[0064]本发明组合物的一个例子是包含本发明植物材料特别是种子的动物食物或鸟食。这些食物可以是块状的或小球状的，包含或由本发明的种子制成。这些食物可以是块状的或小球状的，随后经处理以附上噬菌体，例如，通过用噬菌体共价附着的颗粒的水性制剂来处理食物，然后通常将食物干燥来使颗粒附着。或者，将干燥的颗粒制剂与食物混合。
[0065]一般地，可将噬菌体间接附着到植物材料，例如，附着到一颗粒或多颗粒，颗粒提供递送噬菌体的方法，如抵抗植物病害。例如，附着有噬菌体的颗粒的溶液可以喷洒到植物材料上，并让其干燥，从而让它们粘在植物材料上。在下面的一个例子中，这类颗粒通过这种方法附到马铃薯块茎上。噬菌体保留活力，并且有效地防止块茎的病害。
[0066]因此，本发明包括这样的方法，该方法包括将噬菌体共价附着的颗粒的水性制剂与植物材料混合，并将混合物干燥，使得颗粒附着到所述植物材料上。或者，将干燥的颗粒制剂与植物材料混合，例如，将其撒到植物材料上。
[0067]下面更详细地描述本发明的一个具体实施例，将噬菌体共价附着到西红柿种子上。在单独实施例中的测试证实了，以这种方式将噬菌体附着在纤维素(例如，在西红柿种子表面上找到的)上仍然保持噬菌体的活力。使用西红柿种子充当一个例子。使用其他种子能得到类似的结果，从小的(烟草)到大的(玉米)种子。化学和电晕(corona)激活种子导致种皮表面的瞬时改变，其中种皮包含与纤维素或果胶相关的聚合物，具有可变量的蛋白质和脂肪酸。当暴露到电晕场时，所有这些材料会产生多种活性自由基，它们会与噬菌体的蛋白质衣壳或其他实体反应，并使这些材料腐坏(decay)以在几秒内赋予稳定的共价键。结果显示，电晕激活是一种表面现象，而如通过发芽进行测试的，种子的活力没有受到不利的影响——事实上，与没有经电晕处理的相比，发芽得到改善。[0068]当其他植物材料(例如，叶、茎、花、根)在电晕场中处理时，看到类似的效果；激活和反应发生在表皮的表面，并且使得噬菌体附着；对植物的损伤仅会发生在植物材料的尖端和电晕电极之间发生放电时。因此，植物材料能直接附着噬菌体，例如，共价地附着。植物材料还能与共价附着有噬菌体的颗粒联合在一起，或混合在一起。携带噬菌体的颗粒能干燥到植物材料上。不然，该颗粒可以与植物材料联合在一起。
[0069]本发明进一步的具体实施例中，用固定的噬菌体来处理马铃薯块茎。详细地，将噬菌体附着在纤维素颗粒的表面，并通过向块茎喷洒颗粒的溶液，并随后干燥块茎——为了确保颗粒粘附，将它们固定在马铃薯的表面。意外地，马铃薯植物的生长在这样的处理后得到改善:感染发生率降低，并且经处理的植物的生长明显更好。
[0070]在一实施例中，基于种子形式的LVCC可用于递送噬菌体，以治疗容易受细菌感染，如那些容易受到胃肠道感染的吃种子的动物。类似地，LVCC可应用到其他食物素材，以治疗消化疾病和其他疾病。或者，用LVCC代替粗砂，并用于治疗鸟类的疾病(aviandisease)。以这种方式，抵抗细菌性病原体的噬菌体能施用到肠中，以治疗动物的细菌性疾病。
[0071]也可直肠给药LVCC来递送，以对下消化道进行抗菌治疗。
[0072]在另一个实施例中，LVCC可通过注射到需要的循环系统或淋巴系统或直接注射到脑脊髓液中或其他体腔或器官中，实现动物的系统性噬菌体治疗，例如，提供抗菌作用。或者，LVCC可允许通过吸入来递送噬菌体或其他病毒，从而抵抗呼吸道的感染。
[0073]固定被理解为与特定的物理固定相关，例如，通过任何化学键(共价键、离子键、氢键或范德华力)，并且因此与病毒对基质的任何被动的凸起相区别。此外，固定是这样的，其能保持病毒感染一细胞或多细胞的能力。因此，固定可通过病毒的头部或衣壳蛋白，或确实的病毒任何其他表面蛋白发生，假如病毒依然能感染期望的靶标细胞。更优选地，噬菌体/病毒通过它们的头基或核衣壳固定到基质，这通过在加入和偶联噬菌体/病毒之前激活基质来完成。共价附着是附着的优选方式。
[0074]根据本发明，术语“病毒”包括双链或单链的RNA或DNA病毒，包括感染细菌的那些病毒，并且通常称为噬菌体。在优选的实施例中，所述病毒为噬菌体。
