免疫原性组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含来自艰难梭菌的毒素A和毒素B的片段的融合蛋白，具体而言，本发明涉及包含第一片段和第二片段的多肽，其中(v)所述第一片段是毒素A重复结构域片段；(vi)所述第二片段是毒素B重复结构域片段；(vii)所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端；(viii)所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且，其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有序列相似性。
【专利说明】免疫原性组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及来自艰难梭菌iflostridium difficile)的抗原。具体而言,本发明涉及包含来自艰难梭菌的毒素A和毒素B的片段的重组多肽。本发明还涉及包含这些多肽的免疫原性组合物或疫苗，以及本发明的疫苗和免疫原性组合物在预防或治疗中的用途。本发明还涉及使用本发明的组合物的免疫方法，以及本发明的组合物在药物制造中的用途。
[0002]背景
艰难梭菌是医院肠道感染的最重要原因并且是人中假膜性结肠炎的主要原因(Bartlett 等人，J?.J.Clin.Nutr.11 suppl:2521-6 (1980))。感染艰难梭菌的个体的总体相关死亡率在诊断的3个月内计算为5.99%,并且更闻的死亡率与闻龄相关,在超过80 岁的患者中为 13.5% (karas 等人，/otfraaJ of Infection 561:1-9 (2010))。目前对艰难梭菌感染的治疗是施用抗生素(甲硝唑和万古霉素)，然而，已经存在对这些抗生素具有抗性的菌株的证据(Shah 等人，Expert Rev.Anti Infect.Ther.8(5)，555 - 564(2010))。因此，存在对能够诱导针对艰难梭菌的抗体和/或保护性免疫应答的免疫原性组合物的需求。
[0003]发明简述
艰难梭菌的肠毒性主要由于毒素A和毒素B两种毒素的作用。这些都是有效的细胞毒素(Lyerly 等人，Current Microbiology 21:29-32 (1990)。毒素 A 和毒素 B 的 C 末端结构域包含重复单位，例如毒素A的C末端由连续的重复单位构成(Dove等人，Infect.1wmun 58:480-499 (1990))，由于这一原因，C末端结构域也可以称为‘重复结构域’。如Ho等(PNAS 102:18373-18378 (2005))中描述，这些重复部分可以进一步分为短重复(SRs)和长重复(LRs)。
[0004]已经确定了毒素A重复结构域的C末端的127-aa片段的结构(Ho等人，PNAS 102:18373-18378 (2005))。该片段形`成螺线管类折叠，主要由β链和低比例的α螺旋构成。
[0005]已经表明毒素A具体为C末端结构域的片段能够导致在仓鼠中的保护性免疫应答(Lyerly 等人，Current Microbiology 21:29-32 (1990))、W096/12802 和 W000/61762。
[0006]已知设计在表达过程中能够正确折叠的融合蛋白是困难的。本发明的多肽是融合蛋白，其中，保持天然β_螺线管类结构，并且发现其能够在小鼠中提供针对毒素A和毒素B 二者的免疫应答。
[0007]在本发明的第一个方面，提供包含第一片段和第二片段的多肽，其中 (i)所述第一片段是毒素A重复结构域片段；
(?)所述第二片段是毒素B重复结构域片段；
(iii)所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端；
(iv)所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且
其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有序列相似性。[0008]在本发明的第二个方面，提供编码本发明的多肽的多核苷酸。
[0009]在本发明的第三个方面，提供包含与诱导型启动子连接的本发明的多核苷酸的载体。
[0010]在本发明的第四个方面，提供包含本发明的载体或本发明的多核苷酸的宿主细胞。
[0011]在本发明的第五个方面，提供包含本发明的多肽和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。
[0012]在本发明的第六个方面，提供包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
[0013]在本发明的第七个方面，提供本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在治疗或预防艰难梭菌疾病中的用途。
[0014]在本发明的第八个方面，提供本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于预防或治疗艰难梭菌疾病的药物中的用途。
[0015]在本发明的第九个方面，提供预防或治疗艰难梭菌疾病的方法，其包括向患者施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。
[0016]附图简述
图1一本发明的多肽的序列表。
[0017]图2 — ToxA和ToxB的C末端结构域的图示，SR重复表示为白色方框并且LR盒表示为黑色方框。
[0018]图3 —融合体I中使用ToxA的第三个SR VIII和Tox B的第四个SR II之间的连接的图示。
[0019]图4 一融合体2中使用ToxA的第二个SR VIII和Tox B的第三个SR II之间的连接的图示。
