重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂的制作方法

重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂的制作方法
【专利摘要】本申请提供成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的稳定化制剂，所述制剂含有糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂。与非稳定化组合物相比，本发明所公开的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂在储存和/或经受机械应力时保留较大量的成对碱性氨基酸蛋白酶活性和单体成对碱性氨基酸蛋白酶含量，同时减少成对碱性氨基酸蛋白酶聚集。还提供用于稳定地稀释成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的方法。
【专利说明】重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月2日提交的美国临时申请号61/492，712的权益，出于所有的目的，所述申请的内容明确地以引用的方式整体并入本文。
[0003]应用领域
[0004]本申请总体上涉及蛋白质制剂的领域。
[0005]发明背景
[0006]蛋白水解哺乳动物枯草杆菌蛋白酶样蛋白原转化酶(SPC或PC)家族与细菌枯草杆菌蛋白酶和酵母Kex2p同源。迄今为止，已经鉴别出SPC家族的七个不同成员，包括成对碱性氨基酸蛋白酶(furin)、PC1 (还称为 PC3)、PC2、PACE4、PC4、PC5 (还称为 PC6)、PC7(LPC、PC8、或SPC7)，其各自展现出独特的组织分布。
[0007]成对碱性氨基酸蛋白酶，还称为PACE (成对碱性氨基酸裂解酶)普遍表达于所有哺乳动物组织和细胞系中，并且能够加工分泌途径中的广泛范围的生物活性前体蛋白，还包括激素、生长因子、受体、病毒和细菌蛋白、以及血浆蛋白。它是结构上安排成几个域的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，所述域即信号肽、前肽、催化结构域、中间结构域(还称为homo-B或P结构域)、C末端定位的富含半胱氨酸的结构域、跨膜结构域以及胞质尾区。成对碱性氨基酸蛋白酶的蛋白酶裂解位点包含识别序列，其特征为氨基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka 等，J Biol Chem.1991;266:12127-30)。
[0008]成对碱性氨基酸蛋白酶属于蛋`白原转化酶家族并且依赖于钙(Ca2+)。成对碱性氨基酸蛋白酶特异性地裂解在I位和4位处含有精氨酸的特定序列内的C末端的精氨酸肽键。这种序列可以在许多人蛋白质中发现，从而表明成对喊性氣基Ife蛋白酶在多种人蛋白原的成熟过程中起着重要作用。因此，成对碱性氨基酸蛋白酶是将潜在的前体蛋白加工成其生物活性产物的蛋白原转化酶。成对碱性氨基酸蛋白酶是使前体蛋白在其成对碱性氨基酸加工位点处裂解的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶。成对碱性氨基酸蛋白酶的一种底物是冯.维勒布兰德(von Willebrand)因子(vffF)。
[0009]成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)能够通过裂解VWF的Arg741-Ser742肽键来将前VWF (原冯?维勒布兰德因子)转化成成熟VWF。这一成熟步骤是(例如)提供冯.维勒布兰德病B型的疗法的rVWF产生过程的一部分。活化重组蛋白质的产生具有高度临床和诊断重要性。例如，活性或成熟蛋白质(像成熟VWF)可以用于控制凝血。
[0010]成对碱性氨基酸蛋白酶制剂,特别是重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinantfurin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))制剂经常由于来自蛋白质降解(经常来自成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质的自身裂解)的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性损失而具有较短的保质期(少于6个月)。此外，当用于某些产生过程(如产生成熟vWF)时，重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂经常被稀释200倍，并且稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶通常显示不成比例的活性损失。因此，在本领域中需要使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组成物稳定化的方法和制剂，以及用于稀释浓成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物而不损失大部分成对碱性氨基酸蛋白酶活性的方法。
[0011]发明概述
[0012]通过提供用于使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)稳定化的方法和制剂，本公开实现了成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)配制、储存、以及操作领域中的这些和其它需求。通过添加糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂显著增加成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物在储存和机械应力过程中的稳定性的发现，使这些需求至少部分地得到满足。
[0013]因此，本发明提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，特别是高度稳定化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂与起始(对照)成对碱性氨基酸蛋白酶制剂相比在高温、搅拌以及不同PH条件下显示出增加的稳定性。
[0014]一方面,本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物,所述组合物包含:8，000U/mL至500，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；100mM至300mM药学上可接受的盐；0.5mM至2mM钙；2%至20%糖或糖醇；10ppm至200ppm非离子型表面活性剂；IOmM至200mM缓冲剂；以及5.5 至 7.5 的 pH。
[0015]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含150mM至250mM药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含190± IOmM药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含190mM药学上可接受的盐。
[0016]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。
[0017]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含0.9±0.2mM钙。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含0.92mM钙。
[0018]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含5%至15%糖或糖醇。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含10%糖或糖醇。
[0019]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，糖或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合组成的组。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，糖或糖醇是蔗糖。
[0020]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含IOppm至IOOppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含50ppm至IOOppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
[0021]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
[0022]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含50mM至150mM缓冲剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含90± IOmM缓冲剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含9ImM缓冲剂。
[0023]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，缓冲剂包含乙酸盐。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中， 缓冲剂包含HEPES。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，缓冲剂包含MES。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，缓冲剂包含乙酸盐和HEPES。
[0024]在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含25mM至75mM乙酸盐和25mM至75mMHEPES。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含45±5mM乙酸盐和45±5mM HEPES。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含45mM乙酸盐和46mM HEPES。
[0025]在一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至7.0的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至6.5的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0±0.2的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0的pH。
[0026]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37°C下储存时具有增加的稳定性。
[0027]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37°C下储存时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0028]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37°C下储存时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
[0029]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时具有增加的稳定性。
[0030]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0031]在以上所提供的组合物的一`个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
