针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域的制作方法

针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域的制作方法
【专利摘要】本发明提供针对IgE的多肽和蛋白构建体。在一个具体的方面中，描述了与结合血清白蛋白的肽连接的针对IgE的纳米抗体。本发明还描述了编码所述多肽和蛋白构建体的核酸；包含所述多肽和蛋白构建体的组合物，特别是药物组合物；以及所述多肽、蛋白构建体和组合物的应用。
【专利说明】针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域 发明领域
[0001] 本发明涉及针对IgE的多肽和蛋白构建体；涉及编码所述多肽和蛋白构建体的核 酸；涉及包含所述多肽和蛋白构建体的组合物，特别是药物组合物；并且涉及所述多肽、蛋 白构建体和组合物的应用。
[0002] 如果有任何在本文中没有明确定义的术语，则这些术语具有W009/068627中为其 所给出的含义。如果本文中所用的任何术语没有在本文中或在W009/068627中明确定义， 那么其具有其在本领域中常见的意思，对于其，例如，参考标准手册。

【背景技术】
[0003] 国际申请W004/041865描述了针对IgE的具体的蛋白构建体，其包含至少一个针 对IgE的VHH或人源化的VHH和至少一个针对血清蛋白如（人）血清白蛋白的纳米抗体，由 于存在结合血清白蛋白的纳米抗体，与相对应的单独的针对IgE的VHH's相比，所述蛋白构 建体具有增加的体内半衰期。W004/041865中的SEQ ID NO's:22-24给出了此类双特异性 抗-IgE/抗-血清白蛋白构建体的实例。
[0004] 国际申请W004/041867描述了针对IgE的VHH's(例如，参见W004/041867的SEQ ID N0's:l-ll)。W004/041867进一步提及这些VHH's可以被人源化，并且可以适当地与 一种或多种针对血清蛋白如血清白蛋白的VHH' s连接，从而提供具有增加的半衰期以及与 VHH' s和纳米抗体相关的有利特性的蛋白构建体。
[0005] 国际申请W006/122787描述了多种针对(人）血清白蛋白的纳米抗体。这些纳 米抗体包括称为Alb-I (W006/122787中的SEQ ID N0:52)的纳米抗体及其人源化变 体，如 Alb-8 (TO06/122787 中的 SEQ ID NO: 62;本文中的 SEQ ID NO: 174)。[纳米抗体 /MwodiW#?和纳米抗体是埃博灵克斯股份有限公司（Ablynx N.V.)的 商标]。
[0006] 到本申请首次提交的日期时，已经通过临床试验验证了针对（人）血清白蛋白的 纳米抗体用于延长治疗结构部分如纳米抗体的半衰期的应用。例如，已经在I期临床试验 中验证了 ALX-0141 (S卩，包含两种针对RANK-L的纳米抗体和一种针对人血清白蛋白的纳 米抗体的蛋白构建体）的安全性、耐受性、免疫原性和药物代谢动力学（PK)(埃博灵克斯股 份有限公司于2011年5月27日在伦敦的欧洲风湿病学年会（Annual European Congress of Rheumatology(EULAR)上提出的数据)。此外，多份埃博灵克斯有限公司的已公布的 专利申请给出了包含一种或多种针对治疗靶标的纳米抗体和一种或多种针对血清白蛋白 的纳米抗体(如Alb-8)的具有增加的半衰期的构建体的实例。例如，参考W004/041862， W006/122786, W008/020079, W008/142164, W009/068627 和 W009/147248。
[0007] 尽管已经确定使用针对（人）血清白蛋白的纳米抗体是一种良好的且广泛 适用的延长纳米抗体和其他治疗实体的半衰期的方式，但是，本发明人已经发现当使 用TO06/122787所述的代表性纳米抗体来延长针对IgE的纳米抗体的半衰期时（以 W004/041865和W004/041867中一般描述的方式)，这样获得的构建体，虽然其针对IgE是有 充分生物学活性的，并且具有适于治疗应用的半衰期，但是仍然具有一些能够得益于进一 步的改善的特性。
[0008] 特别地，已经发现所述包含针对IgE的纳米抗体和Alb-8 (W006/122787所述的代 表性的结合血清白蛋白的纳米抗体）的多肽具有有限的保存稳定性，这留下了进一步改善 的空间(例如，参见，本文实验部分中记载的结果)。
[0009] 发明概述
[0010] 因此，本发明通常具有提供改善的多肽和(其他）蛋白构建体的目的，所述多肽和 (其他）蛋白构建体包含至少一个针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域（如纳米抗体），并 且具有增加的体内半衰期(如本文进一步所述，并且与针对IgE的免疫球蛋白单可变结构 域本身相比较)，其与如现在已经发现的在使用W004/041865和W004/041867中通常所述的 类型的抗-IgE构建体时存在的相同的问题不相关。
[0011] 已公布的国际申请 TO08/068280, TO09/127691，美国申请 US2011/0243954 和 W02011/095545描述了这样的肽，其针对人血清白蛋白，并且其可以与治疗结构部分（如针 对治疗靶标的纳米抗体)连接，以提供具有增加的半衰期的所述治疗结构部分。这些国际申 请中所述的半衰期延长技术也称为NExpedite?技术[NExpedite?是埃博灵克斯有限公司 的商标]。W008/068280也一般提及治疗结构部分可以是W004/041867中所述的针对IgE 的纳米抗体）。
[0012] 令人惊讶地，已经发现使用 W008/068280 中、W009/127691 中、US2011/0243954 中 且特别是W02011/095545中所述的结合血清白蛋白的肽来延长针对IgE的纳米抗体的半衰 期不涉及在使用W004/041865和W004/041867中通常所述的类型的抗-IgE/抗-血清白蛋 白多肽和构建体时发生的问题。特别地，已经发现包含一种或多种针对IgE的纳米抗体和 如 TO08/068280 中、W009/127691 中、US2011/0243954 中且特别是 W02011/095545 中所述 的一种或多种结合白蛋白的肽的构建体，与具有相当的半衰期延长的抗-IgE多肽(其中使 用TO06/122787所述的代表性的结合白蛋白的纳米抗体）相比，具有提高的保存稳定性(如 例如通过实施例16所述的SE-HPLC实验确定的)。同样参考本文实验部分记载的数据和结 果。
[0013] 除了用已知的抗-IgE构建体来解决这些问题(所述问题在现有技术中尚未被认 识到）之外，在建立本发明时,本发明人也已经制成了与已知的针对IgE的纳米抗体(如 W004/041865和W004/041867中所述的那些）相比具有某些优点的多种针对IgE的免疫球 蛋白单可变结构域。这些改善的针对IgE的纳米抗体能够，例如并且具有优势的，用作"结 构单元"来提供本文所述的半衰期延长的抗-IgE蛋白构建体。这些抗-IgE免疫球蛋白单 可变结构域（或"ISV' s)以及包含其的多肽和蛋白构建体形成本发明的另外的方面。
[0014] 此外，通过将本文公开的改善的抗-IgE结构单元与W008/068280中、W009/127691 中、US2011/0243954中且特别是W02011/095545中所述的半衰期延长的肽组合，本发明人 还已经提供了与W004/041865中所述的半衰期延长的抗-IgE构建体相比具有改善特性的 一定范围的不同半衰期延长的抗-IgE蛋白构建体，并且这些改善的蛋白构建体和多肽形 成本发明的另外的方面。
[0015] 本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将通过本文的进一步描述变得清楚。
[0016] 详述
[0017] 因此，在第一方面中，本发明涉及包含以下或基本上由以下组成的多肽、蛋白、构 建体或化合物(在本文中还笼统地称为"本发明的抗-IgE多肽"或"本发明的多肽"）：
[0018] a) -种或多种（如一种或两种）针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域（ISV' s) (其可以如本文进一步所述，并且优选地是如本文所述的优选方面所述）；和
[0019] b) -种或多种（如一种或两种，包括但不限于串联重复的）针对（人）血清白蛋 白的肽，其如 W008/068280 中、W009/127691 中、US2011/0243954 且特别是 W02011/095545 中所述(其优选地是如本文所述的优选方面所述）；
[0020] 其适当地直接或通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接。
[0021] 所述多肽、蛋白、构建体或化合物(和/或其中存在的一种或多种针对IgE的 ISV' s)可以特别是这样的，以使其能够调节、并且特别是抑制或阻断(完全或部分地）（人） IgE与（人）Fc( ε )RI(高亲和性IgE受体）之间的相互作用，例如，如在适当的测定中检测 的，诸如下述实验部分中所用的一种测定(例如，实施例7中所用的测定)。例如，其可以是这 样的，以使其抑制HuIgE/HuFc( ε )RI相互作用（例如，在实施例7中所述的ELISA测定中； 在实施例6中所述的α筛选测定（Alphascreen assay)中）的IC50值优于8. KTwM,优选 地优于6. KT10M,如优于KT10M,优于5. KT11M,优于2. KT11M或者甚至优于1(ΓηΜ。
[0022] 所述多肽、蛋白、构建体或化合物(和/或其中存在的一种或多种针对IgE的 ISV' s)还可以是这样的(或者另外是这样的)，以使其能够调节、并且特别是抑制或阻断(完 全或部分地）（人）IgE与（人）Fe (e)RII (低亲和性IgE受体）之间的相互作用，例如， 如在适当的测定中检测的，诸如下述实验部分中所用的一种测定(例如，实施例8中所用的 测定)。例如，其可以是这样的，以使其抑制HuIgE/HuFc( ε )RII相互作用（例如，在实施例 8中所述的ELISA测定中）的IC50值优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于 5. KT9M,优于 2. KT9M,优于 KT9M,优于 5. KTiqM 或优于 2. KT1QM。
[0023] 此外，任意所述多肽、蛋白、构建体或化合物(和/或其中存在的一种或多种针对 IgE的ISV' s)可以是这样的，以使其在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优 选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM或者甚至优于0. 5nM的IC50值。
[0024] 结合 IgE 的 ISV