[0020]图5 —融合体3 (仅包含部分的ToxA的LRVII和部分的ToxB的LR II)中使用的ToxA的LRVII和ToxB的LRII之间的连接的图示。
[0021]图6 —融合体4中使用ToxA的第二个SR VIII和ToxB的第三个SR I之间的连接的图示。
[0022]图7 —融合体5中使用的包含ToxA蛋白序列的最后一个残基和ToxB的第四个SRII的起点之间的甘氨酸接头的连接的图示。
[0023]图8 一描绘通过沉降速度分析超速离心测定的艰难梭菌ToxA-ToxB融合体1_5的分布的图。图a)描绘了融合体I的分布，图b)描绘了融合体2的分布，图c)描绘了融合体3的分布，图d)描绘了融合体4的分布和图e)描绘了融合体5的分布。
[0024]图9 一描绘使用圆二色性测定的融合体2、3、4和5的远UV谱的图。融合体2的谱用具有表示为小矩形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为小菱形的点的线表示，融合体4用具有表示为圆形的点的线表示，并且融合体5用具有表示为十字形的点的线表示。
[0025]图10 —描绘使用圆二色性测定的融合体2、3、4和5的近UV谱的图。融合体2的谱用具有表示为十字形的点的线表示，融合体3的谱用具有表示为圆形的点的线表示，融合体4的谱用具有表示为三角形的点的线表示，并且融合体5的谱用具有表示为小菱形的点的线表示。
[0026]图11 一显示在用毒素A的C末端片段(aa 2387-2706)、毒素B的C末端片段(aa1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxA免疫原性的图。
[0027]图12 —显示在用毒素A的C末端片段(aa 2387-2706)、毒素B的C末端片段(aa1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的血细胞凝集抑制的图。
[0028]图13 —显示在用毒素A的C末端片段(aa 2387-2706)、毒素B的C末端片段(aa1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠中的抗ToxB免疫原性的图。 [0029]图14 一来自用毒素A的C末端片段(aa 2387-2706)、毒素B的C末端片段(aa1750-2360)或融合体1、2、3、4或5免疫的小鼠的细胞毒性(Cyotoxicity)抑制效价。
[0030]图15 —描绘通过沉降速度分析超速离心测定的艰难梭菌ToxA-ToxB融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的分布的图。图a)描绘了 F52New的分布，图b)描绘了 F54Gly的分布，图c)描绘了 F54New的分布并且图d)描绘了 F5ToxB的分布。
[0031]图16 —描绘使用圆二色性测定的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的远UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示,并且F5ToxB用具有表示为十字形的点的线表示。
[0032]图17 —描绘使用圆二色性测定的融合体F52New、F54Gly、F54New和F5ToxB的近UV谱的图。F52New的谱用具有表示为双十字的点的线表示，F54Gly的谱用具有表示为三角形的点的线表示，F54New用具有表示为矩形的点的线表示,并且F5ToxB用具有表示为十字形的点的线表示。
[0033]图18 —显示用F2、F52New、F54Gly、G54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的抗ToxAELISA结果的图。
[0034]图19 一显示用F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的抗ToxBELISA结果的图。
[0035]图20 —显示用F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠中的血细胞凝集抑制的图。
[0036]图21 —显示来自用F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的HT29细胞中的细胞毒性效价的图。
[0037]图22 —显示来自用F2、F52New、F54Gly、F54New或F5ToxB融合体免疫的小鼠的IMR90细胞中的细胞毒性效价的图。
[0038]发明详述
Ml
本发明涉及包含第一片段和第二片段的多肽，其中 (i)所述第一片段是毒素α重复结构域片段；
(?)所述第二片段是毒素B重复结构域片段；
(iii)所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端；
(iv)所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且
其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有序列相似性。[0039]术语多肽指氨基酸的连续序列。
[0040]术语‘毒素A重复结构域’指来自艰难梭菌的毒素A蛋白的C末端结构域，其包含重复序列。该结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A的氨基酸1832-2710以及它们在不同菌株中的等同物，来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1832-2710的序列对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1832-2710。