[0032]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时具有增加的稳定性。
[0033]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
[0034]在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
[0035]一方面,本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物,所述组合物包含:8，000U/mL至500，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；190mM氯化钠；0.92mM钙；10%海藻糖；75ppm聚山梨酯80 ；45mM乙酸；46mM HEPES ；以及5.5至7.5的pH。
[0036]在一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至7.0的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至6.5的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0±0.2的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0的pH。
[0037]一方面，本公开提供一种用于稀释重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的方法,所述方法包括向所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物添加包含IOppm至200ppm非离子型表面活性剂的稀释缓冲液，从而形成稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物。
[0038]在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释缓冲液包含IOppm至IOOppm非离子型表面活性剂。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液包含50ppm至IOOppm非离子型表面活性剂。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液包含75ppm非离子型表面活性剂。
[0039]在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释缓冲液具有5.5至7.5的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有5.5至6.5的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有6.0±0.2的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有6.0的pH。
[0040]在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少50%存在于稀释前的重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
[0041]在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少75%存在于稀释前的重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
[0042]一方面,本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂,所述制剂包含:8，000U/mL至
52,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；lmM至300mM药学上可接受的盐；0.1mM至2mM氯化钙；1%至20%糖和/或糖二水合物；50ppm至IOOppm表面活性剂；以及ImM至IOOmM羧酸、浓度足以维持4.0至 7.0的pH的缓冲剂、或所述羧酸和所述缓冲剂二者。
[0043]在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含180mM至200mM盐。
[0044]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，盐是氯化钠。
[0045]在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含0.5mM至1.0mM钙。
[0046]在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含5%至15%糖或糖二水合物。
[0047]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，糖或糖二水合物选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合组成的组。
[0048]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。
[0049]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，表面活性剂以约65ppm至约85ppm的浓
度存在。
[0050]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，羧酸是乙酸。
[0051]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，羧酸的浓度是35mM至55mM。
[0052]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。
[0053]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，缓冲剂的浓度是约20ppm至约lOOpprn。
[0054]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，所述制剂与不含糖或糖二水合物的制剂相比在于37°C下储存之后显示出改进的稳定性。
[0055]在以上所提供的制剂的一个实施方案中，通过向包含1%聚山梨酯80、500mMHEPES、400mM乙酸、ImM氯 化钙、以及海藻糖二水合物粉末的组合物添加重组成对碱性氨基酸蛋白酶来制备所述制剂，其中所述组合物在添加至所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶之前具有6.0的pH。
[0056]一方面,本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂,所述制剂包含:8，000U/mL至57，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；190mM氯化钠；0.92mM氯化钙；10%w/w海藻糖二水合物；75ppm聚山梨酯80 ；45mM乙酸；以及46mM HEPES。
[0057]一方面,本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂,所述制剂包含:(a)8，000U/mL至52，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(b) ImM至300mM药学上可接受的盐；(c) 0.1mM至2mM氯化|丐；(d) 1%至20%糖和/或糖二水合物；(e) 50ppm至IOOppm表面活性剂；以及
(f)1mM至IOOmM羧酸、或浓度足以维持4.0至7.0的pH的缓冲剂、或所述羧酸和所述缓冲剂二者。
[0058]附图简述
[0059]图1.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的温度研究。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在室温、37°C或45°C下孵育至多7天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的活性相对于孵育天数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0060]图2.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的温度研究。使用SEC来分析与图1中相同的样品。相对重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于孵育天数进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
[0061]图3.使用SEC分析在37°C下孵育的对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37°C下孵育7天。图3示出在280nm下六个时间点的SEC吸收特征的叠合图。与图1中相同的研究。
[0062]图4.使用蛋白质印迹法分析在室温和37°C下孵育的对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。与图1中相同的研究。泳道=(I)MWM标记；(2)T=0 ;(3)在室温下孵育I天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(4)在室温下孵育2天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(5)在室温下孵育3天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(6)在室温下孵育7天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(7)MWM标记；(8)在37°C下孵育I天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(9)在37°C下孵育2天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(10)在37°C下孵育3天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；以及(11)在37°C下孵育7天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
[0063]图5.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的冷冻/解冻研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0064]图6.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。
[0065]图7.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用活性测定分析的搅拌研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于搅拌时间进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4o
[0066]图8.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于搅拌时间进行绘图。
[0067]图9.使用蛋白质印迹法比较不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。使用蛋白质印迹法分析不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。产生次序按字母顺序表示。泳道= (I)MWM标记；(2)成对碱性氨基酸蛋白酶参考；(3)03-04-09(批次018342，2mL 小瓶)；(4) 03-08-09 (批次 018365，2mL 小瓶)；(5) 03-15-09 (批次 018366，2mL 小瓶)；(6) 03-01-09 (批次 018315，2mL 小瓶)；(7) 07-26-10 (批次 X572，200mL 瓶子)；