[0075]本领域已知许多不同类型的噬菌体/病毒，并且根据所要解决的细菌问题，可以选择合适的噬菌体/病毒。例如，对于伤口处理，临床医生可能知道一般类型的细菌/原生动物/真菌，它们可能感染特定的伤口，而伤口敷料可包含一种或多种不同类型的被设计用于感染的噬菌体/病毒，并且因此将感染特定伤口的细菌/原生动物/真菌的生长减到最低。[0076]潜在的伤口病原体的例子包括链球菌(Streptococci )，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)；肠球菌(enterococci),如幾肠球菌(Enterococcusfaecalis);葡萄球菌(staphylococci),如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),特别是抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA);绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);肠杆菌各种(Enterobacter species);大肠杆菌(Escherichia coli );克雷白氏杆菌各种(Klebsiella species);变形杆菌各种(Proteus species);拟杆菌(Bacteroides);梭状芽胞杆菌(Clostridium);酵母,例如念珠菌(Candida);以及曲霉菌。 [0077]根据本发明，术语“载体/基质”被理解为病毒可固定的任何固态材料。例如，所述载体可以是这样的材料，其有利地被激活以允许，例如病毒(如复合噬菌体(complexbacteriophage))的头基特异性结合。所述基质可以采用多种形式，例如，尼龙和任何其他类似的聚合物、具有活性基团如氨基或羧基表面基团的聚合物、纤维素或其他含羟基的聚合物、聚苯乙烯或其他类似的聚合物。基质也可包括聚合物作为长链高分子，其由多个共价键结合的单体子单元组成，并由单种重复单体或多种单体类型的组合组成。通常，它们包括天然的、合成的或生物合成的生物可降解/生物可重吸收的材料，其为单体形式或聚合形式，单独地或组合在一起或作为共聚物，例如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)对映体及聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚对二氧环己酮(PD0)、聚三亚甲基碳酸酯(TMC)、聚醚醚酮(PEEK)以及它们的混合物和复合物。基质也可包括塑料或其他前述的聚合物或小珠或颗粒，它们可以是磁性的或包含生物材料，例如藻酸盐、玻璃或玻璃纤维、不锈钢、硅树脂、丝、胶原蛋白或陶瓷材料。更优选地，所述基质由治疗或治疗支持中，在医疗器械中常规使用的材料制备。例如，常规用作缝合线的材料，以及还有用于敷贴开放性伤口的软麻布或纱布材料。在某些实施例中，所述基质可以是生物可降解的/生物可重吸收的，并且因此当与体液接触放置时，可在体内随时间降解和被重吸收。例如，敷料层可由凝胶材料制成，其中，附着有所述病毒，其也可用来吸收来自伤口的液体，并且使这些液体与固定的病毒相接触。
[0078]根据本发明，术语“激活的/激活/活化”理解为基质和/或病毒通过与多种化学基团(留下的表面化学性质能结合病毒，例如噬菌体头部或衣壳表面蛋白或基团)反应进行的活化。或者，通过电活化或其他放电、电场或电场效应如等离子体、微波、光电效应、射频场效应、伽马和其他能源辐射等实现固定化。这可应用到载体基质或病毒或基质和病毒两者。
[0079]基质的活化也可这样来实现，例如，用酸来初步水解，优选盐酸，然后用水和碱的清洗步骤来去除酸。优选地，所述碱为碳酸氢钠。病毒，如噬菌体通过它们头基的结合是重要的。在复合噬菌体的情况下，例如，通过头基的结合留下尾基，这对于细菌特异性识别来说是必须的，使得可以自由感染，即结合并穿透宿主细菌细胞。应当理解的是，这种感染宿主细胞的机制与除了仅感染细菌并在其中繁殖的病毒以外的许多其他病毒相似。多种病毒，例如不同菌株特异性的噬菌体，在任何一个时间可固定到基质。
[0080]病毒偶联到基质是化学键形成的结果，例如在病毒衣壳蛋白和基质之间例如通过肽上的氨基形成的共价键，例如肽键。协助这一过程的“偶联剂”可以不同，取决于使用的基质。例如，为了通过氨基或羧基表面基团偶联到基质尼龙或其他聚合物，可以使用偶联剂碳二亚胺或戊二醛。[0081]为了偶联到基质纤维素或其他含羟基的聚合物，可以使用偶联剂磺酰基乙烯基乙酯(vinylsulfonylethylene ether)或三嗪。
[0082]将病毒偶联到基质聚乙烯或其他类似聚合物或许多其他聚合物类型的偶联手段包括电晕放电或高锰酸盐氧化。
