通过施用重组vwf治疗凝血疾病的制作方法
【专利摘要】本发明提供通过单独地施用重组冯·威利布兰德因子或将其与因子VIII结合施用而治疗包括血友病和冯·威利布兰德病的凝血疾病的方法。
【专利说明】通过施用重组VWF治疗凝血疾病
发明背景
[0001]诸如冯.威利布兰德病(VWD)和血友病的凝血疾病通常因凝血级联中的缺陷所致。“冯.威利布兰德病(von Willebrand Disease) ”是指一组由冯.威利布兰德因子的缺陷所致的疾病。冯.威利布兰德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，这是正常凝血的必要条件。甲型血友病是指因子VIII活性的缺陷，而乙型血友病是指因子IX缺陷。这些凝血病的当前治疗包括使用含有正常凝血因子的药物制剂的替代疗法。
[0002]VWD和甲型血友病患者中的替代疗法涉及通过静脉输注反复施用含有正常凝血因子的制剂，这会对这些患者的生命构成沉重的负担，尤其是当难以实现静脉通路时。如果能够降低输注频率将是有利的。一种潜在可行的疗法是通过与诸如冯.威利布兰德因子(VffF)的第二分子的缔合而稳定因子VIII，结果是因子VIII的血浆半衰期得以延长。
[0003]VffF是一种糖蛋白，它以一系列大小从约500至20，OOOkD的多聚体形式在血浆中循环。已经克隆了 VWF的全长cDNA ;该多肽对应于全长前原VWF(Eikenboom等人(1995)Haemophilial, 7790)的第23至764位氨基酸残基。多聚体形式的VWF由通过二硫键连接在一起的250kD的多肽亚单位组成。VWF介导最初的血小板与受损血管壁内皮下膜的粘附，其中较大的多聚体表现出增强的止血活性。多聚VWF通过VWF的Al结构域中的相互作用结合到血小板表面糖蛋白Gplba，从而有利于血小板粘附。VWF上的其他位点介导与血管壁的结合。因此，VWF在血小板与血管壁之间形成桥联，这对高剪切条件下的血小板粘附和初期止血必不可少。通常，内皮细胞分泌较大的多聚形式的VWF，而具有较低分子量的那些形式的VWF则由蛋白水解裂解产生。极大分子质量的多聚体储存在内皮细胞的韦伯潘力氏小体(Weibel-Pallade body)中，并在诸如凝血酶和组胺的激动剂刺激下释放。
[0004]FVIII药代动力学取决于VWF水平得到多项之前的观察结果的支持。由于降低的VWF蛋白水平或降低的FVIII结合亲和力而导致的冯.威利布兰德病(VWD)中的FVIII结合活性降低导致内源性 FVIII的稳态水平降低(在Castaman等人，Disorders ofHemostasis88(l): 94-108 (2003)中有所概述)，并且改善VWF的存活已被提出作为改善FVIII 稳定性的可行策略(Denis 等人,Thromb Haemost.2008Feb; 99 (2): 271-8; Turecek等人，Blood, 2006，108(11):Abstractl002)。在重症甲型血友病患者之中，输注前VWF水平与输注FVIII的半衰期之间的相关性已由Fijnvandraat及其同事证实(Fijnvandraat等人，Br J Haematol.19950ct;91 (2):474-6)。在该项研究中，与具有正常VWF水平的患者中12.5小时的平均值相比，据观察，达平均VWF水平的200-300%的患者的FVIII半衰期为15-29小时。在另一项研究中，经证实，O型血患者具有与A型血患者(19.7小时)相比明显更低的VWF水平和更短的FVIII半衰期(15.3小时)(Vlot等人，ThrombHaemost.2000Jan; 83 (I): 65-9)。已表明，化学修饰的 VffF 延长 rFVII I 的存活(Turecek等人，J- Thromb.Haemost.2007Jul9; 5 (2),摘要可见于:http/www.blackwellpublishing.com/i sth2007/abstract.asp?id=64898 )。因此，共同施用 rVWF 和 rFVI 11 是治疗诸如冯.威利布兰德病和甲型血友病的凝血疾病的可行策略。
[0005]发明概述[0006]因此，本发明提供通过向对其有需要的受试者单独地施用重组冯.威利布兰德因子(rVWF)或将其与重组因子VIII(rFVIII)结合施用而结果是因子VIII的体内半衰期得以延长以治疗凝血疾病的方法和组合。
[0007]在一个方面，本发明提供用于治疗对其有需要的受试者中的冯.威利布兰德病或甲型血友病的方法，该方法包括:向受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中rVWF为高分子量VWF多聚体组合物，其包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体，并且其中rVWF具有比血浆源冯.威利布兰德因子更高的比活性。
[0008]在另外的实施方案中并根据以上内容，本发明的方法包括向受试者共同施用重组冯.威利布兰德因子(rVWF)和重组因子VIII(rFVIII)。
[0009]在另外的实施方案中并根据以上任一个，以单一组合物的形式一起施用rVWF和rFVIIL.[0010]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用1.0IU/kg VWF:RCo至150IU/kg VWF:RCoο
[0011]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用2IU/kg VffFiRCo至50IU/kg VWF:RCoο
[0012]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用5IU/kg VffFiRCo至40IU/kg VWF:RCoο
[0013]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用10IU/kg VffFiRCo至20IU/kg VWF:RCoο
[0014]在另外的实施方案中并根据以上任一个，用于本发明方法的rVWF通过用弗林蛋白酶(Furin)处理而体外成熟。
[0015]在另外的实施方案中并根据以上任一个，rVWF通过在中国仓鼠卵巢中表达(CH0细胞培养)而产生。
[0016]在另外的实施方案中并根据以上任一个，rFVIII和rVWF通过在相同的细胞培养中表达而产生。
[0017]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔一天不超过一次施用rVWF。
[0018]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者一周不超过两次施用rVWF。