(8)03-06-09(批次 018365, 200mL 瓶子);(9) 08-01-10 (批次 X576，200mL 瓶子)；
(10)03-09-09(批次018366，200mL瓶子)；(Il)MWM标记；(12)成对碱性氨基酸蛋白酶参考；(13) 08-03-10 (批次 X577, 200mL 瓶子)；(14) 07-24-10 (批次 X573, 200mL 瓶子);(15) 07-30-10 (批次 X575, 200mL 瓶子)；(16)018346 (在-80 V 下的 QC 稳定性)；
(17)018346 (在-25 V下的QC稳定性)；(18)018315 (在-80 V下的QC稳定性)；以及
(19)018315(在-25°C下的 QC 稳定性)。
[0068]图10.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的融化方法对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的影响。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品活性以在4°C (左)抑或室温(RT ;右)下解冻的不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的条形图的形式示出。误差棒是土 I标准偏差；n=4。
[0069]图11.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的pH5和pH5.5对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37°C下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0(对照制剂)下孵育至多7天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的活性相对于孵育天数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0070]图12.使用SEC分析的pH5和pH5.5对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在3`7°C下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0 (对照制剂)下孵育。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于孵育天数进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
[0071]图13.使用SEC分析的在37°C下对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点:T=0、孵育I天以及4天。
[0072]图14.使用SEC分析的MES(ρΗ6.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以MES (最终C=IOOmM,ρΗ6.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点:T=0、孵育I天以及4天。
[0073]图15.使用SEC分析的HEPES(ρΗ7.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以HEPES(最终C=IOOmM, ρΗ7.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点:T=0、孵育I天以及4天。
[0074]图16.使用SEC分析的HEPES (ρΗ8.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以HEPES(最终C=IOOmM, ρΗ8.0)并且在37°C下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点:T=0、孵育I天以及4天。
[0075]图17.使用SEC分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80添加剂对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。将样品在37°C下孵育四天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于孵育时间进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
[0076]图18.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80对对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品:无添加剂的对照制剂、对照制剂加10%蔗糖、以及对照制剂加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差=4。
[0077]图19.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下蔗糖和聚山梨酯80对MES缓冲液中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品:无添加剂的对照制剂、掺以MES (最终C=IOOmM, pH6.0)、掺以MES (最终C=IOOmM, pH6)加10%蔗糖、以及掺以MES (最终C=IOOmM, pH6.0)加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0078]图20.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下对照制剂与MES缓冲液中的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的比较。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品:无添加剂的对照制剂、对照制剂加10%蔗糖、以及掺以MES (最终C=IOOmM, pH6.0)加10%蔗糖。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0079]图21.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下蔗糖与甘露糖醇中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的比较。所有样品均掺以HEPES/乙酸，pH6.0。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品:无添加剂、10%蔗糖、10%甘露糖醇、10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80、以及10%甘露糖醇加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是标准偏差；n=4。
[0080]图22.在37°C下的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性:使用SEC分析的蔗糖对甘露糖醇。使用SEC分析与图21中相同的样品。相对重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于孵育时间进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
[0081]图23.由成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定检验在37 °C下不同量的海藻糖和聚山梨酯80对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。首先，将所有样品均掺以HEPES和乙酸(最终浓度:HEPES - 50mM，乙酸-50mM，pH6.0)，然后添加10%蔗糖抑或不同量的海藻糖和/或聚山梨酯80。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。将数据从在37°C下孵育5天后的最高活性值至最低活性值进行排序(各对中的右侧条)。各对中的左侧条描绘在时间零点处的成对碱性氨基酸蛋白酶活性值。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0082] 图24.在37°C下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。在重新计算后展示与图23中相同的样品以便示出在37°C下孵育5天后各样品剩余的初始活性的百分比。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。误差棒是±1标准偏差；n=4o
[0083]图25.使用SEC分析的在37°C下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图24中相同的样品。图示出在37°C下孵育5天后各样品剩余的初始重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值的百分比。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品O
[0084]图26.使用蛋白质印迹法分析的在35°C下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图24中相同的样品。使样品成对:第一样品-时间零点，第二样品-在37°C下孵育5天。泳道:(I) MWM标记；(2)成对碱性氨基酸蛋白酶参考，(3)对照；(4)对照制剂，T=O ; (5)对照制剂，5天；(6) 10%蔗糖，T=O ; (7) 10%蔗糖，5天；(8)2%海藻糖，T=O ; (9)2% 海藻糖，5 天；(10) 10% 海藻糖，T=O ; (11) 10% 海藻糖，5 天；(12)MWM 标记；(13)成对碱性氨基酸蛋白酶参考;(14)对照；(15) 5%海藻糖，T=O ； (16) 5%海藻糖，5天；(17) 5%海藻糖，+IOppm 吐温 80, T=O ； (18) 5% 海藻糖，+IOppm 吐温 80, 5 天；(19) 5% 海藻糖，+25ppm吐温 80，T=O ； (20) 5% 海藻糖，+25ppm 吐温 80，5 天；(21) 5% 海藻糖，+IOOppm 吐温 80，T=O ；以及(22) 5%海藻糖，+IOOppm吐温80，5天。
[0085]图27.在37°C下孵育5天后测试的海藻糖含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。与图24中相同的实验。首先，将所有样品均掺以HEPES和乙酸(最终浓度:HEPES - 50mM,乙酸-50mM，pH6.0)，然后添加不同量的海藻糖。在37°C下孵育5天后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于添加至样品中的海藻糖的百分比进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0086]图28.孵育5天后使用SEC分析的在37°C下海藻糖含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。与图27中相同的实验。在37°C下孵育5天后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于添加至样品中的海藻糖的百分比进行绘图。