[0025] 在本发明的IgE构建体中存在的所述一种或多种针对IgE的免疫球蛋白单可变结 构域或"ISV' s"可以是任意适当的针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域。因此，针对IgE 的ISV可以是，例如，结构域抗体、单结构域抗体、dAb?、纳米抗体、VHH、IgNAR结构域或其他 适当的针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域。优选地，所述一种或多种针对IgE的ISV' s 是纳米抗体(如VHH' s，人源化的VHH' s或骆驼源化的VH' s，如骆驼源化的人VH' s)。
[0026] 在本发明的抗-IgE多肽中存在的所述一种或多种针对IgE的ISV' s (并且特别 是纳米抗体)可以特别是在SEQ ID NO: 172的人IgE Fc序列与SEQ ID NO: 173中给出的来 自食蟹猴（cynomolgus monkey)的IgE Fc序列之间交叉反应的ISV' s或纳米抗体。特别 地，所述ISV' s可能具有是所述ISV针对人IgE的亲和力的至少1%，例如5%，如至少10%， 例如至少25%，如至少50%或更多的针对食蟹猴IgE的亲和力（如通过适当的技术确定的，如 Biacore，例如使用实施例12所述的方案确定的)。例如，在本发明的抗-IgE多肽中存在的 所述一种或多种针对IgE的ISV's (并且特别是纳米抗体)可以具有优于50nM，优选地优于 25nM，（KD1值-参见实施例12)和/或优于5nM，优选地优于2nM，如优于lnM(KD2值-同 样参见实施例12)的针对人IgE的亲和力（如使用Biacore确定的，例如使用实施例12所 述的方案确定的）；和优于50nM，如优于30nM(KDl值）和/或优于5nM，优选地优于2nM，如 优于InM(KD2值）的针对食蟹猴（cyno) IgE的亲和力。
[0027] 可以用在本发明的抗-IgE多肽中的针对IgE的纳米抗体的一些非限制性的实 例为 W004/041865 或 W004/041867 中所述的抗-IgE 纳米抗体，如 VHH#2C3, VHH#4G12， VHH#2C1， VHH#2H3, VHH#2D12, VHH#2G4, VHH#4C5, VHH#4A2, VHH#2D4, VHH#2B6 或 VHH#2H11 (见W004/041867的表14和SEQ ID NO's: 1-11)，或其人源化的和/或序列优化的 变体。可以用在本发明的抗-IgE多肽中的其他针对IgE的纳米抗体是本文中所述的抗-IgE 纳米抗体，如 39B02(SEQ ID N0:114)，39D8(SEQ ID N0:115)，42D7(SEQ ID N0:116)， 42G5(SEQ ID N0:117)，36G5(SEQ ID勵：118)或其人源化的和/或序列优化的变体，且特别 是39D11 (SEQ ID NO: 119)，即"39D11-型序列"（如本文定义）和特别是"39D11样"（如本 文定义），如39D11的人源化的和/或序列优化的变体，例如SEQ ID NO's :120-133的变体， 其中IGE026(SEQIDN0:128，在本文中还称为IGE0045或IgE66G02)是特别优选的实例。此 类结构单元(特别是当其存在于N末端时)的另一个特别优选的实例是在位置1具有E突变 为D的突变的IGE026。该结构单元在本文中还称为IgE66G02(ElD)或IgE66G02ElD(SEQID NO:129)。
[0028] 39D11的氨基酸序列为（其中的⑶R's以下划线和粗体表示。这些⑶R's也分别 在 SEQ ID NO' s: 134,136 和 137 中给出）：
[0029] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYDMSffffRQAPGKGPEffVSSIDTGGDITHYADSVKGRFT ISRDNANWMLYLQMNSLKPEDTAVYffCATDEDYALGPNEYDYYGQGTQVTVSS[SEQIDN0:I19，
[0030] 一种优选的39D11人源化的和序列优化的变体(与39D11相比其也是亲和力成熟 的)是IGE026 (也称为IgE0045)。IGE026的氨基酸序列是（其中的CDR's以下划线和粗体 表示。这些CDR's也分别在SEQ ID N0's:135，136和138中给出；应该理解39D11和IGE026 的 CDR2 是相同的）：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYDMAffVRQAPGKRPEwVSSIDTGGDITHY ADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYffCATDEETAKGPNEFDYYGQGTLVTMSS[SEQIDN0:1281
[0031] 如本文定义，"39D11-型序列"，"39D11-型ISV"或"39D11-型结构单元"在其最 广泛意义上为免疫球蛋白单可变结构域，并且特别是纳米抗体，其是这样的，以致（i)其与 39D11竞争与（人）IgE结合（例如，在适当的结合测定中，如在BIAcore测定中，例如，如 基本上实施例9中所述的BIAcore测定设置或α筛选测定，但是使用39D11替代奥马珠 单抗（omalizumab));和/或（ii)其与39D11结合（人）IgE上相同的表位；和/或（iii) 其交叉阻断（如W009/068627中定义）39D11与IgE的结合。39D11-型序列还优选地在 人IgE与食蟹猴IgE之间交叉反应，如本文进一步所述。"39D11型序列"，"39D11-型ISV" 或"39D11-型结构单元"优选地进一步是这样的，以致其（i)以优于8. KTkiM,优选地优于 6. KTiqM,如优于KTiqM,优于5. KT11M,优于2. KT11M或甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/ HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选 测定中）；和/或（ii)以优于5. 10_8Μ，优选地优于2. 10_8Μ，如优于10_8Μ，优于5. 10_9Μ，优于 2. KT9M,优于 KT9M,优于 5. KT10M 或优于 2. KT10M 的 IC50 值抑制 HuIgE/HuFc ( ε ) RII 相互 作用（例如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒 测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM或者甚 至优于0. 5nM的IC50值。
[0032] 因此，"39D11-型序列"也形成本发明的一部分。
[0033] 如本文定义，"39D11-样序列"，"39D11-样序列"，"39D11-样 ISV" 或 "39D11-样 结构单元"定义为包含下述的ISV (如本文所述）：
[0034] a)包含以下或基本上由以下组成的CDRl :⑴氨基酸序列SYDMS (SEQ ID NO: 134) 和/或氨基酸序列NYDMA(SEQIDN0:135)或（ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQIDN0:134) 和/或氨基酸序列NYDM(SEQ ID NO: 135)仅具有3、2或1个氨基酸差异（如本文定义） 的氨基酸序列；和/或
[0035] b)包含以下或基本上由以下组成的⑶R2 :⑴氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)或（ii)与氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列； 或（iii)与氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)仅具有 7,6,5,4,3,2 或 1 个 氨基酸差异（如本文定义）的氨基酸序列；和/或
[0036] c)包含以下或基本上由以下组成的CDR3 : (i)氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138)或（ii)与氨基酸序列 DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)和 / 或氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138)具有 至少80%，如至少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或（iii)与 氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQIDN0:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQID NO: 138)仅具有7,6, 5,4, 3, 2或1个氨基酸差异（如本文定义）的氨基酸序列；
[0037] 其中在此类ISV中存在的构架序列进一步如本文所述，并且其中⑶R1，⑶R2和 CDR3优选地是这样的，以致所述39D11-样ISV(i)以优于8. KTkiM,优选地优于6. KTkiM,如 优于KTiqM,优于5. KT11M,优于2. KT11M或甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中）； 和/或（ii)以优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M, 优于KT9M,优于5. KTiqM,或优于2. KTiqM的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RII相互作用（例 如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有 优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM，或甚至优于0. 5nM 的IC50值。