[0041]术语‘毒素B重复结构域’指来自艰难梭菌的毒素B蛋白的C末端结构域。该结构域指来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1834-2366以及它们在不同菌株中的等同物，来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的氨基酸1834-2366的序列对应于SEQ ID N0:2的氨基酸 1834-2366。
[0042]艰难梭菌毒素A和B是保守蛋白，然而，该序列在菌株间有少量差别，此外，不同菌株中的毒素A和B的氨基酸序列可能在许多氨基酸上有所不同。
[0043]因此，本发明考虑术语毒素A重复结构域和/或毒素B重复结构域指这样的序列，其是与SEQ ID NO:1的氨基酸1832-2710具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体或与SEQ ID NO: 2的氨基酸1834-2366具有90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的变体。在一个实施方案中，‘变体’是通过保守性氨基酸取代(由此，残基由具有相同物理化学性质的另一个残基所取代)而与参照多肽有所不同的多肽。通常这样的取代在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间;在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间，并在碱性残基Lys和Arg之间；或在芳香族残基Phe和Tyr之间。在一个实施方案中，‘片段’是包含多肽的至少250个氨基酸的连续部分的多肽。
[0044]此外，在来自一种菌株的毒素A (或毒素B)与来自另一种菌株的毒素A (或毒素B)的C末端结构域之间，氨基酸编号可以有所不同。由于这一原因，术语‘不同菌株中的等同物’是指，对应于参考菌株(例如艰难梭菌VPI10463)的那些，但发现于来自不同菌株的毒素中并且可能因此而编号不同的氨基酸。可以通过比对来自不同菌株的毒素的序列来确定‘等同物’氨基酸的区域。全文中提供的氨基酸编号指菌株VPI10463的编号。
[0045]术语多肽或蛋白的‘片段’指来自该多肽或蛋白的至少200、230、250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的连续部分。术语‘第一片段’指毒素A 重复结构域的至少 250、300、350、380、400、450、480、500、530、550、580 或 600 个氨基酸的连续部分。术语‘第二片段’指毒素B重复结构域的至少200、230、250、280、300、350、400、450或500个氨基酸的连续部分。
[0046]术语‘第一近端’指第一片段(Tox A片段)的末端，其与第二片段(ToxB片段)共价连接或与第一和第二片段之间的接头序列共价连接。术语‘第二近端’指第二片段的末端，其在一级结构(氨基酸序列)上与第一片段最接近。
[0047]图2显示了 ToxA和ToxB的C末端结构域的构成。毒素A的C末端结构域由8个重复部分(命名为重复部分1、重复部分I1、重复部分II1、重复部分IV、重复部分V、重复部分V1、重复部分VII和重复部分VIII)构成，这些重复部分的每一个可以进一步分为在图2中表示为白色方框的短重复(SRs)和在图2中表示为黑色方框的长重复(LRs)(除了 ToxA重复部分VIII，其不具有长重复)。长重复的每一个与其他长重复具有某些结构和序列相似性。类似地，短重复彼此之间具有某些序列和结构相似性。类似地，毒素B的C末端由5个细分为SRs和LRs的重复部分构成。每一个重复部分包含一个LR和2-5个SRs (除了 Tox B重复部分V，其不具有长重复)。对于本公开的目的，短语‘重复部分’指ToxA的八个重复部分(命名为1、I1、II1、IV、V、V1、VII和VIII)中的一个或ToxB的五个重复部分(命名为1、I1、II1、IV或V)中的一个。如本文所用，术语‘第一重复部分’指来自毒素A重复结构域的重复部分(或部分的重复部分)。术语‘第二重复部分’指来自毒素B重复结构域的重复部分(或部分的重复部分)。对于本公开的目的，术语‘长重复’指如图2中黑色方框所示的LR结构域之一。对于本公开的目的，术语‘短重复’指如图2中白色方框所示的SR结构域之一。
[0048]因此，例如，ToxA的重复部分I包含三个SRs和一个LR，其可以分别称为ToxA的第一个SR1、ToxA的第二个SR1、ToxA的第三个SRI和ToxA的LRI。
[0049]如果第一片段在处于该重复部分内的氨基酸处终止(即第一近端仅包含部分的重复部分序列)，则认为第一个近端在‘重复部分’内。类似地，如果第二片段在处于该重复部分内的氨基酸处终止，则认为第二近端在‘重复部分’内。例如，如果第一片段以VPI10463的氨基酸1832-1924 (包括在内的)或它们在另一菌株中的等同物的任何一个氨基酸终止，则第一近端在‘ToxA的重复部分I’内。如果第一片段在处于‘长重复’或‘短重复’内的氨基酸处终止，则第一近端在‘长重复’或‘短重复’内，类似地，如果第二片段在处于‘长重复’或‘短重复’内的氨基酸处终止，则第二近端在‘长重复’或‘短重复’内。
[0050]已经确定了来自菌株VPI10463 (ATCC43255)的毒素A和毒素B的每一结构域的氨基酸位置。这些如下:
【权利要求】
1.一种多肽，其包含第一片段和第二片段，其中 (i)所述第一片段是毒素A重复结构域片段； (?)所述第二片段是毒素B重复结构域片段； (iii)所述第一片段包含在第一重复部分内的第一近端； (iv)所述第二片段包含在第二重复部分内的第二近端；并且 其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有序列相似性。
2.权利要求1的多肽，其中所述第一重复部分和所述第二重复部分彼此具有高度结构相似性。