[0083]已经证明，使用电晕放电技术是可能将病毒固定到范围广泛的基质，这样在使游离病毒变性的环境条件下，可以使病毒抗菌活性保持的时间延长。此处以上给出一广泛的列举，并且包括这些基质:尼龙和相关的聚合物、涤纶、聚苯乙烯、塑料和相关的聚合物、天然和合成的橡胶、可生物吸收/可生物重吸收的单体、聚合物和共聚物，单独地或组合地或作为共聚物地，例如，聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)对映体和聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚对二氧环己酮(PD0)、聚三亚甲基碳酸酯(TMC)、聚醚醚酮(PEEK)以及它们的混合物和复合物，硅、陶瓷、玻璃和玻璃纤维、金属包括不锈钢、铝和金属合金，胶原蛋白、角蛋白、丙烯酸和各种不同的覆层(coatings)、骨、丝、纤维素-包括纸、棉、软麻布、胶带和纱布，人造纤维丝、天然或合成的海绵、藻酸盐、透明质酸、凝胶表面-例如水凝胶。
[0084]一般来说，将噬菌体偶联到基质的偶联剂包括:S_乙酰巯基丁二酸酐；S_乙酰巯基乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；己二酸二酰肼；4_叠氮苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；N- (5-叠氮基-2-氧硝基苄基)琥珀酰亚胺；6- (4-叠氮基-2-硝基苯基氨基)己酸N-羟基丁二酰亚胺酯；4_叠氮苯甲酰甲基溴(p-Azidophenacyl bromide) ；4~叠氮水杨酸N-羟基丁二酰亚胺酯；溴乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；1，4- 丁二醇二缩水甘油醚；2_重氮基-3，3，3-三氟丙酸对-硝基苯酯；丙二酰亚胺二乙酯；4，4’ - 二异硫氰酰-2，2’ -基二磺酸；己二亚氨二甲酯(Dimethyl adipimidate) ；3, 3’ - 二硫代双丙亚氨酸二甲酯；庚二亚氨酸二甲酯；辛二亚氨酸二甲酯；4’4-叠氮基苯基二硫醚(4，4’ -Dithiobisphenylazide) ;二硫代双(丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯)；乙二醇双(丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)；4-氟-5-硝基叠氮苯；对-甲酰基苯甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯；戊二醛；2_亚氨基硫烷；6-(碘代乙酰胺)己酸N-羟基丁二酰亚胺酯；碘乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；3_马来酰亚胺乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；3_马来`酰亚胺苯甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯；4_ (N-马来酰亚胺)二苯甲酮马来酰亚胺丁酸N-羟基丁二酰亚胺酯；s-马来酰亚胺己酸N-羟基丁二酰亚胺酯；4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烯甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯；4_ (N-马来酰亚胺甲基)环己烯甲酸3-磺基-N-羟基丁二酰亚胺酯；马来酰亚胺丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；N, N’-双(3-马来酰亚胺丙酰基)-2-羟基-1，3-丙二酰胺；1，4-亚苯基二异硫氰酸酯；N，N’(邻-苯基)双马来酰亚胺；聚乙二醇双(缩水甘油醚)；双(聚乙二醇双(缩水甘油醚))；聚乙二醇双(咪唑基羰基)I ;双(聚乙二醇双[咪唑基羰基]);聚乙二醇双((对-硝基苯基)碳酸酯)；3- (2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯；辛二酸双(N-羟基丁二酰亚胺)酯；丁二酸马来酰亚胺乙基-N-羟基丁二酰亚胺酯；1，5- 二(琥珀酰亚胺基氧羰基氧基)戊烷；:(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯。
[0085]有利地，当病毒固定到载体基质时，所述固定可提供稳定性。例如，以这种方式，所述固定的病毒被稳定住，其能保持其活力和感染性，甚至当与试剂如蛋白酶接触时也能保持，蛋白酶可以另外的方式迅速地使病毒失活。类似地，当暴露到物理压力，如可使病毒失活的脱水、温度或PH时也是。【专利附图】