[0038] 优选地，在此类39D11-样序列中，⑶Rl和⑶R2分别如按照a)和b)定义；或者 CDRl和CDR3分别如按照a)和c)定义；或者CDR2和CDR3分别如按照b)和c)定义。更优 选地，在此类39D11-样序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3都分别如按照a)，b)和c)定义。同样 地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV:⑴以 优于8. KTwM,优选地优于6. KTwM,如优于KTkiM,优于5. KT11M,优于2. KT11M,或者甚至优 于KT11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定 中；在实施例6所述的α筛选测定中）；和/或（ii)以优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M, 如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M,优于KT9M,优于5. KTkiM,或优于2. KTkiM的IC50 值抑制HuIgE/HuFc( ε )RII相互作用（例如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或 (iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于 20nM，如优于5nM，优于InM，或者甚至优于0. 5nM的IC50值。
[0039] 例如，在此类39D11-样序列中：⑶Rl可以包含以下或基本上由以下组成：氨基 酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列 NYDMA(SEQ ID N0:135)(其中CDR2和CDR3分别如按照b)和c)定义）；和/或CDR2可以包 含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)(其中CDRl 和CDR3分别如按照a)和c)定义）；和/或CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基 酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQIDN0 :137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基 酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO: 138)(其中CDRl和CDR2分别如按照a)和b)定义）。 具体地，当39D11-样序列是按照这一方面所述时：CDRl可以包含以下或基本上由以下组 成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨基 酸序列NYDMA(SEQ ID NO: 135)，并且⑶R2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)(其中 CDR3 按照上述 c)定义）；和 / 或 CDRl 可以包 含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID N0:134)，并且优选地包含以下或 基本上由以下组成：氨基酸序列NYDMA(SEQ ID N0:135)，并且⑶R3可以包含以下或基本上 由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO: 137)，并且优选地包含以下或基本上 由以下组成：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO: 138)(其中CDR2按照上述b)定义）； 和/或⑶R2可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)，并且CDR3可以包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ IDN0:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成 ：氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ 10勵：138)(其中0?1按照上述&)定义）。同样地，在此类39011-样序列中，0)1?1，0)1?2 和CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV⑴以优于8. KTkiM,优选地优于6. KTkiM,如优 于KTiqM,优于5. KT11M,优于2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中）； 和/或（ii)以优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M, 优于KT9M,优于5. KTiqM,或者优于2. KTiqM的IC50值抑制HuIgE/HuFc( ε )RII相互作用 (例如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中 具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM，或者甚至优于 0· 5nM 的 IC50 值。
[0040] 在一种特别优选的39D11-样序列中：⑶Rl包含以下或基本上由以下组成： 氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成：氨 基酸序列NYDMA(SEQ ID NO: 135)，⑶R2包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136);并且CDR3包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序 列DEDYALGPNEYDY(SEQIDN0:137)，并且优选地包含以下或基本上由以下组成 ：氨基酸序 列 DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO:138)。
[0041] 在一个特别优选的方面中，"39D11-样序列"，"39D11-样ISV"或"39D11-样结构 单元"是包含下述的ISV :
[0042] d)CDRl，其为（i)氨基酸序列SYDMS(SEQIDN0:134)，并且优选是氨基酸序列 NYDMA(SEQ ID N0:135)或（ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQ ID N0:134)和/或氨基酸序列 NYDM(SEQ ID NO: 135)仅具有3、2或1个（如本文定义）氨基酸差异的氨基酸序列；和/ 或
[0043] e)CDR2,其为（i)氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)或（ii)与氨 基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG (SEQ ID NO: 136)具有至少80%，如至少85%，例如至少90%或 大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或（iii)与氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)仅具有7,6, 5,4, 3, 2或1个氨基酸差异（如本文定义）的氨基酸序列；和/或
[0044] f)CDR3,其为⑴氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)，并且优选是氨 基酸序列 DEEYALGPNEFDY (SEQ ID NO: 138)或（i i)与氨基酸序列 DEDYALGPNEYDY (SEQ ID NO: 137)和 / 或氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO: 138)具有至少 80%，如至 少85%，例如至少90%或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或（iii)与氨基酸序列 DEDYALGPNEYDY (SEQ ID NO: 137)和 / 或氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY (SEQ ID NO: 138)仅具 有7,6, 5,4, 3, 2或1个氨基酸差异（如本文定义）的氨基酸序列；
[0045] 其中在此类ISV中存在的构架序列进一步如本文所述，并且其中⑶R1，⑶R2和 CDR3优选地是这样的，以致所述39D11-样ISV(i)以优于8. KTiqM,优选地优于6. KT10M, 如优于KTiqM,优于5. KT11M,优于2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/ HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选 测定中）；和/或（ii)以优于5. 10_8Μ，优选地优于2. 10_8Μ，如优于10_8Μ，优于5. 10_9Μ，优于 2. KT9M,优于 KT9M,优于 5· ΙΟ'Μ，或者优于 2. KT10M 的 IC50 值抑制 HuIgE/HuFc ( ε ) RII 相 互作用（例如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗 粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM，或者 甚至优于0. 5nM的IC50值。
[0046] 优选地，在该特别优选的方面中所述的39D11-样序列中，⑶Rl和⑶R2分别如按 照d)和e)定义；或者CDRl和CDR3分别如按照d)和f)定义；或者CDR2和CDR3分别如 按照e)和f)定义。更优选地，在此类39D11-样序列中，⑶R1，⑶R2和⑶R3都分别如按照 d)，e)和f)定义。同样地，在此类39D11-样序列中，CDR1，CDR2和CDR3优选是这样的，以 致39D11-样ISV⑴以优于8. KTkiM,优选地优于6. KTkiM,如优于KTkiM,优于5. KT11M,优于 2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例 7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中）；和/或（ii)以优于5. 10_8Μ，优 选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M,优于KT9M,优于5. KTwM,或优于 2. KTiqM的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RII相互作用（例如，在实施例8所述的ELISA测 定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50ηΜ， 更优选地优于20ηΜ，如优于5ηΜ，优于InM，或者甚至优于0. 5ηΜ的IC50值。