[0019]在另外的方面并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物将至少20%的WF十聚体或更高级的多聚体在施用后维持至少3小时。
[0020]在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长约5小时。
[0021]在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少12小时。
[0022]在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少24小时。
[0023]在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少36小时。
[0024]在另外的实施方案中并根据以上任一个，因子VIII半衰期延长至少48小时。
[0025]在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中因子VIII半衰期延长至少72小时。
[0026]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间。[0027]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间。
[0028]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间。
[0029]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的23比率为约3:4。
[0030]在另外的实施方案中并根据以上任一个，rVWF具有约20-150mU/l.! g的比活性。
[0031]在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少30%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
[0032]在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少40%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
[0033]在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少50%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
[0034]在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少60%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
[0035]在另外的实施方案中并根据以上任一个，高分子量VWF多聚体组合物包含至少70%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
[0036]在另外的方面并根据以上任一个，本发明提用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯?威利布兰德病的方法，该方法包括:向受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中:(a)rVWF具有比血浆源冯.威利布兰德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性为约20-150mU/l.! g ;并且(b)FVIII半衰期是施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少约1.5倍。
[0037]在另外的方面并根据以上任一个，本发明提用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯?威利布兰德病的方法，该方法包括:向受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中:(a)rVWF是包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体的高分子量VWF多聚体组合物，(b)rVWF具有比血浆源冯.威利布兰德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性为至少约20-150mU/y g ;并且(C)FVIII半衰期是施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少约1.5倍。
[0038]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用rVWF后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少90%。
[0039]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 100%ο
[0040]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后36小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 80%ο[0041]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后48小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 50%ο
[0042]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少6小时。
[0043]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少12小时。
[0044]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少18小时。
[0045]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少24小时。
[0046]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少36小时。
[0047]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少48小时。
[0048]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后稳定至少72小时。