【附图说明】
[0086]现在，将通过实施例和附图的方式对本发明进一步描述，其中:
[0087]图1显示了一 LVCC (作为一种或多种细丝或条料，噬菌体已单独地或组合地附着其上)添加其中的伤口敷料的示意图；
[0088]图2a和2b显不了纳入有LVCC的敷料的不意图；
[0089]图3显示了以可识别式样方式的携带多种噬菌体的敷料的示意图；
[0090]图4a显示了具有深部伤口的动物的统计数据，在术后7天，该伤口用70 μ I悬浮在5%猪胃粘蛋白中的lX105cfu/ml E15感染，采用正常或噬菌体处理的LVCC ；
[0091]图4b显示了具有深部伤口的动物的细菌接种量，在术后7天，该伤口用70μ I悬浮在5%猪胃粘蛋白中的lX105cfu/ml E15感染，采用正常或噬菌体处理的LVCC ；
[0092]图5显示了 MRSA的清除，其通过固定在插入大鼠受感染伤口 14天后回收的手合线上的噬菌体来清除；
[0093]图6a显示了通过LVCC抵抗干燥带来的稳定性；
[0094]图6b显示了通过LVCC抵抗紫外辐射带来的稳定性；
[0095]图6c显示了通过LVCC抵抗温度带来的稳定性；
[0096]图7显示了土壤中固定的噬菌体的存活；
[0097]图8显示了将具有两种噬菌体的LVCC暴露到两种细菌，其中每种细菌对噬菌体中的一种敏感；
[0098]图9显示了受感染的对照伤口位置在第14天的侧面外部视图；
[0099]图10显示了受感染的对照伤口位置在第14天的背面内部视图；
[0100]图11显示了根据本发明采用细丝处理的伤口位置在第14天的侧面外部视图；
[0101]图12显示了图11的位置的背面内部视图，显示出棘突旁的肌肉中在第14天肿胀降低以及脓水减少；
[0102]图13显示了发芽的西红柿种子(对照)；
[0103]图14显示了根据本发明，噬菌体固定在种子表面上的发芽的西红柿种子；
[0104]图15显示了用电晕放电处理(但没有经噬菌体处理)的发芽的西红柿种子；
[0105]图16显示了用游离噬菌体处理的发芽的西红柿种子；以及
[0106]图17显示了根据本发明，纤维素颗粒周围细菌的清除。
【具体实施方式】
[0107]实施例1-LVCC递送噬菌体以抵抗深部伤口感染的效率。
[0108]图1示意性地显示了通过敷料(2)将本发明LVCC (I)压到组织(3)中的伤口(4)上。
[0109]图2a是纳入了LVCC的本发明倒转的敷料，显示其横截面。袋子(5)封装着粘附到敷料(7)的LVCC (6)，其具有敷料顶面(8)-因此，其在图中是倒转的。
[0110]图2b示意性显示了编织到敷料(10)中的LVCC (9)。两种细丝(9a和9b)是不同的颜色，并且附着有不同的噬菌体 。图3显示了敷料(11)的进一步示意图，其中纳入了附有噬菌体的细丝(12)。[0111]在第一个实施例中，采用体内模型证明了 LVCC递送噬菌体的效率，用来抵抗在受感染的深部伤口环境中的细菌感染。渗透到多个组织层的深部伤口被抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MRSA) (E15)感染所有的层,采用包含对抗感染的MRSA菌株的噬菌体的LVCC来处理该伤口。
[0112]将噬菌体固定到合成的尼龙聚合物细丝，其与伤口封闭用缝合线生产中使用的类似。使用LVCC作为缝合线，在多个层上封闭感染的伤口。该丝状LVCC的表面固定有抗-MRSA噬菌体(待测原型(prototype) LVCC),或者不具有(对照)。
[0113]在所有用LVCC处理的对象中，感染得到控制和减少(如视觉上以及通过细菌计数证明的)(见图4a和4b)，伴随正常的伤口愈合过程。与之相比，MRSA在对照对象中生长的过程没有进行抑制，结果导致了发炎化脓的伤口不能痊愈。 [0114]该结果显示，采用LVCC，噬菌体能在体内模型中较长时间地递送一有效的抗菌效果——见表1A和IB。
[0115]实施例2—延长的稳定性
[0116]清洗从受感染的对象中回收的LVCC，并保存在4°C，并且定期地评估其在体外持续抵抗MRSA生长的抗菌活性。
[0117]在一系列的试验中，通过将LVCC放置在一细菌菌苔中，证明了其抗MRSA活性得到维持。储存后，噬菌体活性(如回收的LVCC周围看到的清除区域显示的)延续数周一见图5。
[0118]实施例3-LVCC抵抗干燥、紫外辐射和温度所带来的稳定性