[0047] 例如，在该特别优选的方面所述的39D11-样序列中：CDRl是氨基酸序列 SYDMS (SEQ ID NO: 134)，并且优选地是氨基酸序列NYDMA (SEQ ID NO: 135)(其中CDR2和 CDR3分别如按照e)和f)定义）；和/或CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)(其中⑶Rl和⑶R3分别如按照d)和f)定义）；和/或⑶R3是氨基酸序 列 DEDYALGPNEYDY (SEQ ID NO: 137)，并且优选地是氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY (SEQ ID NO: 138)(其中CDRl和CDR2分别如按照d)和e)定义）。具体地，当39D11-样序列是按 照该方面所述时：⑶Rl是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选地是氨基酸序列 NYDMA(SEQIDN0:135)，并且CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQIDN0:136)(其 中CDR3如上述f)定义）；和/或CDRl是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选 地是氨基酸序列NYDMA(SEQIDN0:135)，并且CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQID NO: 137)，并且优选地是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO: 138)(其中CDR2如上述e) 定义）；和/或CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID勵：136)，并且0?3是氨 基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO: 137)，并且优选地是氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138)(其中CDRl如上述d)定义）。同样地，在所述39D11-样序列中，CDR1，CDR2和 CDR3优选是这样的，以致39D11-样ISV(i)以优于8. KTkiM,优选地优于6. KTkiM,如优于 KTiqM,优于 5. KT11M,优于 2. KT11M,或者甚至优于 KT11M 的 IC50 值抑制 HuIgE/HuFc( ε )RI 相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中）；和 /或（ii)以优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M,优于 KT9M,优于5. KTwM,或优于2. KTwM的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RII相互作用（例如， 在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优 于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM，或者甚至优于0. 5nM 的IC50值。
[0048] 在特别优选的39D11-样序列中：CDRl是氨基酸序列SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并 且优选是氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO: 135)，CDR2是氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136);并且CDR3是氨基酸序列DEDYALGPNEYDY (SEQ ID NO: 137)，并且优选是氨基酸 序列 DEEYALGPNEFDY (SEQ ID NO: 138)。
[0049] 在本文所述的所有的39D11-样序列中，FR1，FR2, FR3和FR4序列分别优选是这 样的，以致综合来看，这些构架序列与39D11的构架序列（分别为SEQ ID NO' s: 139,141， 143和145)和/或IGE026的构架序列（分别为SEQ ID NO's: 140,142,144和146)具有至 少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性。例如并且不限于，39D11-样 序列中的FR1，FR2, FR3和FR4序列中的每一个分别与39D11的FR1，FR2, FR3和FR4序列 和/或与IGE026的FR1，FR2，FR3和FR4序列具有0-7个，如0-5个，如1，2,3或4个（适 当的）氨基酸差异。其他适当的构架序列可以基本上如W009/068627的273-291页所述 (在W009/068627关于针对IL-23的纳米抗体所述)。例如，参考W009/068627的表A-10至 A-25,以及W009/068627中表A-6至A-9所述的各种人源化取代。
[0050] 同样地，在给定序列中存在的⑶R' s与构架的组合优选是这样的，以致所得到的 39D11-样ISV⑴以优于8. KTwM,优选地优于6. KTkiM,如优于HTwM,优于5. KT11M,优于 2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例 7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选测定中）；和/或（ii)以优于5. 10_8Μ，优 选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优于5. KT9M,优于2. KT9M,优于KT9M,优于5. KTwM,或优于 2. KTiqM的IC50值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RII相互作用（例如，在实施例8所述的ELISA测 定中）；和/或（iii)在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50ηΜ， 更优选地优于20ηΜ，如优于5ηΜ，优于InM，或者甚至优于0. 5ηΜ的IC50值。
[0051] 在一个具体的方面中，39D11-样序列是与氨基酸序列39D11(SEQ ID Ν0:119)具有 至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性的ISV。例如，在 按照该方面所述的39D11-样序列中，CDR' s可以是按照上述特别优选的方面所述的，并且 可以特别是(但不限于)SYDMS(SEQ ID NO: 134)，并且优选是NYDMA(SEQ ID NO: 135) (CDRl); SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136) (CDR2);和 DEDYALGPNEYDY (SEQ ID NO: 137)，并且优 选是DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138) (CDR3)。同样地，优选地，在此类39D11-样ISV中存在 的⑶R' s和构架的组合优选是这样的，以致所得到的39D11-样ISV(i)以优于8. KTkiM,优 选地优于6. KT10M,如优于KT10M,优于5. KT11M,优于2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50 值抑制HuIgE/HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6 所述的α筛选测定中）；和/或（ii)以优于5. KT8M,优选地优于2. KT8M,如优于KT8M,优 于 5. KT9M,优于 2. KT9M,优于 KT9M,优于 ΙΟ'Μ，或优于 2. KT10M 的 IC50 值抑制 HuIgE/ HuFc( ε )RII相互作用（例如，在实施例8所述的ELISA测定中）；和/或（iii)在实施例 11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM， 优于InM，或者甚至优于0. 5nM的IC50值。
[0052] 在一个具体的方面中，任意39D11-样序列可以是39D11的人源化的和/或序列优 化的变体，如本文进一步所述。与39D11的序列相比，这些可以，例如且不限于，包含一个或 多个，如1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9或10个，并且基本上多至所有的下述突变（的任意组合):E1D， V5L，E6Q，F29Y，S31N，S35A 或 S36G，G44R，N73K，M77T 或 M77L，K83R，W91A，D97E，YlOOeF 和 /或Q108L(编号按照Kabat，例如，参见W008/020079的表A-5至A-8 ;并且每个字母按照标 准的单字母氨基密码表示一个氨基酸残基，对于其参考W008/020079的表A-2)。在另一个 方面中，与39D11的序列相比，这些可以，例如且不限于，包含一个或多个，如1，2,3,4,5,6， 7,8,9或10个，并且基本上多至所有的下述突变（的任意组合）疋10，￥51^46〇，？29￥，53謂， S35A 或 S35G，G44R，N75K，M77T 或 M77L，K83R，W91Y，D97E，YlOOeF 和 / 或 Q108L (编号按照 Kabat，例如，参见W008/020079的表A-5至A-8 ;并且每个字母按照标准的单字母氨基密码 表示一个氨基酸残基，对于其参考W008/020079的表A-2)。技术人员应该清楚，这些突变中 的一些是在⑶R's中，并且能够改善39D11-样序列（与39D11相比）的ISV针对IgE的亲 和性、功效、活性和/或其他生物学特性。其他适当的人源化和/或序列优化取代是技术人 员所清楚的，例如，通过本文进一步公开的内容和/或通过39D11序列与人VH序列的比较 (对于其，例如，同样参考W008/020079的表A-5至A-8)。
[0053] 在一个优选的方面中，所述39D11-样序列选自SEQ ID NO's: 120-133中的任一种 或是与SEQ ID NO's: 120-133中的任一种具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少 90%或大于95%的序列同一性的ISV。优选的39D11-样序列是SEQ ID NO' s: 128和129。
[0054] 39D11-样序列还优选地在人IgE和食蟹猴IgE之间交叉反应，如本文进一步所述。