[0049]在另外的方面并根据以上任一个，本发明提供用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯?威利布兰德 病的方法，该方法博包括:向受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)。
[0050]在另外的实施方案中并根据以上任一个，该方法包括向受试者共同施用重组因子VIII (rFVIII)和重组冯.威利布兰德因子(rVWF)。
[0051]在另外的实施方案中并根据以上任一个，以单一组合物的形式一起施用rFVIII和 rVWF。
[0052]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间。
[0053]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间。
[0054]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间。
[0055]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为约3:4。
[0056]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF通过用弗林蛋白酶处理而体外成熟。
[0057]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF在哺乳动物细胞培养中表达。
[0058]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII在哺乳动物细胞培养中表达。
[0059]在另外的实施方案中并根据以上任一个，哺乳动物培养包括CHO细胞。
[0060]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII和rVWF在相同的培养中共表达。[0061]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVII I和rVWF共同纯化。
[0062]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII和rVWF单独纯化。
[0063]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rFVIII/rVWF复合物在施用前复溶。
[0064]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将rVWF在复溶rFVII I /rVWF复合物前用弗林蛋白酶处理。
[0065]在另外的实施方案中并根据以上任一个，将复溶的rFVIII/rVWF复合物用弗林蛋白酶处理。
[0066]在另外的实施方案中并根据以上任一个，弗林蛋白酶为重组弗林蛋白酶。
[0067]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每天不超过一次施用rVWF。
[0068]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔一天不超过一次施用rVWF。
[0069]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔两天不超过一次共同施用rVWF。
[0070]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每隔三天不超过一次施用rVWF。
[0071]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用1.5IU/kg FVIII = C至150IU/kg FVII1:C。
[0072]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用10IU/kg FVIII = C至100IU/kg FVII1:C。
[0073]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用25IU/kg FVIII = C至75IU/kg FVII1:C。
[0074]在另外的实施方案中并根据以上任一个，向受试者每剂施用40IU/kg FVIII = C至60IU/kg FVII1:C。
[0075]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 90%ο
[0076]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后24小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 100%ο
[0077]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后36小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 80%ο
[0078]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用后48小时受试者血浆中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平为施用后I小时存在于血浆中的FVIII = C活性水平的至少 50%ο
[0079]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少10%的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VffF多聚体组成。
[0080]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VffF多聚体组成。[0081]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少30%的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VffF多聚体组成。
[0082]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少40%的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VffF多聚体组成。