3.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述多肽诱导中和毒素A或毒素B或两者的抗体。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多肽在哺乳动物宿主中诱导针对艰难梭菌菌株的保护性免疫应答。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述第一片段和所述第二片段包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋结构。
6.权利要求1-5中任一项的多肽,其中所述第一片段和所述第二片段包含多于25%、30%、35%、38%或40%的β折叠结构。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VII或重复部分VIII内。
8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重复部分II或重复部分I内。
9.权利要求7的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VII内。
10.权利要求8的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重复部分II内。
11.权利要求ι-?ο中任一项的多肽，其中所述第一近端在长重复内。
12.权利要求1-11中任一项的多肽，其中所述第二近端在长重复内。
13.权利要求1-12中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的长重复VII(氨基酸 2614-2644)内。
14.权利要求13的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2620-2660内。
15.权利要求1-14中任一项的多肽，其中所述第二近端在毒素B的长重复II(氨基酸2028-2057)内。
16.权利要求15的多肽，其中所述第一近端在毒素B的氨基酸2030-2050内。
17.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一片段包含至少100、250、300、350、400、450或500个氨基酸。
18.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二片段包含至少100、200、300或400个氨基酸。
19.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽还包含接头。
20.权利要求19的多肽，其中所述接头包含1-20个之间的氨基酸。
21.权利要求19-20中任一项的多肽，其中所述接头是甘氨酸接头。
22.权利要求19-21中任一项的多肽，其中所述接头在所述第一片段的近端和所述第二片段的近端之间。
23.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是更大的融合蛋白的一部分。
24.—种多核苷酸,其编码权利要求1-23中任一项的多肽。
25.—种载体,其包含权利要求24的多核苷酸。
26.权利要求25的载体，其还包含诱导型启动子。
27.权利要求26的载体，其中通过加入足量的IPTG激活所述诱导型启动子。
28.—种宿主细胞,其包含权利要求25-27中任一项的载体或权利要求24的多核苷酸。
29.权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
31.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-23中任一项的多肽和药学上可接受的赋形剂。
32.权利要求31的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
33.权利要求31-32中任一项的免疫原性组合物，其还包含额外抗原。
34.权利要求33的免疫原性组合物，其中所述额外抗原是来源于选自以下的细菌的抗原:肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、大肠杆菌、卡他莫拉氏菌、破伤风、白喉、百日咳、表皮葡萄球菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
35.权利要求31-34中任一项的免疫原性组合物，其还包含来自于艰难梭菌的糖。
36.一种疫苗，其包含权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
37.权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物或权利要求36的疫苗在治疗或预防艰难梭菌疾病中的用途。
38.权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物或权利要求36的疫苗，其用于治疗或预防艰难梭菌疾病。
39.权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物或权利要求36的疫苗在制备用于预防或治疗艰难梭菌疾病的药物中的用途。
40.预防或治疗艰难梭菌疾病的方法，其包括向患者施用权利要求31-35中任一项的免疫原性组合物或权利要求36的疫苗。
【文档编号】A61K39/08GK103732750SQ201280037466
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年5月25日 优先权日:2011年5月27日
【发明者】C.卡斯塔多 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司