[0055] 如已经提及的，通常，任意的" 39D11 -样序列"，" 39D11 -样序列"，" 39D11 -样ISV " 或"39D11-样结构单元"优选是这样的，以致其：（i)以优于8. KTkiM,优选地优于6. KTkiM, 如优于KTiqM,优于5. KT11M,优于2. KT11M,或者甚至优于KT11M的IC50值抑制HuIgE/ HuFc ( ε ) RI相互作用（例如，在实施例7所述的ELISA测定中；在实施例6所述的α筛选 测定中）；和/或（ii)以优于5. 10_8Μ，优选地优于2. 10_8Μ，如优于10_8Μ，优于5. 10_9Μ，优于 2. KT9M,优于 KT9M,优于 5· ΙΟ'Μ，或优于 2. KT10M 的 IC50 值抑制 HuIgE/HuFc ( ε ) RII 相互 作用（例如，在实施例8所述的ELISA测定中）。
[0056] 此外，任意的 "39D11-样序列"，"39D11-样序列"，"39D11-样 ISV" 或 "39D11-样 结构单元"优选是这样的，以致其在实施例11所述的脱颗粒测定中具有优于ΙΟΟηΜ，优选地 优于50nM，更优选地优于20nM，如优于5nM，优于InM，或者甚至优于0. 5nM的IC50值。
[0057] 因此，所述"39D11-样序列"也形成本发明的一部分。
[0058] 针对IgE的ISV，特别是"39D11-型序列"和"39D11-样序列"，可以进一步包含或 可以不进一步包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位。如果存在，所述其他 基团、残基、结构部分或结合单位可以为或可以不为所述免疫球蛋白单可变结构域（和/或 存在其的多肽）提供进一步的官能性，并且可以改变或可以不改变所述免疫球蛋白单可变 结构域的特性。
[0059] 例如，所述其他基团、残基、结构部分或结合单位可以是一种或多种另外的氨基酸 序列，以使所述多肽是(融合）蛋白或(融合）多肽。
[0060] 如上文所述，可以连接另外的结合单位以形成多特异性多肽。
[0061] 在上述多肽中，所述一个、两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域以及所述一个 或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以直接和/或通过一个或多个适当的接头或间 隔体彼此连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列时， 所述接头可以也是氨基酸序列，以致所得到的多肽是融合(蛋白）或融合(多肽)。
[0062] 所述一个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单位可以是任意适当的和/ 或需要的氨基酸序列。所述另外的氨基酸序列可以转变、改变或另外影响或可以不转变、改 变或另外影响融合多肽的（生物学）特性，并且可以为或可以不为所述融合多肽增加另外的 官能性。优选地，所述另外的氨基酸序列是这样的，以致其赋予所述融合多肽一种或多种需 要的特性或官能性。
[0063] 此类氨基酸序列的实例是技术人员所清楚的，并且通常可以包括用在基于常规 抗体及其片段(包括，但不限于，ScFv' s和单结构域抗体）的肽融合体中的所有的氨基酸 序列。例如，参考Holliger和Hudson的综述（Nature Biotechnology (自然生物技术） 23:1126-1136,2005)。
[0064] 例如，此类氨基酸序列可以是与ISV本身相比增加（融合）多肽的半衰期、溶解性、 或吸收，减少免疫原性或毒性，消除或减弱不理想的副作用，和/或赋予其他有利的特性和 /或减少不理想的特性的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸 如人血清白蛋白（参见，例如W000/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，参 见例如 W098/22141)。
[0065] 在本发明的一个具体的方面中，制备与相对应的针对IgE的ISV相比具有增加的 半衰期的多肽。包含此类延长半衰期的结构部分的本发明的多肽的实例例如包括但不限 于，这样的多肽，其中所述免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个血清蛋白或其 片段(如（人）血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个能够与血清蛋白结合的结合 单位(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用 作单结构域抗体的氨基酸序列，"dAb"' s，适合用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体)，其可 以结合血清蛋白如血清白蛋白（如人血清白蛋白），血清免疫球蛋白（如IgG)，转铁蛋白或 W004/003019中列出的其他血清蛋白中的一种；包括这样的多肽，其中免疫球蛋白单可变 结构域连接Fc部分（如人Fe)或其是适当的部分或片段；或包括这样的多肽，其中所述一 个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或 肽(诸如，但不限于，W091/01743，W001/45746或W002/076489中所述的蛋白和肽)。也参考 W003/002609 和 W004/003019 中所述的 dAb's 和 Harmsen 等（Vaccine (疫苗)23:4926-42, 2005);参考EP0368684，以及埃博灵克斯股份有限公司的W008/028977、W008/043821、 W008/043822,和 W008/068280, W009/127691，US2011/0243954 与 W02011/095545。
[0066] 按照本发明的一个具体的而非限制性的方面，除了所述一个、两个或更多个针对 IgE的免疫球蛋白单可变结构域之外，本发明的多肽可以包含至少一个针对人血清白蛋白 的肽(如进一步定义的)。
[0067] 通常，具有增加的半衰期的本发明的多肽优选地具有是相对应的本发明的免疫球 蛋白单可变结构域或多肽本身的半衰期的至少1. 5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如 至少10倍或超过20倍的半衰期。
[0068] 通常，与相对应的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽本身相比，具有增加 的半衰期的本发明的多肽优选地具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小 时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
[0069] 在另一个优选而非限制性方面中，本发明的此类多肽在人中表现出至少约12小 时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。 例如，本发明的多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、 更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12 天(诸如约12-18天或更多）、或超过14天(诸如约14-19天）的半衰期。
[0070] 所述另外的氨基酸残基可以转变、改变或者另外影响或者可以不转变、改变或者 另外影响所述(融合）多肽的其他(生物学）特性，并且可以为或者可以不为所述(融合）多肽 添加另外的官能性。例如，所述氨基酸残基：
[0071] a)可以包括N-端Met残基，例如，由于在异源宿主细胞或宿主生物体内表达所 致；
[0072] b)可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述(融合）多肽从宿主细 胞中分泌(例如，取决于用于表达所述(融合）多肽的宿主细胞，提供所述(融合）多肽的 前-(pre_)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式)。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的 技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述(融合)多 肽的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
[0073] c)可以形成"标记"，例如允许或促进所述(融合）多肽的纯化的氨基酸序列或残 基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除 (例如，通过化学或酶促裂解)，以提供所述多肽(为了这一目的，所述标记可以任选地通过 可裂解的接头序列与所述氨基酸序列或多肽序列连接或包含可裂解的基序)。此类残基的 一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽（glutatione)残基以及myc-标 记如 AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQ ID N0:193);
[0074] d)可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸 残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本 文为本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
[0075] 因此，所述一种或多种ISVs可以用作用于制备（融合）多肽的"结合单位"、"结合 结构域"或"结构单元"（这些术语可互换使用），所述(融合）多肽可以任选地包含一种或多 种其他结合单位（即，针对IgE上相同的或另一个表位和/或针对一种或多种不同于IgE的 抗原、蛋白或祀标)。
[0076] 包含本文所述的⑶R序列的ISVs特别适合用作结构单元或结合单位用于制备(融 合）多肽。
[0077] 因此，本发明还涉及本文所述的ISVs在制备多价多肽中的应用。用于制备多价多 肽的方法包括连接ISV与至少一个另外的结合单位,任选地通过一个或多个接头连接。然 后，如本文定义的ISV用作结合结构域或结合单位，以提供和/或制备包含两个(例如，在二 价多肽中)、三个(例如，在三价多肽中）或更多个(例如，在多价多肽中）结合单位的多价多 肽。在这一点上，如本文所述的IVS可以用作结合结构域或结合单位以提供和/或制备包 含两个、三个或更多个结合单位的多价多肽，如二价或三价多肽。