[0083]在另外的实施方案中并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF具有包含至少50%的VWF十聚体或更高级的多聚体的HMW VffF多聚体组成。
[0084]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少3小时。
[0085]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少6小时。
[0086]在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少12小时。
[0087]在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少18小时。
[0088]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少24小时。
[0089]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少36小时。
[0090]在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少48小时。
[0091]在另外的实施方案中并根据以上任一个，更高级的rVWF多聚体在施用后在体外稳定至少72小时。
[0092]在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少12小时。
[0093]在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少24小时。
[0094]在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少36小时。
[0095]在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少48小时。
[0096]在另外的实施方案中并根据以上任一个，内源性FVIII活性稳定至少72小时。
[0097]在另外的实施方案中并根据以上任一个，其中共同施用的rFVIII活性稳定至少12小时。
[0098]在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少24小时。
[0099]在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少36小时。
[0100]在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少48小时。
[0101]在另外的实施方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性稳定至少72小时。
[0102]在另外的实施`方案中并根据以上任一个，共同施用的rFVIII活性通过延长rFVIII体内半衰期而稳定。[0103]在另外的实施方案中并根据以上任一个，FVIII半衰期与施用pdFVIII的患者相比延长至少约五小时。
[0104]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少36小时。
[0105]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少48小时。
[0106]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少72小时。
[0107]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少90小时。
[0108]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少120小时。
[0109]在另外的实施方案中并根据以上任一个，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%维持至少168小时。
[0110]附图简述
[0111]图1.评估单剂rVWF:rFVIII后的耐受性和安全性的研究设计示意图。
[0112]图2.药代动力学数据。⑷提供rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII的PK数据。(B)提供关于暴露于ADAMTS13时高分子量rVWF的逐渐丧失的数据。
[0113]图3.显示 rVWF/rFVIII 和 p`dVWF/pdFVIII 的 FVIII PK 的药代动力学数据。
[0114]图4.汇总研究的患者人口统计资料的表格。
[0115]图5.队列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治疗的药代动力学数据。
[0116]图6.关于ADAMTS13对VWF多聚体的裂解的SDS-PAGE数据。
[0117]图7.队列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治疗的药代动力学数据。
[0118]图8.研究中的不良事件汇总。
[0119]图9.研究中的rVWF PK参数数据。
[0120]图10.得自患者I的rVWF PK数据。
[0121]图11.得自患者2的rVWF PK数据。
[0122]图12.得自患者3的rVWF PK数据。
[0123]图13.患者1、2和3中rVWF PK的比较_ VWF参数和FVIII活性的比较。
[0124]图14.研究所有队列中的FVI11活性。
[0125]图15.队列2患者中的rVWF PK - VffF参数和FVIII活性的比较。
[0126]图16.队列2中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的药代动力学参数汇总。
[0127]图17.队列3所有患者中的rVWF PK - VffF和FVIII的血浆参数的比较。
[0128]图18.队列3中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的药代动力学参数汇总。
[0129]图19.得自队列4中的患者的数据。
[0130]图20.队列4A中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的药代动力学参数汇总。
[0131]图21.比较共同施用的rVWF和rFVIII与Advate Pivotal的FVII1: C的药代动力学数据。
[0132]图22.接受共同施用的pdVWF/pdFVIII或rVWF/rFVIII的受试者的抗体汇总。【具体实施方式】
[0133]