[0119]在这些例子中，使用活化的尼龙聚合物或棉纤维作为载体基质来产生LVCC。将附着有噬菌体的LVCC暴露于一系列的环境条件中，包括干燥，通过相对湿度对噬菌体存活的影响所显示的(见图6a)，紫外光(见图6b)和升高的温度(见图6c)，已知所有条件都能使游离噬菌体变性。
[0120]将三条2 X Icm的噬菌体条料放置在LBM琼脂上，并放置在无菌操作柜中暴露于紫外光5、15和30min。然后将条料翻过来，并放置在琼脂的新鲜区域，重复紫外线照射。类似地处理对照噬菌体条料，但是屏蔽紫外线。然后，将这些条料转移到15ml LB液体培养基中，接种50 μ I金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬浮液并培养。
[0121]结果一见表2
[0122]结论:附着的噬菌体暴露在柜子紫外线中能经受30分钟。暴露于紫外线源5分钟能杀死金黄色葡萄球菌(S.aureus)细菌细胞。
[0123]实施例4一在极端环境中保持活力
[0124]在这个实施例中，在暴露到土壤提供的严格条件后，确定LVCC噬菌体增强的稳定性和活力。该研究涉及两种类型LVCC的结构，采用的噬菌体是固定到尼龙聚合物或纤维的。随后，将每种LVCC埋在没有灭菌或灭菌的土壤中，3周后取样评定LVCC的抗菌活性。
[0125]结果显示，与游离噬菌体相比，两种LVCC噬菌体都有提高的生存率(见图7)。
[0126]实施例5—多种噬菌体构成的LVCC
[0127]将两种噬菌体固定到共同的载体基质上并测试抗菌活性，评估LVCC的性能这两种噬菌体对抵抗两种不同的靶标细菌具有活性。在细菌菌苔上的清除百分率是基于每种噬菌体在它们的宿主菌种上的平均清除范围，测量单位为mm。[0128]结果显示，抗菌活性没有减低，LVCC噬菌体在抵抗两种靶标细菌方面仍然有活性(见图8)。将处理的材料暴露在2种细菌种类中(I种宿主，I种非宿主)，结果仍然能清除易受感染的宿主。
[0129]实施例6—深部伤口的处理
[0130]在10只对照动物(大鼠)中，用100 μ I悬浮在5%猪胃粘蛋白中的5X107cfu/mlE15MRSA感染深切到棘突旁肌肉的切口中，并且用一般的缝合线将伤口缝合。10只测试动物具有相同的切口，采用100μ I悬浮在5%猪胃粘蛋白中的5X107cfu/ml E15MRSA感染，并且在该深部伤口中插入噬菌体处理过的细丝。被固定的噬菌体为噬菌体K。
[0131]手术后，所有动物用镇痛剂处理，并且在起初的12小时内每小时进行观察，在随后的12小时内，每3小时进行观察，然后在感染后的接下来2天每6小时进行观察，并且这以后每天观察2次。
[0132]在这些时间间隔检查伤口位置，检查发炎和感染(脓形成)的现象14天。观察的结果显不在表3中。
[0133]关于图9，其显示受感染的对照:如所见，在第14天，该位置依然很大，肿胀并且如果全部愈合，情况欠佳，切口位置凸起。如图10所示，当打开时，显露出填充脓汁的切口位置。
[0134]图11中显示使用附着有噬菌体的测试细丝。在第14天，这个愈合良好的切口位置有最小的肿胀。在第14天，内部位置显示向伤口位置的肿胀减少，棘突旁肌肉中的脓形成减少。
[0135]实施例7—在西红柿种子上固定噬菌体
[0136]噬菌体的制备
[0137]我们在20%胰蛋白酶大豆肉汤培养基(其他合适的培养基也是已知的)上培养果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)菌株,并用对数生长期的溶解性曬菌体来感染培养基。当发生溶解时，我们通过离心将噬菌体纯化，并通过将其重悬于蒸馏水中来洗涤噬菌体小球3次，并通过离心进行浓缩。
[0138]电晕处理
[0139]用75kV的电晕场对西红柿种子处理I秒，然后将种子浸入曬菌体悬浮液中(一种替代方式是将噬菌体悬浮液喷到经处理的种子上)。我们将种子用水洗涤3次来去掉没有结合的噬菌体(一种替代方式是在电晕处理前，将噬菌体悬浮液施加到种子上)。请注意，其他场强度也是有效的，而仅需要洗涤来证明观察到的抗菌效果是由共价结合的噬菌体产生的，而不是吸附的“游离”噬菌体产生的。
[0140]发芽
[0141]因此，我们制备的种子为(i)没有处理的，(ii)电晕放电处理的，(iii)在噬菌体存在下用电晕放电处理，以及(iv)用游离噬菌体处理的，在室温下，使种子在盘子中用水湿润的纸上发芽(一种替代方式是在有或没有果胶杆菌属(Pectobacterium)的胰蛋白酶大豆琼脂(加入2%琼脂的液体培养基)上发芽)。
[0142]结果