`[0087]图29.在37°C下孵育5天后测试的聚山梨酯80含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。与图24中相同的实验。首先，将所有样品均掺以HEPES、乙酸(最终浓度:HEPES - 50mM,乙酸-50mM，pH6.0)、以及5%海藻糖，然后添加不同量的聚山梨酯80。在37°C下孵育5天后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于添加至样品中的聚山梨酯80的量进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0088]图30.孵育5天后使用SEC分析的在37°C下聚山梨酯80含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。与图29中相同的样品。在37°C下孵育5天后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于添加至样品中的聚山梨酯80的量进行绘图。
[0089]图31.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的搅拌研究。高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以不同量的聚山梨酯80。图示出在搅拌三小时之前和之后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性值。数据从最高活性至最低活性进行排序。误差棒是±1标准偏差；n=4。各对中的左侧条示出在时间O处的活性，各对中的右侧条示出搅拌后的活性。
[0090]图32.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。与图31中相同的实验。图示出在搅拌三小时之前和之后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高。数据从最高至最低进行排序。各对中的左侧条示出在时间O处的活性，各对中的右侧条示出搅拌后的活性。
[0091]图33.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的搅拌研究中聚山梨酯含量的作用。与图32中相同的样品。搅拌三小时后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于聚山梨酯80的含量进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0092]图34.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究中聚山梨酯80的作用。与图32中相同的样品。搅拌三小时后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于聚山梨酯80的含量进行绘图。
[0093]图35.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。色谱图示出在280nm下SEC吸收特征的叠合图，比较在搅拌三小时之前和之后对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。搅拌的样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值显著小于对照样品。观察到搅拌的样品中高分子质量峰的缺乏(参见用于解释的第3.5.1段)。
[0094]图36.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的UV光谱(与图35中相同的样品)。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示倾斜并且极度升高的特征，这指示搅拌的样品中显著水平的聚集体的存在。
[0095]图37.无聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示升高的特征，这指示搅拌的样品中显著水平的聚集体的存在。
[0096]图38.无聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。色谱图示出在280nm下SEC吸收特征的叠合图，比较在搅拌三小时之前和之后无聚山梨酯80的 高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。搅拌的样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值显著小于对照样品。观察到高分子质量峰的缺乏。
[0097]图39.含有IOppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示稍微升高的特征，这指示搅拌的样品中聚集体的存在。相对于在无聚山梨酯的样品中见到的光谱(图36和图37)，“搅拌”的光谱与“搅拌前”的光谱接近，这指示聚集水平低于在无聚山梨酯的样品中见到的聚集水平。
[0098]图40.含有25ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示稍微升高的特征，这指示搅拌的样品中少量聚集体的存在。
[0099]图41.含有50ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱显示与搅拌前的样品非常类似的特征。光谱既不倾斜也不升高，这指示样品均不含有大量较大聚集体。
[0100]图42.含有IOOppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱显示与搅拌前的样品非常类似的特征。光谱既不倾斜也不升高，这指示样品均不含有大量较大聚集体。
[0101]图43.高度稳定化的制剂 中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的冷冻/解冻研究。将高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以不同量的聚山梨酯80。数据显示在5个冷冻/解冻循环之前和之后样品中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。将数据从最高至最低进行排序。误差棒是±I标准偏差；n=4。
[0102]图44.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。与图43中相同的样品。数据显示在5个冷冻/解冻循环之前和之后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高。将数据从最高至最低进行排序。
[0103]图45.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。与图44中相同的样品。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。相对峰高以第一个冷冻/解冻循环前重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
[0104]图46.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。对照制剂抑或高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37°C下孵育4天。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0105]图47.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37°C下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。重新计算与图46中相同的样品。各样品的相对活性以其初始活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0106]图48.使用SEC分析的在37°C下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图46中相同的样品。各样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高以其初始峰高的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
[0107]图49.温度对高度稳定化的制剂储备缓冲液(500mM HEPES、400mM乙酸、ImMCaCl2, ρΗ6.0)的pH (B)和传导率(A)的作用。
[0108]发明详述
`[0109]1.前言
[0110]本公开是部分基于以下发现:成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物可以通过添加糖、糖醇、以及非离子型表面活性剂而针对各种化学和机械应力稳定化。与缺乏糖、糖醇以及非离子型表面活性剂的类似成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物在室温或高于室温下储存时以及在经受机械应力时显著更稳定。本公开还部分基于以下发现；向成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液添加非离子型表面活性剂能够在所述酶稀释至在制造不同重组生物制品(如VWF)过程中所使用的较低浓度时实现成对碱性氨基酸蛋白酶活性的较大恢复。
[0111]有利地，本文所描述的研究证明向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物添加糖或糖醇使所述组合物在储存一段时间时的稳定性增强。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含仅2%糖或糖醇可以使所述组合物的稳定性增加10%以上。进一步显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含10%糖或糖醇可以使所述组合物的稳定性增加75%以上。
[0112]有利地，本文所描述的研究还证明向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物添加非离子型表面活性剂使所述组合物在经受机械应力时的稳定性增强。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含仅IOppm非离子型表面活性剂可以使所述组合物的稳定性增加75%以上。
[0113]有利地，本文描述的研究还证明向成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液包含非离子型表面活性剂使成对碱性氨基酸蛋白酶稀释后的活性恢复增加。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液中包含75ppm非离子型表面活性剂使成对碱性氨基酸蛋白酶稀释后的活性恢复增加3至4倍。
[0114]因此，本公开提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的组合物。虽然本文的大部分讨论是依据重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂,但应理解任何成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质(包括从受试者分离的成对碱性氨基酸蛋白酶或成对碱性氨基酸蛋白酶的任何衍生物或突变体)可以包含于本发明的制剂中。
[0115]—方面，本公开提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，其在使制剂经受一种或多种应激物后测定时显示出优于对照制剂的改进的稳定性，这一种或多种应激物包括但不限于使制剂暴露于一系列温度、几个冷冻/解冻循环、和/或搅拌。通常通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性的水平来评定改进的稳定性——例如，在高于环境室温下储存之后，与各自在储存前(即，在时间=0时)的活性相比，高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂将显示出比在相同条件下储存的对照制剂更高的活性水平。本文描述用于评定成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性的方法。