[0134]本发明提供通过单独地施用重组冯.威利布兰德因子(rVWF)或将其与因子VIII(其可以为重组的或血浆源的)结合施用而治疗受试者中的凝血疾病的组合物和方法。在一些方面，本发明的组合物和方法用于治疗诸如冯.威利布兰德病(VWD)或甲型血友病的凝血疾病。
[0135]在一个方面，施用给受试者的rVWF提供与因施用血浆源VWF产生的FVIII稳定性相比体内因子VIII (FVIII)活性的稳定性增强，从而允许比凝血疾病的传统治疗更低的治疗剂量和/或频率。FVIII活性的稳定性以及FVIII的水平升高可使用本领域已知的以及本文所述的方法测量，包括标准测定法，诸如一阶段凝结测定法、显色测定法和免疫测定法(参见例如 Lippi 等人,Blood Coagulation&FibrinoIysis, 2009, 20 (I): 1-3 和 Chandler 等Λ, Am J.Cl in.Pathol.，2003，120:34-39,它们每一者据此均以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与FVIII水平和活性的测定法相关的所有教导而言)。如图20中所示，平均FVIII半衰期通过rVWF相对于接受pdVWF的患者的半衰期延长5.2小时。图2和7还显示了与施用pdVWF的那些患者相比在施用rVWF的患者中FVIII活性的增加:图2显示了与施用PdVW的患者相比施用rVWF的患者的平均FVIII半衰期延长4.7小时，并且图7中得自队列4A的数据显示了与施用pdVWF的患者相比施用rVWF的患者的FVIII半衰期延长5.3小时。此外，如图21所示，与单独接受FVIII (即Advate)的患者相比，在与rFVIII相结合接受rVWF的VWD患者中，血浆FVIII的半衰期延长12.27小时。
[0136]在又一个方面，rVWF的施用稳定内源性和/或共同施用的FVIII活性，结果是FVIII的体内半衰期和/或活性增加。在其中共同施用rVWF和FVI11的实施方案中，可以单一组合物的形式将rVWF和FVIII —起施用给受试者。在另外的实施方案中，rVWF和FVIII均不被水溶性聚合物修饰。在其他实施方中，rVWF或FVIII或两者被水溶性聚合物修饰。如将会认识到，在其中与FVIII共同施用rVWF的实施方案中，FVIII可以为重组的或血浆源的。
[0137]在另外的方面并根据以上任一个，施用给受试者的rVWF为包含rVWF的十聚体或更高级的多聚体的高分子量多聚体组合物。如上所讨论，使用本发明的rVWF组合物提供具有或不具有FVIII (重组的或血浆源的)的给药(再次给药)灵活性。在另外的实施方案中，施用给受试者的rVWF为包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体的高分子量VWF多聚体组合物。在具体的实施方案中，施用给受试者的rVWF不被水溶性聚合物修饰。
[0138]在另外其他方面，施用给受试者的rVWF具有比pdVWF更高的比活性。
[0139]在再一个方面，向受试者一周不超过两次施用单独的或与PdFVI 11或rFVI 11组合的 rVWF。
[0140]在还一个方面，将rVWF在施用给受试者前用弗林蛋白酶处理。在某些实施方案中，将rVWF用重组弗林蛋白酶处理。
[0141]在另外 的方面，用于本发明的rVWF根据本领域已知的并例如在2011年7月8日提交的US2012/0035110和2012年5月8日提交的美国专利8，173，597中所述的方法产生，这些专利的每一者据此以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与rVWF组合物和产生这些组合物的方法相关的所有教导而言。
[0142]根据以上任一个，将单独的或与FVIII组合的rVWF用于治疗患有诸如VWD和甲型血友病的凝血疾病的患者。患有VWD的患者具有一定水平的FVIII，但该FVIII的稳定性通常低下，因为这些患者缺乏VWF15VWD患者的治疗可在一些实施方案中涉及用rVWF和rFVIII两者初始治疗然后反复施用单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以通过单独的rVWF进行，而后续反复施用通过rVWF和rFVIII两者进行，或者初步和后续反复施用均可以包括rVWF和rFVIII两者的共同施用。相似地，甲型血友病患者(缺乏FVIII)可接受rVWF和rFVI 11两者的初始治疗，而后续反复治疗可包括施用单独的rFVI 11或单独的rVWF。在其他实施方中，初始治疗可以为单独的rFVIII，而后续反复治疗涉及共同施用rVWF和rFVIII。
[0143]定义
[0144]如本文所用，“rVWF”是指重组VWF。
[0145]如本文所用，“rFVI 11 ”是指重组FVIII。
[0146]术语“重组”当关于例如细胞或核酸、蛋白或载体使用时表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而修饰，或表示该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不存在于天然(非重组)形式的细胞内的基因，或表达原本异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
[0147]如本文所用，〃重组VWF"包括通过重组DNA技术获得的VWF。在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的W01986/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请序列号07/559，509 (以Ginsburg等人的名义)中制备的构建体，该专利关于产生重组VWF的 方法以引用方式并入本文。本发明中的VWF可包括所有潜在形式，包括单体和多聚形式。还应当理解，本发明涵盖将以组合方式使用的不同形式的VWF。例如，本发明的VWF可包括不同的多聚体、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物两者。
[0148]在本发明的背景下，重组VWF涵盖得自例如哺乳动物(诸如灵长类、人类、猴子、兔子、猪、哨齿类、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬科、猫科)的VWF家族的任何成员及其生物活性衍生物。还涵盖具有活性的突变和变体VWF蛋白，VWF蛋白的功能片段和融合蛋白也一样。此外，本发明的VWF可进一步包含有利于纯化、检测或两者的标签。本文所述的VWF可用治疗性部分或适合体外或体内成像的部分进一步修饰。
[0149]如本文所用，〃血浆源VWF(pdVWF) 〃包括存在于血液中的所有形式的蛋白，包括具有在体内稳定(例如)至少一种FVIII分子的结合的特性的得自哺乳动物的成熟VWF。