[0078] 结合血清白蛋白的狀
[0079] 可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽通常可以如 W008/068280，W009/127691中所述，并且特别如W02011/095545中所述。因此，关于这些肽 的一般描述，参考这些申请。
[0080] 如在这些申请中提及的，这些肽可以具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15， 20,25或30个氨基酸残基的总长度，并且是这样的，以致其能够结合到（人）血清白蛋白 (中）的亚口袋（subpocket)中，所述亚口袋包含人血清白蛋白的(至少)一个或多个以下氨 基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491 和 / 或 V493(编号如 W009/127691 的实施例8所述)。这些申请还提到这些肽可以与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治 疗性实体连接或融合，从而增加其半衰期。
[0081] W008/068280 记述了多种此类肽，包括氨基酸序列 AASYSDYDVFGGGTDFGP(SEQ ID NO: 19)，其在TO08/068280 中称为" 17D12"，并且其在TO08/068280 中以 SEQ ID NO: 3 列出。
[0082] W009/127691记述了 17D2的多种改进的变体，其通常与SEQ ID NO: 19的氨基酸序 列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少 90%，但不是100%的序列同一性（如本文定义），并且与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列相比， 其能够更好地结合人血清白蛋白。
[0083] 具体地，W009/127691所述的一些优选的肽包含：
[0084] ⑴Arg (R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn (N) 133和 Asn (N) 135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro (P) 134和Leu (L) 136残基的主链氧 原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或
[0085] (ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R) 138残基形成静电相互作 用的Trp (W)残基；和/或
[0086] (iii)序列基序 GGG ；
[0087] 并且优选地（i)，（ii)和（iii)中的至少任意两种，并且更优选地全部三种。
[0088] 具体地，W009/127691中所述的一些示例性的肽可以，例如，包含一种或多种下述 特征：
[0089] ⑴序列基序RXWD，其中X可以是任意氨基酸序列，但是优选为W，Y，F，S或D ;和 /或
[0090] (i i)序列基序GGG，优选序列基序FGGG (SEQ ID NO: 24)，更优选序列基序 DVFGGG(SEQ ID NO: 33)，并且特别是序列基序 DVFGGGT (SEQ ID NO: 37);
[0091] 并且更优选这两个序列基序（i)和（ii)。
[0092] W02011/095545记述了 W009/127691中所述的肽的一些甚至进一步改善的 变体，与W009/127691中所述的肽相比，其进一步包含上文提及的Arg(R)残基(按照 W008/068280, W009/127691和W02011/095545中所用的编号方式，其在位置3)的上游（如 W02011/095545中定义的)，并且特别是上文提及的RXWD基序的上游，其为2-10个氨基酸残 基的氨基酸残基区段，其包含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基(并且对于其余部分一 个或多个更多的适合的氨基酸残基，如例如在W02011/095545中所示例的)，其中所述至少 一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其中所述至少一个芳香氨基酸 残基可以特别地选自W，Y和/或F。优选地，所述位置3上游的氨基酸区段优选是这样的， 以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的亚口 袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的(至少)一个或多个以下氨基酸残基：V442，S443， T446, L484, L487, H488, K490, T491 和 / 或 V493。特别地，W02011/095545 中所述的结合白 蛋白的肽可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个 W残基和/或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清 白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残 基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491 和 / 或 V493。更特别地，所述氨基酸残 基区段可以包含：（i)至少两个W残基；（ii)至少两个Y残基；和/或（iii)至少一个W残 基和至少一个Y残基，以使所述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的 亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442， S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491和/或V493。可以存在于位置3上游的所述氨基 酸残基区段的一些非限制性的实例在SEQ ID NO' s:72-92中给出（W02011/095545的SEQ ID NO' s:78-98)。
[0093] W02011/095545进一步描述了，在本文所述的肽中，下述是可能的，并且甚至可能 是有利的：（i)用苏氨酸（T)残基替代位置8的天冬氨酸（D)残基(例如，但不限于，在位置 14不包含苏氨酸残基的本发明的氨基酸序列中）;和/或（ii)用另一种氨基酸残基替代位 置14的苏氨酸⑴残基，如（例如但不限于）A，N或D。
[0094] 例如，可以存在于W02011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些序列基序为：
[0095] -如W02011/095545中所述的在位置3上游的氨基酸残基区段(也参见本文前述 段落）。例如，这可以是W02011/095545的SEQ ID N0's:78-98的序列（在本文中为SEQ ID NO' s :72-92)中的一种，或是与这些序列中的至少一种具有2个或仅有1个"氨基酸差 异"--如W02011/095545中定义的--的序列；
[0096] 其与下述序列基序中的一种组合：
[0097] -氨基酸序列 RXWDXDVFGGG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:23 ;在本文中为 SEQ ID NO: 93)，其中第一个(从N末端)由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示 的氨基酸残基选自Y或F ;
[0098] -氨基酸序列 RXWDXDVFGGGT(W02011/095545 的 SEQ ID N0:24 ;在本文中为 SEQ ID NO: 94)，其中第一个(从N末端)由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示 的氨基酸残基选自Y或F ;
[0099] -氨基酸序列 RXWDXDVFGGGTP(W02011/095545 的 SEQ ID N0:25 ;在本文中为 SEQ ID NO: 95)，其中第一个(从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X 表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0100] -氨基酸序列 RXWDXDVFGGGTPG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:26 ;在本文中为 SEQ ID NO: 96)，其中第一个(从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X 表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0101] -氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(W02011/095545 的SEQ ID N0:27 ;在本文中为 SEQ ID NO: 97)，其中第一个(从N末端）由X表示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X 表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0102] -选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:28 ;在 本文中为 SEQ ID N0:98) ;RDWDFDVFGGG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:29 ;在本文中 为 SEQ ID N0:99);RSTOFDVFGGG(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:30;在本文中为 SEQ ID N0:100)或RYTOFDVFGGG(TO2011/095545 的SEQIDN0:31;在本文中为SEQIDN0:101); 并且特别选自 RDWDFDVFGGG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:28 ;在本文中为 SEQ ID N0:98);RSWDFDVFGGG(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:29;在本文中为 SEQ ID N0:99)或 RYWDFDVFGGG(W02011/095545 的 SEQ ID N0:30;在本文中为 SEQ ID N0:100);