[0143]与对照(图13，没有电晕处理)和没有噬菌体(图16)相比，西红柿种子在用电晕处理(图15)和电晕处理并带有抗果胶杆菌属噬菌体(图14)的情况下显示提高的发芽率。在与合适的果胶杆菌属菌种(易受使用的噬菌体感染的)一起培养的琼脂上，用电晕和抗果胶杆菌属的噬菌体处理的种子周围，将看到清除区域。西红柿种子表面大部分为纤维素，而我们随后分别测试固定在纤维素颗粒上的噬菌体的活力--见以下。
[0144]实施例8—体内植物病原体检测
[0145]根据W02007/072049的电晕放电法，我们将果胶杆菌属噬菌体固定到纤维素粉(粒度范围大约100微米-1毫米)。
[0146]我们将合适的果胶杆菌属菌株(易受使用的噬菌体感染的)接种到琼脂平板，并在三个位置加入经处理的纤维素颗粒。
[0147]参考图17中显示的结果，可以看到粉末颗粒周围的清除情况，显示出固定的噬菌体抵抗软腐病细菌的活性。这证明了附着在纤维素材料上的噬菌体是有活力的。
[0148]实施例9—纤维素颗粒上的噬菌体
[0149]按照W02007/072049的电晕放电法，我们将果胶杆菌属噬菌体固定到纤维素粉(粒度范围大约100微米-1毫米)。
[0150]我们将合适的果胶杆菌属菌株(易受使用的噬菌体感染的)接种到琼脂平板，并在三个位置加入处理的纤维素颗粒。
[0151]我们用(i)空白=对照，(ii)溶液中的游离噬菌体和(iii)溶液中附着在纤维素颗粒的噬菌体来处理平板，并滴定(i i)和(iii)直到观察到类似的细菌清除活性。与使用1份附着在纤维素颗粒的噬菌体相比，当使用大约100份游离噬菌体时，出现类似的活性。这证明了固定的噬菌体的性能比游离噬菌体的性能提高了。
[0152]实施例10—马铃薯的处理
[0153]用以下对马铃薯块茎进行处理:(i )灭菌水=对照，(ii )游离噬菌体和(iii )对造成马铃薯“黑胫病”的细菌具有特异性的噬菌体，按照实施例8和9固定在纤维素颗粒上。用溶液喷洒块茎，并使其干燥。
[0154]种植块茎，并用植株的数目、茎的总数和感染黑胫病的植株数来记录其生长。结果显不在表4中。
[0155]因此，我们发现，与其他处理相比，用果胶杆菌属处理并喷洒水(阳性对照)的处理具有最低出苗数，并且茎有更大几率出现黑胫病。
[0156]用游离噬菌体处理对出苗总数影响很小。
[0157]当与阳性对照比较时，每株的茎数有增加。
[0158]仅有一株用游离曬菌体处理的植株出现黑胚病的病征。
[0159]当与对照相比，用固定的噬菌体处理增加了每颗植株的茎数，以及出苗数。种植8周后，在最后的观察中，用固定的噬菌体处理的块茎中没有发现黑胫病的病征，显示出持续的抗菌活性。
[0160]表 IA
【权利要求】
1.一种附着有噬菌体的植物材料，其特征在于，所述噬菌体保持着感染性。
2.根据权利要求1所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料附着有多种感染不同细菌的噬菌体。
3.根据权利要求1或2所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料选自水果、蔬菜、叶、茎、花、根、块茎、幼苗和种子。
4.根据权利要求3所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料为食用种子。
5.根据权利要求3所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料为种子储备。
6.根据前述权利要求中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于预防或治疗植物病害。
7.根据前述权利要求1-5中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于预防或治疗食用所述植物材料的动物的疾病。
8.根据前述权利要求7所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于预防或治疗胃肠道中的细菌感染。
9.根据前述权利要求7或8所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于预防或治疗鸟类疾病。
10.根据前述权利要求中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌体被物理固定到所述植物材料上。
11.根据前述权利要求中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌体通过共价键、离子键、氢键或范德华力附着到所述植物材料。