[0150]术语“高度多聚VWF”或“高分子量VWF”是指包含至少10个亚单位或12、14或16个亚单位至约20、22、24或26个亚单位或更多个亚单位的VWF。术语“亚单位”是指VWF的单体。如本领域所已知，其通常为聚合形成更高级多聚体的VWF的二聚体。(参见Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.2010，36(5): 510-521，其据此以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与VWF的多聚体分析相关的所有教导而言)。
[0151]如本文所用，术语〃因子VIir或"FVIII"是指具有凝血因子VIII的典型特征的任何形式的因子VIII分子，无论是患者内源性的、衍生自血浆的还是通过使用重组DNA技术而产生的，并包括因子VIII的所有修饰形式。因子VIII (FVIII)天然存在以及作为由单一基因产物而产生的多肽的异源分布而存在于治疗性制剂中(参见例如Andersson等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:2979-2983 (1986))。包含因子 VIII 的治疗性制剂的市售实例包括以商品名 HEMOFIL M、ADVATE 和 RECOMBINATE (可得自 Baxter HealthcareCorporation, Deerfield, 111., U.S.A.)销售的那些。
[0152]如本文所用，“血浆FVIII活性”和“体内FVIII活性”可互换使用。使用标准测定法测量的体内FVIII活性可以是内源性FVIII活性、治疗性施用的FVIII(重组的或血浆源)的活性或内源性与施用的FVIII活性两者。相似地，“血浆FVIII”是指内源性FVIII或施用的重组或血浆源FVIII。
[0153]如本文所用，“冯.威利布兰德病”是指一组由冯.威利布兰德因子的缺陷所致的疾病。冯.威利布兰德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，这是正常凝血的必要条件。如在本文进一步详细描述，存在多种类型的冯.威利布兰德病。
[0154]如本文所用，术语“血友病”是指一组普遍以血液凝结或凝聚减弱为特征的病态。血友病可以指甲型、乙型或丙型血友病，或指所有三种疾病类型的复合形式。甲型血友病由因子VIII (FVIII)活性的降低或丧失所致，并为最主要的血友病亚型。乙型血友病由因子IX(FIX)凝结功能的丧失或减弱所致。丙型血友病是因子XI (FXI)凝结活性的丧失或降低的结果。甲型和乙型血友病是X染色体连锁疾病，而丙型血友病为常染色体的。血友病的常见治疗包括预防性和按需施用凝血因子，诸如fvii1、fix (包括Bebulin?-VH和fxi)以及FEIBA-VH、去氨加压素，和血浆输注。
[0155]术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指实质上或基本上不含如在天然状态中所见的通常与之相伴的组分的材料。纯度和同质性通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术测定。VWF是存在于实质上纯化的制剂中的主要物质。术语“纯化的”在一些实施方案中表示核酸或蛋白在电泳凝胶中产生基本上一条带。在其他实施方中，意指核酸或蛋白的纯度为至少50%，更优选地至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在其他实施方中的“纯化”意指从待纯化的组合物中移除至少一种污染物。从这层意义上说，纯化不需要纯化后的化合物为均匀的，例如100%纯的。
[0156]如本文所用，“施用”(和所有语法等同形式)包括向受试者静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、作为栓剂施用、局部接触、腹膜内、病灶内或鼻内施用或植入缓释装置，例如微量渗透泵。施用通过任何途径进行，包括肠胃外和经粘膜(例如经口、鼻腔、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于脂质体制剂、静脉输注、透皮贴片等。
[0157]术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够量或剂量”是指产生为施用对象产生治疗效果的剂量。例如，可用于治疗血友病的药物的治疗有效量可以是能够预防或缓解与血友病相关的一种或多种症状的量。精确剂量将取决于治疗目的，并将能由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如Lieberman, PharmaceuticalDosage Forms (vols.1~3, 1992) ；Lloyd, The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999) ；Pickar,Dosage Calculations(1999)和Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams&Wilkins)。
[0158]如本文所用，术语“患者”和“受试者”可互换使用并指患有疾病或可能感染疾病的哺乳动物(优选人)。
[0159]如本文所用，术语“约”表示指定值加或减10%的大致范围。例如，用语“约20%”涵盖18-22%的范围。
[0160]如本文所用，术语“半衰期”是指物质的量衰减(或从样品或从患者中清除)到一半所需的时间周期。
[0161]本发明的组合物
[0162]本发明利用包含重组冯.威利布兰德因子(rVWF)的组合物治疗凝血疾病，诸如VWD和甲型血友病。在一些实施方案中，本发明利用与因子VIII (FVIII)相结合的rVWF。共同施用的FVIII可以为重组(rFVIII)或血浆源(pdFVIII)。在优选的方面，本发明的组合物使体内因子VIII活性(在本文也称为血浆因子VIII活性)稳定，使得因子VIII的体内半衰期与未施用rVWF或施用pdVWF的受试者中的体内半衰期相比得以延长。测量rVWF使FVIII活性稳定的程度(包括FVIII半衰期的延长)可使用本领域已知的方法进行。FVIII活性的水平可通过例如一阶段凝结测定法、显色测定法和免疫测定法测量(参见例如Lippi等人,Blood Coagulation&FibrinoIysis, 2009, 20 (I): 1-3, European Pharmacopoeia (Ph.Eur., 3rd Ed.1997:2.7.4)和 Chandler 等人，Am J.Clin.Pathol.，2003，120:34-39，它们每一者据此均以引用方式整体并入以用于所有目的，尤其是对于与FVIII水平和活性的测定法相关的所有教导而言)。[0163]在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的W01986/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请序列号07/559，509 (以Ginsburg等人的名义)中制备的构建体，该专利关于产生重组VWF的方法以引用方式并入本文。可用于本发明的VWF包括所有潜在形式，包括单体和多聚形式。一种尤其有用的VWF形式为至少两种VWF的同源多聚体。VWF蛋白可以为生物活性衍生物，或在仅将用作FVIII的稳定剂时，VWF可以为非生物活性形式。还应当理解，本发明涵盖将以组合方式使用的不同形式的VWF。例如，可用于本发明的组合物可包括不同的多聚体、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物两者。