[0103] -选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGT(W02011/095545 的 SEQ ID N0:32 ;在 本文中为 SEQ ID N0:102);RDWDFDVFGGGT(W02011/095545 的 SEQ ID N0:33;在本文中 为 SEQ ID N0:103) ;RSWDFDVFGGGT(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:34;在本文中为 SEQ ID N0:104)或 RYWDFDVFGGGT(W02011/095545 的 SEQ ID N0:35;在本文中为 SEQ ID N0:105); 并且特别地选自 RDWDFDVFGGGT(W02011/095545 的 SEQ ID N0:33;在本文中为 SEQ ID N0:103) ;RSWDFDVFGGGT(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:34;在本文中为 SEQ ID N0:104)或 RYWDFDVFGGGT(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:35;在本文中为 SEQ ID N0:105);
[0104] -选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTP(W02011/095545 的 SEQ ID N0:36 ;在 本文中为 SEQ ID N0:106);RDWDFDVFGGGTP(W02011/095545 的 SEQ ID N0:37;在本文中 为 SEQ ID N0:107) ;RSWDFDVFGGGTP(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:38;在本文中为 SEQ ID N0:108)或RYWDFDVFGGGTP(W02011/095545 的SEQ ID N0:39;在本文中为 SEQ ID N0:109); 并且特别是选自 RDWDFDVFGGGTP(W02011/095545 的 SEQ ID N0:37 ;在本文中为 SEQ ID N0:107) ;RSWDFDVFGGGTP(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:38;在本文中为 SEQ ID N0:108)或 RYWDFDVFGGGTP(W02011/095545 的 SEQ ID N0:39;在本文中为 SEQ ID N0:109);
[0105] -选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTPV(W02011/095545 的 SEQ ID N0:40 ; 在本文中为 SEQ ID N0:110) ;RDWDFDVFGGGTPV(W02011/095545 的 SEQ ID N0:41;在本文 中为SEQIDN0:111);RSTOFDVFGGGTPV(TO2011/095545 的SEQIDN0:42;在本文中为 SEQ ID N0:112)或 RYWDFDVFGGGTPV(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:43;在本文中为 SEQ ID N0:113);并且特别是选自 RDWDFDVFGGGTPV(W02011/095545 的 SEQ ID N0:41;在本文 中为 SEQ ID N0:lll);RSWDFDVFGGGTPV(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:42;在本文中为 SEQ ID N0:112)或 RYWDFDVFGGGTPV(TO2011/095545 的 SEQ ID N0:43;在本文中为 SEQ ID NO:113)。
[0106] 因此，可以存在于W02011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些其他的（非限 制性的）序列基序为：
[0107] -W02011/095545 的 SEQ ID NO' s :24-27(在本文中为 SEQ ID NO' s :94-97)或 W02011/095545的32-43(在本文中为SEQ ID NO's: 102-113)的序列基序中的任一种所述 的氨基酸序列，其中位置14的苏氨酸（T)残基被另一种氨基酸残基（优选但不限于，A，N 或D)替代；
[0108] -W02011/095545 的 SEQ ID N0's:23-43(在本文中为 SEQ ID N0's:93-113)的序 列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置8的天冬氨酸（D)被苏氨酸（T)替代；
[0109] -W02011/095545 的 SEQ ID NO' s :24-27(在本文中为 SEQ ID NO' s :94-97)或 W02011/095545的32-43(在本文中为SEQ ID NO's: 102-113)的序列基序中的任一种所述 的氨基酸序列，其中（i)位置14的苏氨酸（T)残基被另一种氨基酸残基（优选但不限于， A，N或D)替代，并且（ii)位置8的天冬氨酸⑶被苏氨酸⑴替代。
[0110] 还如W02011/095545中所述，所有这些序列基序都可以包含一种或多种其他适当 的取代，如(例如且不限于）W02011/095545的表I中列出的一种或多种取代。
[0111] W02011/095545和W009/127691还描述了其中所述的两种或更多种（如两种）肽 (其可以是相同的或不同的）可以彼此连接(直接连接或通过适当的接头连接，所述接头例 如，GS-接头，如本文中SEQ ID NO: 164的9GS接头)，从而提供两个(或更多个)所述结合血 清白蛋白的肽的"串联重复"。这些申请还提及这些肽能够与治疗性结构部分、化合物、蛋白 或其他治疗性实体连接或融合，从而增加其半衰期。
[0112] 如所提及的，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的一种或多种肽 通常可以如W008/068280, W009/127691中所述，并且特别如W02011/095545中所述。
[0113] 因此，在一个方面中，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽可以 是总长度为5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15, 20, 25或30个氨基酸残基的肽(作为 单一重复)，其是这样的，以致其能够结合到（人）血清白蛋白中的亚口袋（中），所述亚口 袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487， H488, K490, T491 和 / 或 V493 (编号如 W009/127691 的实施例 8 所述）。
[0114] 特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽(作为单一重复或 串联重复)可以是这样的肽，以致所述肽与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少50%，优选 至少65%，更优选至少70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序 列同一性（如本文定义），并且与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血 清白蛋白。
[0115] 更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽(作为单一重复 或串联重复）可以是这样的肽，以致所述肽包含：
[0116] ⑴Arg (R)残基，特别是能够与人血清白蛋白的氨基酸残基Asn (N) 133和 Asn (N) 135形成氢键和/或能够与人血清白蛋白的Pro (P) 134和Leu (L) 136残基的主链氧 原子形成静电相互作用的Arg(R)残基；和/或
[0117] (ii)Trp(W)残基，特别是能够与人血清白蛋白的Arg(R) 138残基形成静电相互作 用的Trp (W)残基；和/或
[0118] (iii)序列基序 GGG ;
[0119] 并且优选地还包含：
[0120] (iv)在所述Arg(R)残基的上游的：2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包 含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基(并且对于其余部分一个或多个更多的适合的氨基 酸残基)，其中所述至少一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其中 所述至少一个芳香氨基酸残基可以特别地选自W，Y和/或F。特别地，所述位置3上游的 氨基酸区段优选是这样的，以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合到 (人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以 下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491 和 / 或 V493 ;并且特别地 可以在位置3的上游包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个W残基和 /或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的 亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442， S443，T446，L484，L487，H488，K490，T491和/或V493 ;并且更特别地可以包含：（i)至少两 个W残基；（ii)至少两个Y残基；和/或（iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使所 述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含 人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488， K490, T491和/或V493。例如，在存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽中 (作为单一重复或串联重复），位置3上游的氨基酸区段可以选自W02011/095545的SEQ ID NO' s :78-98 (在本文中为 SEQ ID NO' s :72-92)。