12.根据前述权利要求中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌体是通过共价附着的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌体附着到一颗粒，并且所述颗粒附着到所述植物材料。
14.一种处理植物材料的方法，包括将噬菌体附着到所述植物材料，其中，所述噬菌体保持着感染性。
15.根据权利要求14所述的方法，包括活化所述植物材料，然后将所述噬菌体附着到该活化了的植物材料。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述植物材料附着有多种感染不同细菌的噬菌体。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述植物材料选自水果、蔬菜、叶、茎、花、根、块茎、幼苗和种子。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，所述植物材料包括食用种子或用于种子储备的种子。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，该方法用于制备植物材料来用于预防或治疗植物病害。
20.根据前述权利要求14-19中任一项所述的方法，其特征在于，该方法用于制备植物材料来用于预防或治疗食用所述植物材料的动物的疾病。
21.根据前述权利要求14-20中任一项所述的方法，包括将所述噬菌体通过共价键、离子键、氢键或范德华力附着到所述植物材料。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述噬菌体是通过共价附着的。
23.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，包括将所述噬菌体附着到一颗粒或多颗粒，并且将所述一颗粒或多颗粒附着到所述植物材料。
24.根据权利要求23所述的方法，包括将噬菌体共价附着的颗粒的水性制剂与植物材料一起混合，并将混合物干燥，使得颗粒附着到所述植物材料上。
25.—种包含根据权利要求1-13中任一项所述的植物材料的组合物。
26.一种预防或治疗食用植物材料的动物的疾病的方法，包括给予所述动物一根据权利要求25所述的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述疾病是胃肠道疾病。
28.一种组合物，包含载体以及共价附着其上的噬菌体，所述载体选自(i)细丝，(ii)平面材料和(iii)颗粒和/或小珠，其中，所述噬菌体保持着感染性。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述载体是可生物降解的和/或可生物兼容的。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中所述载体是组织兼容的，并且能被原位吸收。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于深部伤口中细菌感染的治疗或预防。
32.—种根据权利要求28-31中任一项的细丝。
33.一种细丝纳入到敷料中的伤口敷料，其特征在于，所述细丝附着有噬菌体，并且可选地是根据权利要求28-32中的任一项。
34.根据权利要求33所述的伤口敷料，其中，所述细丝是编织到所述敷料中的。
35.根据权利要求33所述的伤口敷料，其中，所述细丝是松散在所述敷料上的。
36.一种治疗身体部位上的感染的方法，包括将细丝定位在所述部位，所述细丝附着有噬菌体，并且可选地是根据权利要求28-32中的任一项。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述部位是深部伤口。
38.一种伤口敷料，其特征在于，所述伤口敷料包含多种细丝，噬菌体附着其上，其中存在至少第一细丝和第二细丝，第一噬菌体附着到第一细丝，第二噬菌体附着到第二细丝，以及其中所述第一和第二噬菌体感染不同株或种的细菌。
39.根据权利要求38所述的伤口敷料，其中，所述第一和第二细丝是不同的颜色。
【文档编号】A61K35/76GK103747792SQ201280035218
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】J·查德威克, M·马泰 申请人:固定噬菌体有限公司