[0116]在其它方面，本公开提供用于形成本发明的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的方法。所述方法包括用于针对储存(包括冷冻储存、在环境室温或高于环境室温下储存、或冻干)使成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂稳定化的方法。
[0117]在又其它方面，本公开提供用于稀释浓成对碱性氨基酸蛋白酶溶液的方法，所述方法在稀释之后引起成对碱性氨基酸蛋白酶活性的增加的保留。与用缺乏非离子型表面活性剂的溶液稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，根据本文所提供的方法稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶的水性组合物保留多3至4倍的酶活性。
[0118]I1.定义`
[0119]如本文所用，术语“成对碱性氨基酸蛋白酶”是指具有成对碱性氨基酸蛋白酶活性(特别是裂解前冯.维勒布兰德因子(前VWF)多肽的残基Arg-763与Ser_764之间的肽键的能力)的任何蛋白质或多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1 (人成对碱性氨基酸蛋白酶前蛋白原)的氨基酸序列相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1的氨基酸25-794 (人成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白原)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1的氨基酸108-794(人成熟成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。如本文所用，成对碱性氨基酸蛋白酶多肽还包括具有VWF裂解活性的成对碱性氨基酸蛋白酶的天然变体以及具有VWF裂解活性的修饰的成对碱性氨基酸蛋白酶构建体。如本文所用，成对碱性氨基酸蛋白酶包涵保留一些基本活性(例如，与野生型成对碱性氨基酸蛋白酶的活性相比至少 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高活性)的任何天然变体、替代序列、亚型或突变体蛋白。人群体中发现的成对碱性氨基酸蛋白酶突变的实例包括但不限于A43E、A43G、A43V、R50W、Y64C、L77P、R81C、E97A、E97V、V109M、V109L、R130W、A139V、P169T、N245S、E271K、Q339R、N407S、E457Q、R464W、K469R、S524Y、T536S、L570F、D624N、A642T、S685P、V7281、V7351、R745Q、P772L、以及 A793T。成对碱性氨基酸蛋白酶多肽还包括含有翻译后修饰的多肽。例如，已经显示成对碱性氨基酸蛋白酶在残基S773和S775处磷酸化并且预测成对碱性氨基酸蛋白酶在残基N387、N440、以及N553处糖基化。
[0120]在本公开的背景下，成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质包括重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽以及从源材料(例如，组织或血液)分离的天然成对碱性氨基酸蛋白酶多肽。成对碱性氨基酸蛋白酶多肽(重组和来源纯化的)及其生物活性衍生物可以源自任何适合的生物体，例如哺乳动物，如灵长类动物、人类、猴子、兔、猪、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬、猫。还包涵具有VWF裂解活性的突变体和变体成对碱性氨基酸蛋白酶多肽以及功能片段以及包含成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的融合蛋白。此外，本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽可以进一步包含有助于纯化、检测或二者的标签。本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽可以进一步用治疗性部分或适合用于体外或体内成像的部分进行修饰。
[0121]可以通过在细胞培养物(例如,哺乳动物细胞培养物)中表达来制备蛋白水解活性重组成对碱性氨基酸蛋白酶。用于制备重组成对碱性氨基酸蛋白酶的表达和纯化方法的非限制性实例描述于W01991/06314、W01992/09698、美国专利号6，210, 929和6，596，526以及美国专利申请公布号2009/0181423和2009/0304669中，出于所有目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。
[0122]如本文所用，“活性”是指成对碱性氨基酸蛋白酶或其部分的与全长(完全)蛋白质相关的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于生物活性，包括参与蛋白原底物的蛋白水解成熟过程和测试底物(如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID N0:1;AMC=7_氨基-4-甲氧基香豆素))的裂解。成对碱性氨基酸蛋白酶的底物包括冯？维勒布兰德因子、甲状旁腺激素原(proparathyroid hormone)、转化生长因子β I前体、原白蛋白(proalbumin)、原β -分泌酶、膜I型基质金属蛋白酶、以及原神经生长因子的β亚单位。在一个实施方案中，一个单位(U)的成对碱性氨基酸蛋白酶活性被定义为每分钟使IpmolAMC从Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1)释放的成对碱性氨基酸蛋白酶的量。
[0123]如本文所用，术语“稳定性”(如成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性或成对碱性氨基酸蛋白酶制剂稳定性)用于结构背景(例如，与蛋白质的结构完整性有关)或功能背景(例如，与蛋白质随时间推移保留其功能和/或活性的能力有关)中。应理解，所讨论的蛋白质可以包含于根据本文所描述的方法和组合物的制剂内，并且所述蛋白质的稳定性是指其在所述制剂中的稳定性。在一个实施方案中，通过测量成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的成对碱性氨基酸蛋白酶活性来测定所述组合物的稳定性。例如，通过使用可检测的成对碱性氨基酸蛋白酶底物，如 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1 ;例如，由 Enzo LifeSciences 出售的 ALX-260-040-M001)，例如在如 Malloy SS 等，J Biol Chem.1992 年 8 月15日；267 (23):16396-402中所描述的测定中，出于所有的目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，将如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性与未用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进行比较。
[0124]如本文所用，“储存稳定”的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物是指已经被配制以便使蛋白质在给定储存时间 内在溶液中的稳定性增加(例如至少10%)的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液)。在本公开的背景下，可以通过添加糖、糖醇或非离子型表面活性剂作为稳定剂来使成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液)“储存稳定”。在一些实施方案中，可以(例如)通过监测一段时期内聚集体的形成、整体酶活性的损失或降解产物的形成来测量成对碱性氨基酸蛋白酶多肽在任何给定制剂中的稳定性。制剂的绝对稳定性和糖、糖醇或非离子型表面活性剂的稳定作用将取决于正稳定化的具体组合物而变化。在一个实施方案中，通过测量成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的成对碱性氨基酸蛋白酶活性来测定所述组合物的稳定性。例如，通过使用可检测的成对碱性氨基酸蛋白酶底物，如 Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID N0:1;例如，由 Enzo Life Sciences 出售的 ALX-260-040-M001)，在(例如)如 Malloy SS 等，J Biol Chem.1992 年 8 月 15日；267 (23):16396-402中所描述的测定中，出于所有的目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。在一个实施方案中，将如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性与未用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进行比较。
[0125]如本文中所用，“保质期”是指制剂在预定温度下维持预定的稳定性水平的一段时间。在具体实施方案中，预定温度是指冷冻(例如，-80°C、-25°C、0°C )、冷藏(例如，(TC至IO0C )、或室温(例如，18°C至32°C )储存。
[0126]如本文所用，术语“稳定性时间”是指制剂被认为是稳定的持续时间。例如，制剂的稳定性时间可以指制剂中的蛋白质聚集和/或降解的水平保持在某一阈值(例如，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%,20%,等等)以下的持续时间，和/或制剂维持生物活性在某一阈值(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%，等等)以上的持续时间，该阈值为在储存期开始时制剂中所存在的活性的量的阈值。
[0127]在本公开的背景下，与未用糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂配制的相同成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的组合物相比，用糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂配制的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽)的水性组合物将具有较长的稳定性时间。在一些实`施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的水性组合物将具有比在缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的情况下配制的相同组合物的稳定性时间高例如至少10%的稳定性时间，或具有比在缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的情况下配制的相同组合物的稳定性时间高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或至少 2 倍、或至少 2.5 倍、3.0 倍、3.5 倍、4.0 倍、4.5 倍、5.0 倍、
5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10倍或更多倍的稳定性时间。
[0128]如本文所用，“储存”意指制剂在制备后不立即施用至受试者或用于产生过程中，而在使用前在特定条件(例如，特定温度)下保持一段时间。例如，成对碱性氨基酸蛋白酶制剂可以在施用至受试者之前在不同温度(如冷冻(例如，-80°c, -25°c、0°c )、冷藏(例如，(TC至10°C)、或室温(例如，18°C至32°C))下保持数天、数周、数月或数年。应理解，所述制剂可以是液体或冻干制剂。
[0129]如本文所用，术语“约”表示指定值加10%或减10%的近似范围。例如，措辞“约20%”包涵18%至22%的范围。