[0164]在初期止血中，VWF起到作为血小板与细胞外基质特定组分(诸如胶原)之间的桥联的作用。在此过程中VWF的生物活性可通过不同的体外测定法测量(Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.28:149-160, 2002)。瑞斯托菌素辅因子测定法基于在存在VWF的情况下由抗生素瑞斯托菌素诱导的新鲜或甲醛固定血小板的凝集。血小板凝集程度取决于VWF浓度,并可通过比池法测量,例如通过使用凝集计(Weiss等人，J.Clin.1nvest.52:2708-2716，1973;Macfarlane 等人，Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308，1975)。第二种方法是胶原结合测定法，这种方法基于ELISA技术(Brown et Bosak, Thromb.Res.43:303-311，1986;Favaloro, Thromb.Haemost.83:127-135，2000)。将微量滴定板包被上 I 型或 III型胶原。然后，使VWF结合到胶原表面，然后用酶标记的多克隆抗体检测。最后一步是底物反应，其可通过ELISA酶标仪以光度学监测。如本文所提供，本发明的VWF(VWF:RCo)的瑞斯托菌素辅因子比活性通常以mU/ μ g VffF描述，如使用体外测定法测量。
[0165]本发明的rVWF组合物相对于pdVWF的优势在于rVWF表现出比pdVWF高的比活性。在一些实施方案中，本发明的rVWF具有至少约20,22.5,25,27.5,30,32.5,35,37.5、40、42.5,45,47.5,50,52.5,55,57.5,60,62.5,65,67.5,70,72.5,75,77.5,80,82.5,85,87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mU/u g 或更高的比活
性。在一个实施方案中，用于本文所述的方法的rVWF具有20πιυ/μ g至150mU/u g的比活性。在另一个实施方案中，VWF具有30mU/ug至120mU/ug的比活性。在另一个实施方案中，rVWF具有40πιυ/μ g至90πιυ/μ g的比活性。在再一个实施方案中，rVWF具有选自存在于表1中的变型I至133的比活性。
[0166]表1.存在于组合物中的并用于本文提供的方法的rVWF的比活性的示例性实施方案。
[0167] (mil/ μ g)(mil/ μ g)(mil/ μ g)(mil/ μ g)
20Var.1 Τ?0Var.35~ 40-150~ Var.68~ 70-120~ Var.101
22.5Var.2 Π5Var.36~ 40-140~ Var.69~ 70-110~ Var.102
25Var.3 120Var.37~ 40-130~ Var.70~ 70-100~ Var.103
27.5Var.4 125Var.38~ 40-120~ Var.71 ~ 70-90 Var.104
30Var.5 130Var.39~ 40-110~ Var.72~ 70-80 Var.105
32.5Var.6 HEVar.40~ 40-100~ Var.73~ 80-150~ Var.106
35Var.7 HOVar.41 ~ 40-90 Var.74~ 80-140~ Var.107
37.5Var.8 145Var.42~ 40-80 Var.75~ 80-130~ Var.108
40Var.9 ΤδΟVar.43~ 40-70 Var.76~ 80-120~ Var.109
42.5Var.10~ 20-150~ Var.44~ 40-60 Var.77~ 80-110~ Var.110
45Var.11 ~ 20-140~ Var.45~ 40-50 Var.78~ 80-100~ Var.111
47.5Var.12~ 20-130~ Var.46~ 50-150~ Var.79~ 80-90 Var.112
[0168]
50IVar.13~120-120 IVar.47~150-140~IVar.80~190-150~IVar.113
52.5Var.14~ 20-110~ Var.48~ 50-130~ Var.81 ~ 90-140~ Var.114
55Var.15~ 20-100~ Var.49~ 50-120~ Var.82~ 90-130~ Var.115
57.5Var.16~ 20-90 Var.50~ 50-110~ Var.83~ 90-120~ Var.116
60Var.17~ 20-80 Var.51 ~ 50-100~ Var.84~ 90-110~ Var.117
【权利要求】
1.一种用于治疗对其有需要的受试者中的冯?威利布兰德病或甲型血友病的方法，所述方法包括: 向所述受试者施用重组冯.威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯?威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中所述rVWF为高分子量VWF多聚体组合物，其包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体，并且其中所述rVWF具有比血浆源冯.威利布兰德因子更高的比活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者共同施用重组冯.威利布兰德因子(rVWF)和重组因子VIII(rFVIII)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中以单一组合物的形式一起施用所述rVWF和rFVIIL.