[0130]如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“不大于X”和“O至X”是等效的并且是指O与X之间并且包括O和X的任何浓度。例如，短语“不大于2%的浓度”和“0%至2%的浓度”是等效的并且包括0%、1%以及2%。
[0131]如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“不小于X”是指X或X以上的任何浓度。例如，短语“不小于98%的浓度”包括98%、99%以及100%。
[0132]如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“X与Y之间”和“X至X”是等效的并且是指X与Y之间并且包括X和Y的任何浓度。例如，短语“49%与51%之间的浓度”和“49%至51%的浓度”是等效的并且包括49%、50%以及51%。
[0133]如本文所用，“糖”是指具有通式CxH2yOy (直链)或CxHi2y^Oy (环状)的单糖和通过脱水反应形成的由两个单糖单位组成的二糖。单糖可以根据它们所包含的碳原子数目分类为:乙糖(2)、丙糖(3)、丁糖(4)、戊糖(5)、己糖(6)、庚糖(7)，等等。因此，如本文所用，C(X)糖是指含有X数目的碳分子的糖。例如，C(5)糖是指戊糖，而C(6)糖是指己糖。可以用于本文所提供的制剂中的糖的非限制性实例包括:乙糖乙醇醛、丙糖甘油醛以及二羟基丙酮；丁糖，赤藓糖(erythrose)、苏糖(threose)、以及赤藓酮糖(erythrulose)；戍糖，阿拉伯糖(arabinose)、来苏糖(Iyxose)、核糖、木糖(xylose)、核酮糖、以及木酮糖(xylulose);己糖，阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖、塔罗糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖、山梨糖(sorbose)、以及塔格糖(tagatose);庚糖，景天庚酮糖(sedoheptulose)、甘露庚酮糖(mannoheptulose)、以及L-甘油-D-甘露-庚糖；以及由其形成的二糖的所有可能的组合，包括但不限于蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖(kojibiose)、黑曲霉糖(nigerose)、异麦芽糖、β, β-海藻糖、α, β-海藻糖、槐糖(sophorose)、昆布二糖(Iaminaribiose)、龙胆二糖(gentiobiose)、松二糖(turanose)、麦芽酮糖(maltulose)、帕拉金糖(palatinose)、gentiobiulose、甘露二糖(mannobiose)、蜜二糖(melibiose)、车前二糖(melibiulose)、芸香糖(rutinose)、rutinulose、以及木二糖(xylobiose)。
[0134]如本文所用，“糖醇”是指单糖或二糖的氢化形式，所述单糖或二糖的羰基已经被还原以便形成伯羟基或仲羟基。在一个实施方案中，糖醇具有约4至约8个碳原子。可以用于本文所提供的制剂中的糖醇的非限制性实例包括乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、岩藻糖醇(fucitol)、艾杜糖醇、倭勒米糖醇(volmitol)、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇(galactitol)、甜醇(dulcitol)、木糖醇、以及阿拉伯糖醇。
[0135]如本文所用，“药学上可接受的盐”是指药物制剂中安全施用至受试者(例如，人)的盐。药学上可接受的盐的选择和使用是本领域中熟知的，例如，参见Stahl和 ffermuth, Pharmaceutical Salts!Properties, Selection, and Use,第二 修订版，Wiley, Hoboken, New Jersey。在某些实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。
[0136]如本文所用，术语“非离子型表面活性剂”是指在生理相关条件下非离子化的表面活性剂。适用于本文所提供的稳 定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的非离子型表面活性剂的非限制性实例包括:非离子型水溶性甘油单酯、甘油二酯及甘油三酯(例如，丙二醇二辛酸酯/ 二癸酸酯(例如MKiLYOIf 840)、中链甘油单酯和甘油二酯(例如CAPMULr和IMWITOR? 72)、中链甘油三酯(例如辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯，如 LAVRAFAC、MIGLYOL*: 810 或 812、CRODAMOL* GTCC-PN、以及 S0FTIS0N378)、
长链甘油单酯(例如甘油单油酸酯，如PEGEOI^和甘油单亚油酸酯，如MAlSlNEit+
)、聚氧乙烯蓖麻油(例如聚乙二醇蓖麻油酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯、聚乙二醇十六基十八基醚))；聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯和二脂肪酸酯；非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN20)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯(SPAN20);脱水山梨糖醇单棕榈酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(TWEEN40)和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(SPAN40)；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(TWEEN60)和脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(SPAN60);脱水山梨糖醇单油酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN80)和脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN80);脱水山梨糖醇三油酸酯，如脱水山梨糖醇三油酸酯(SPAN85);以及脱水山梨糖醇三硬脂酸酯，如脱水山梨糖醇三硬
脂酸酯(SPAN65));聚乙二醇化甘油酯(例如，聚乙二醇-6甘油月桂酰酯(LabrafifM2130CS);聚乙二醇1000 丁二酸d-α-生育酚酯(TPGS)、聚乙二醇66012-羟基硬脂酸酯(SOLUTOL? HS15)、聚氧乙烯油酸酯和硬脂酸酯(例如PEG400单硬脂酸酯和PEG1750单硬脂酸酯))；非离子型水溶性三嵌段共聚物(例如聚(氧化乙烯)/聚(氧化丙烯)/聚(氧化乙烯)三嵌段共聚物，如甲基环氧乙烷与环氧乙烷的聚合物BHT( PLURONiC <F-127))。
[0137]在一个实施方案中，提供储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物，所述组合物包含选自以下的非离子型表面活性剂:非离子型水溶性甘油单酯、非离子型水溶性甘油二酯、非离子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯、聚乙二醇的非离子型水溶性二脂肪酸酯、非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、非离子型聚乙二醇化甘油酯、非离子型水溶性三嵌段共聚物、以及其组合。
[0138]如本文所用，术语“生物活性衍生物”在成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的背景下使用时还包涵经由重组DNA技术获得的多肽。这种技术可以包括用于以下的本领域中已知的任何方法:⑴通过遗传工程产生重组DNA，例如，经由反转录RNA和/或扩增DNA产生；(?)通过转染将重组DNA引入原核细胞或真核细胞中，例如，经由电穿孔或显微注射引入；(iii)培养所述转化细胞，例如，以连续或分批方式培养；(iv)表达成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，组成性表达或在诱导后表达；以及(V)分离所述成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，从培养基或通过收获转化细胞分离；以便(vi)获得大致上纯化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，经由离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法等获得。术语“生物活性衍生物”还包括嵌合分子，例如像成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质或其功能片段与第二多肽(例如，免疫球蛋白Fe结构域或白蛋白结构域)的组合，以便改进生物学/药理学特性，例如像成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质在哺乳动物(特别是人)的循环系统中的半衰期。[0139]除非上下文另外清楚地规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the) ”包括复数指代物。因此，例如，提及“缓冲剂”是指一种试剂或所述试剂的混合物，并且提及“方法”包括提及本领域技术人员已知的等效步骤和方法，诸如此类。
[0140]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于描述和公开描述于公布中并且可能与目前所描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂以及方法学的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。
[0141]如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内包涵所述范围的上限与下限之间的各插入值(至下限单位的十分之一)和在所陈述的范围中的任何其它陈述值或插入值。本发明内还包涵可以独立地包括于这些较小范围中的所述较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。如果所陈述的范围包括一或两个限值，那么排除任一个或两个所包括的限制的范围也包括于本发明中。
[0142]如本文所用，“BDS”是指“散装原料药”。
[0143]II1.重组成对碱性氨基酸蛋白酶的稳定化水性组合物
[0144]一方面，本公开提供成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的稳定化水性制剂。以下实施方案是部分基于以下发现:与缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的组合物相比，糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的包含使成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物稳定化。
[0145]如本领域技术人员将认识到，除明确公开的组分之外，根据本文所提供的实施方案配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)还可以包含通过包含溶液组分或pH调节剂贡献的平衡离子，例如，从乙酸盐、氢氧化钠或氢氧化钾贡献的钠或钾，或由氯化钙或盐酸贡献的氯。在本公开的背景下，如在特定PH下的配制过程所需要，由给定制剂组成或主要上由给定制剂组成的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)可以进一步包含一种或多种平衡离子。
[0146]在一个实施方案中，本文所提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在室温(即，18°C与32°C之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的免疫球蛋白水性组合物在于室温下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在室温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、U、12、13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少I个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48个月或更多个月。在某些实施方案中，室温是指在20°C与30°C之间、在21°C与29°C之间、在22°C与28°C之间、在23°C与27°C之间、在24°C与26°C之间、或约25°C。在具体实施方案中，组合物在于20°C与25°C之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
[0147]在一个实施方案中，本文所 提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在冷藏温度(即，2°C与10°C之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的水性免疫球蛋白组合物在于冷藏温度下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在冷藏温度下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少I个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48个月或更多个月。在具体实施方案中，组合物在于2°C与8°C之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
[0148]在一个实施方案中，本文所提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在高温(即，32°C与42°C之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的水性免疫球蛋白组合物在于高温下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在高温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少I个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48个月或更多个月。在具体实施方案中，组合物在于35°C与40°C之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
[0149]在一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物维持至少40%的在储存期开始时(例如，在时间=0时)所存在的成对碱性氨基酸蛋白酶活性,所述组合物就被认为是储存稳定的。在另一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物维持至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的在储存期开始时(例如，在时间=0时)所存在的成`对碱性氨基酸蛋白酶活性，所述组合物就被认为是储存稳定的。在一个实施方案中，在如Malloy SS等，J Biol Chem.1992年8月15日；267 (23):16396-402中所描述的测定中测量成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
[0150]在一个实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少10%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。
[0151]在一个实施方案中，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在其它实施方案中，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。
[0152]在一个实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少10%的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。
[0153]在一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物在经受机械应力之后维持至少40%的起始成对碱性氨基酸蛋白酶活性(例如，在时间=0时)，所述组合物就被认为是稳定的。在另一个实施方案中，只要储存的组合物在经受机械应力之后维持45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的起始成对碱性氨基酸蛋白酶活性(例如，在时间=0时)，所述组合物就被认为是稳定的。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
[0154]在一个实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少10%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
[0155]在一个实施方案中，在经受机械应力之后，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在其它实施方案中，在经受机械应力之后，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于 45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11 %、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、I % 或更少，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
[0156]在一个实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少10%的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
[0157] 虽然本申请中所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂可以以指示的浓度冻干和复原，但应理解这些制剂还可以以更稀释的形式复原。例如，为冻干的和/或通常以2mL溶液复原的根据本公开的制剂还可以以较大体积的稀释剂(如5mL)复原。同样地，冻干的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂还可以以更浓的形式复原。例如，为冻干的和/或通常以2ml溶液复原的根据本公开的制剂还可以以较小体积(如ImL)复原。
[0158]有利地，一方面，将本发明的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂与稀释剂组合，所述稀释剂在所得到的组合物用于产生方法，例如用于rVWF的成熟过程(本文还称为“rVWF成熟方法”)中时赋予增加的成对碱性氨基酸蛋白酶恢复。前冯?维勒布兰德因子(vWF)成熟至其活性形式需要在残基763处的氨基二羧酸对(-Lys-Arg-)之后进行蛋白水解加工。已经显示vWF优选地通过成对氨基二羧酸裂解酶成对碱性氨基酸蛋白酶进行加工。因此，vWF的产生过程包括使用成对碱性氨基酸蛋白酶，优选在高度稳定化的制剂中。另一方面，与放置于对照稀释剂中的对照制剂相比，在这种稀释剂中的高度稳定化的制剂使成对碱性氨基酸蛋白酶在rVWF成熟步骤中的活性恢复增加3至4倍。
[0159]在某些方面，本发明的高度稳定化的制剂具有至少6个月的保质期。应理解，这种保质期可以是在冷冻温度(即，-80°C、-25°C、0°C )、冷藏(0°C至10°C )、或室温(20°C至32°C )下呈液体或冻干形式。在其它方面，本发明的高度稳定化的制剂具有至少12、18、24、
30、36、42、48、54或 60个月的保质期。
[0160]在其它方面并且根据上述方面，通过在于任何上述温度下储存任何上述时间段之后剩余的百分比活性来测定保质期。在某些实施方案中，保质期意指与在于任何上述温度下储存任何上述时间量之前的活性相比，如通过本文所描述或本领域中已知的任何测定所测量，制剂保留至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
[0161]一方面，根据本公开的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含:(a) 8，000U/mL至57，000U/mL成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)；(b) 190mM氯化钠；(c) 0.92mM氯化钙；(d) 10%w/w海藻糖二水合物；(e)75ppm 聚山梨酯 80 ； (f) 45mM 乙酸；以及(g) 46mMHEPES。
[0162]在某些方面，本公开的高度稳定化的制剂包含以下组分:47mMHEPES、46mM乙酸、195mM氯化钠、0.094mM氯化钙、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
[0163]在其它方面，根据本公开的成对碱性氨基酸蛋白酶(包括重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含:(a)约5，500U/mL至55，000U/mL、6，000U/mL至50，000U/mL、6，500U/mL 至 45，000U/mL、7, 000U/mL 至 40，000U/mL、7, 500U/mL 至 35，000U/mL、8，OOOU/mL 至 30，000U/mL、8, 500U/mL 至 25，000U/mL、9, OOOU/mL 至 20，000U/mL、9, 500U/mL至15，000U/mL、或10，OOOU/mL成对碱性氨基酸蛋白酶；(b)约IOOmM至300mM、IlOmM至280mM、120mM 至 260mM、130mM 至 240mM、140mM 至 220mM、150mM 至 200mM、或 160mM 至 180mM氯化钠；(c)约 0.5mM 至 9mM、ImM 至 8mM、1.5mM 至 7mM、2mM 至 6mM、2.5mM 至 5mM、或 3mM 至
4.5mM 氯化钙；(d)约 0.5% 至 19%、1% 至 18%、1.5% 至 17%、2.0% 至 16%、2.5% 至 15%、3.0% 至14%,3.5% 至 13%、4.0% 至 12%、4.5% 至 11%,5.0% 至 10%,5.5% 至 9%、或 6.0% 至 8% 海藻糖二水合物；(e)约 0.5ppm 至 140ppm、1.0ppm 至 130ppm、IOppm 至 120ppm、20ppm 至 llOppm、30ppm 至 100ppm、40ppm 至 95ppm、50ppm 至 90ppm、55ppm 至 85ppm、60ppm 至 80ppm、或 70ppm至 75ppm 聚山梨酯 80 ; (f)约 25mM 至 90mM、30mM 至 80mM、35mM 至 70mM、40mM 至 60mM、或45mM 至 50mM 乙酸；以及(g) 15mM 至 95mM、20mM 至 90mM、25mM 至 85mM、30mM 至 80mM、35mM 至75mM、40mM 至 70mM、45mM 至 65mM、或 50mM 至 60mM HEPES。
[0164]一方面，本公开提供一种稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)，所述组合物包含:成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)、2%至20%糖或糖醇、IOppm至200ppm非离子型表面活性剂、50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至IOmM钙、缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖是戊糖或己糖。