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中向所述受试者每剂施用1.0IU/kgVWF:RCo 至 150IU/kg VffFiRCo0
5.根据权利要求4所述的方法，其中向所述受试者每剂施用2IU/kgVWF = RCo至50IU/kg VffF:RCo ο
6.根据权利要求4所述的方法，其中向所述受试者每剂施用5IU/kgVWF = RCo至40IU/kg VffF:RCo ο
7.根据权利要求4所述的方法，其中向所述受试者每剂施用10IU/kgVWF = RCo至20IU/kg VffF:RCo ο
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中将所述rVWF通过用弗林蛋白酶处理而体外成熟。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述rVWF通过在中国仓鼠卵巢中表达(CHO细胞培养)而产生。
10.根据权利要求1-9所述的方法，其中所述rFVIII和rVWF通过在相同的细胞培养中表达而产生。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中向所述受试者每隔一天不超过一次施用 rVWF。
12.根据权利要求11所述的方法，其中向所述受试者一周不超过两次施用rVWF。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物将至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体在施用后维持至少3小时。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中因子VIII半衰期延长至少5小时。
15.根据权利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延长至少12小时。
16.根据权利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延长至少24小时。
17.根据权利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延长至少36小时。
18.根据权利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延长至少48或72小时。
19.根据权利要求2-18所述的方法，其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1与1:4之间。
20.根据权利要求19所述的方法，其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2与1:3之间。
21.根据权利要求19所述的方法，其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1与1:2之间。
22.根据权利要求19所述的方法，其中施用给所述受试者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)与rVWF瑞斯托菌素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率为约3:4。
23.根据权利要求1-22所述的方法，其中所述rVWF具有约20_150mU/yg的比活性。
24.根据权利要求1-23所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少30%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
25.根据权利要求1-24所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少40%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
26.根据权利要求1-25所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少50%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
27.根据权利要求1-26所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少60%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
28.根据权利要求1-27所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚体组合物包含至少70%的VWF十聚体或更高级的多聚体。
29.一种用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯.威利布兰德病的方法，所述方法包括: 向所述受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中: (a)所述rVWF具有比血浆源冯?威利布兰德因子更高的比活性，其中rVWF的比活性为约 20-150mU/y g ;并且 (b)FVI11半衰期为施用血浆源冯?威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少1.5 倍。
30.一种用于治疗对其有需要的受试者中的甲型血友病或冯.威利布兰德病的方法，所述方法包括: 向所述受试者施用重组冯?威利布兰德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期与施用血浆源冯.威利布兰德因子的受试者相比得以延长，其中: (a)所述rVWF为包含至少20%的VWF十聚体或更高级的多聚体的高分子量VWF多聚体组合物， (b)所述rVWF具有比血浆源冯?威利布兰德因子更高的比活性，其中rVWF的比活性为至少约20-150mU/y g ;并且(C)FVIII半衰期为施用血浆源冯?威利布兰德因子的受试者中的FVIII半衰期的至少1.5 倍。
31.根据权利要求1-30的方法，其中所述方法为用于治疗冯.威利布兰德病3型的方法。
【文档编号】A61P7/04GK103732244SQ201280038870
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年6月11日 优先权日:2011年6月10日
【发明者】F·沙伊芙林格, P·图雷切克, B·埃文斯汀, Y·W·王, M·T·休特 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特保健股份有限公司