[0165]在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)包含:成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)、100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至20%糖或糖醇、IOOppm至200ppm非离子型表面活性剂、IOmM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖是戊糖或己糖。
[0166]在具体实施方案中，本发明的高度稳定化的制剂包含以下组分:47mM HEPES、46mM乙酸、195mM氯化钠、0.094mM氯化钙、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
[0167]在另一个具体实施方案中，根据本发明的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含:(a)8，000U/mL至57，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(b) 190mM氯化钠；(c)0.92mM氯化钙；(d) 10%w/w海藻糖二水合物；
(e)75ppm 聚山梨酯 80 ； (f) 45mM 乙酸；以及(g) 46mM HEPES。
[0168]A.稳定剂
[0169]有利地，据发现包含糖、糖醇以及非离子型表面活性剂使水性成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物稳定化。这些作用在本文所提供的实施例中证明。例如，添加这些试剂使液体`储存后成对碱性氨基酸蛋白酶活性保留率增加、液体储存后成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的聚集减少、液体储存后成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的降解减少、成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物搅拌后成对碱性氨基酸蛋白酶活性的损失减少、并且使由搅拌成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物引起的聚集减少。
[0170]因此，在一个实施方案中，本公开提供一种成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如,重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)，所述组合物包含2%至20%糖或糖醇和IOppm至200ppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，组合物包含2%至10%糖或糖醇和IOppm至IOOppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇和75±25ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇和75ppm非离子型表面活性剂。在又其它实施方案中，组合物包含糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合，所述组合选自表1至表9中发现的变化形式I至变化形式6035。
[0171]表1.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
【权利要求】
1.一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含: (a)8，000U/mL至500，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶； (b)IOOmM至300mM药学上可接受的盐；
(c)0.5mM 至 2mM 钙； (d)2%至20%糖或糖醇； (e)IOppm至200ppm非离子型表面活性剂； (f)IOmM至200mM缓冲剂；以及
(g)5.5 至 7.5 的 pH。
2.如权利要求1所述的组合物，其包含150mM至250mM药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的组合物，其包含190±IOmM药学上可接受的盐。
4.如权利要求3所述的组合物，其包含190mM药学上可接受的盐。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的盐是氯化钠。
6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的盐是氯化钾。
7.如权利要求1至6中任 一项所述的组合物，其包含0.9±0.2mM钙。
8.如权利要求7所述的组合物，其包含0.92mM钙。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其包含5%至15%糖或糖醇。
10.如权利要求9所述的组合物，其包含10±2%糖或糖醇。
11.如权利要求10所述的组合物，其包含10%糖或糖醇。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇选自由以下各项组成的组:蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。
13.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇是海藻糖。
14.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇是蔗糖。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物,其包含IOppm至IOOppm非离子型表面活性剂。
16.如权利要求15所述的组合物,其包含50ppm至IOOppm非离子型表面活性剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其包含75ppm非离子型表面活性剂。
18.如权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
19.如权利要求1至18中任一项所述的组合物，其包含50mM至150mM缓冲剂。
20.如权利要求19所述的组合物，其包含90±10mM缓冲剂。
21.如权利要求20所述的组合物，其包含91mM缓冲剂。
22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含乙酸盐。
23.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含HEPES。
24.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含MES。
25.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含乙酸盐和HEPES。
26.如权利要求25所述的组合物，其包含25mM至75mM乙酸盐和25mM至75mMHEPES。
27.如权利要求26所述的组合物，其包含45±5mM乙酸盐和45±5mMHEPES。
28.如权利要求27所述的组合物，其包含45mM乙酸盐和46mMHEPES。
29.如权利要求1至28中任一项所述的组合物，其具有5.5至7.0的pH。
30.如权利要求29所述的组合物，其具有5.5至6.5的pH。
31.如权利要求30所述的组合物，其具有6.0±0.2的pH。
32.如权利要求31所述的组合物，其具有6.0的pH。
33.如权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物在于37°C下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物在于37°C下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
35.如权利要求33或34所述的组合物，其中所述组合物在于37°C下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
36.如权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
38.如权利要求36或37所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨 基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
39.如权利要求1至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
41.如权利要求39或40所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
42.一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含: (a)8，000U/mL至500，000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶； (b)I9OmM氯化钠；
(c)0.92mM 钙； (d)10%海藻糖； (e)75ppm聚山梨酯80 ；
(f)45mM 乙酸；
(g)46mM HEPES ;以及
(g)5.5 至 7.5 的 pH。
43.如权利要求42所述的组合物，其具有5.5至7.0的pH。
44.如权利要求42所述的组合物，其具有5.5至6.5的pH。
45.如权利要求42所述的组合物，其具有6.0±0.2的pH。
46.如权利要求42所述的组合物，其具有6.0的pH。
47.一种用于稀释重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的方法，所述方法包括向所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物添加包含IOppm至200ppm非离子型表面活性剂的稀释缓冲液，从而形成稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含IOppm至IOOppm非离子型表面活性剂。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述稀释缓冲液包含50ppm至IOOppm非离子型表面活性剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含75ppm非离子型表面活性剂。
51.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有5.5至7.5的pH。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有5.5至6.5的pH。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有6.0±0.2的pH。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有6.0的pH。
55.如权利要求43至51中 任一项所述的方法，其中所述稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少50%在稀释前存在于所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少75%在稀释前存在于所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
【文档编号】A61K47/12GK103889454SQ201280038218
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2011年6月2日
【发明者】M·哈斯拉赫尔, A·齐特科维兹, C·怀特, K·弗兰克 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司