[0121] 甚至更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽（作为单一 重复或串联重复）可以是这样的肽：
[0122] a)其具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15, 20, 25或30个氨基酸残基的总 长度(作为单一重复）；并且
[0123] b)其是这样的，以致其能够结合到（人）血清白蛋白中的亚口袋（中），所述亚口 袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487， H488, K490, T491 和 / 或 V493 ;并且
[0124] c)其与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少70%， 甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性（如本文定义）； 并且
[0125] d)其是这样的，以致与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血 清白蛋白；并且
[0126] e)其包含一个或多个下述序列基序：DYDV(SEQ ID NO:20)，YDVF(SEQ ID NO:21)， DVFG(SEQIDN0:22)，VFGG(SEQIDN0:23)，FGGG(SEQIDN0:24)和/或GGGT(SEQID N0:25)，并且特别是一个或多个序列基序：DYDVF(SEQ ID N0:26)，YDVFG(SEQ ID N0:27)， DVFGG(SEQ ID NO:28)，VFGGG(SEQ ID NO:29)，FGGGT(SEQ ID NO:30)，DYTVF(SEQ ID N0:44)，YTVFG(SEQ ID N0:45)或 TVFGG(SEQ ID N0:46);并且特别是一个或多个序列基 序：DYDVFG(SEQ ID N0:31)，YDVFGG(SEQ ID N0:32)，DVFGGG(SEQ ID N0:33)，VFGGGT(SEQ ID NO:34)，DYTVFG(SEQ ID NO:47)，YTVFGG(SEQ ID NO:48)或 TVFGGG(SEQ ID NO:49)，甚 至更特别地是一个或多个序列基序：DYDVFGG(SEQ ID N0:35)，YDVFGGG(SEQ ID N0:36)， DVFGGGT(SEQ ID N0:37) ；DYTVFGG(SEQ ID N0:50),YTVFGGG(SEQ ID NO:51),TVFGGGT,(SEQ ID NO:52)，DVFGGGA(SEQ ID NO:53)，DVFGGGN(SEQ ID NO:54)，DVFGGGD(SEQ ID NO:55), TVFGGGA(SEQ ID NO:56)，TVFGGGN(SEQ ID NO:57)或 TVFGGGD(SEQ ID NO:58)，如一个 或多个序列基序：DYDVFGGG(SEQ ID N0:38)，YDVFGGGT(SEQ ID N0:39) ;DYDVFGGGT(SEQ ID NO:40) ；DYTVFGGG(SEQ ID NO:59), YTVFGGGT(SEQ ID NO:60), YDVFGGGA(SEQ ID N0:61), YDVFGGGN(SEQ ID N0:62), YDVFGGGD(SEQ ID N0:63) ；YTVFGGGA(SEQ ID N0:64), YTVFGGGN(SEQ ID N0:65)或 YTVFGGGD(SEQ ID N0:66);
[0127] f)在e)所述的序列基序上游，例如，在位置3-6,其包含序列基序RXWD，其中X可 以是任意氨基酸序列，但优选是W，Y，F，S或D ;和/或
[0128] g)在所述序列基序RXWD上游，其包含：2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其 包含至少一个疏水和/或芳香氨基酸残基(并且对于其余部分一个或多个更多的适合的氨 基酸残基)，其中所述至少一个疏水氨基酸残基可以特别地选自L，I，V和/或M和/或其 中所述至少一个芳香氨基酸残基可以特别地选自W，Y和/或F。特别地，所述位置3上游 的氨基酸区段优选是这样的，以致所述疏水和/或芳香氨基酸残基中的至少一个能够结合 到（人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个 以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491 和 / 或 V493 ;并且其可 以在位置3上游特别包含2-10个氨基酸残基的氨基酸残基区段，其包含至少一个W残基和 /或至少一个Y残基，以致所述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的 亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442， S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491和/或V493 ;并且更特别地可以包含（i)至少两 个W残基；（ii)至少两个Y残基；和/或（iii)至少一个W残基和至少一个Y残基，以使所 述W或Y残基中的至少一个能够结合到（人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含 人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488， K490, T491和/或V493。例如，在存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽 (作为单一重复或串联重复)中，在位置3上游的氨基酸区段可以选自W02011/095545的SEQ ID NO, s :78-98 (SEQ ID NO, s :72-92)。
[0129] 甚至更特别地，存在于本发明的抗-IgE多肽中的结合血清白蛋白的肽（作为单一 重复或串联重复）可以是这样的肽：
[0130] i)其具有5-50、优选7-40、更优选10-35、如约15, 20, 25或30个氨基酸残基的总 长度(作为单一重复）；并且
[0131] ii)其是这样的，以致其能够结合到（人）血清白蛋白中的亚口袋（中），所述亚口 袋包含人血清白蛋白的（至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487， H488, K490, T491 和 / 或 V493 ;并且
[0132] iii)其与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少50%，优选至少65%，更优选至少 70%，甚至更优选至少75%，如至少80%，如至少90%，但不是100%的序列同一性（如本文定 乂）；并且
[0133] iv)其是这样的，以致与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列相比，其能够更好地结合人血 清白蛋白；
[0134] 并且包含：
[0135] V)在位置3上游的如W02011/095545中所述的且特别是如上述g)所述的氨基酸 残基区段。这可以是，例如，本文的SEQ ID NO' s:72-92的序列中的一种，或是与这些序列 中的至少一种具有2个或仅有1个"氨基酸差异"--如W02011/095545中定义的--的 序列。
[0136] 其与下述序列基序中的一种组合：
[0137] vi)氨基酸序列RXWDXDVFGGG(SEQ ID N0:93)，其中第一个(从N末端)由X表示的 氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0138] vii)氨基酸序列RXWDXDVFGGGT(SEQ ID N0:94)，其中第一个(从N末端)由X表示 的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0139] viii)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTP(SEQ ID N0:95)，其中第一个(从N末端）由X表 示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0140] ix)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPG(SEQIDN0:96)，其中第一个(从N末端）由X表 示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0141] x)氨基酸序列RXWDXDVFGGGTPGG(SEQIDN0:97)，其中第一个(从N末端）由X表 示的氨基酸残基选自Y，S或D ;并且第二个由X表示的氨基酸残基选自Y或F ;
[0142] xi)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGG(SEQ ID N0:98);
[0143] RDWDFDVFGGG(SEQ ID NO:99) ;RSWDFDVFGGG(SEQ ID NO: 100)或RYffDFDVFGGG(SEQ ID NO: 101);并且特别是选自：
[0144] RDWDFDVFGGG(SEQ ID N0:98) ;RSWDFDVFGGG(SEQ ID N0:99)或 RYWDFDVFGGG(SEQ ID NO:100)；
[0145] xii)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGT(SEQ ID N0:102);
[0146] RDWDFDVFGGGT (SEQ ID NO: 103) ;RSWDFDVFGGGT (SEQ ID NO: 104)或 RYWDFDVFGGGT(SEQ ID N0:105);并且特别是选自：
[0147] RDWDFDVFGGGT (SEQ ID NO: 103) ;RSWDFDVFGGGT (SEQ ID NO: 104)或 RYffDFDVFGGGT(SEQ ID NO:105)；
[0148] xiii)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTP(SEQ ID N0:106);
[0149] RDWDFDVFGGGTP (SEQ ID NO: 107) ;RSWDFDVFGGGTP (SEQ ID NO: 108)或 RYWDFDVFGGGTP(SEQ ID N0:109);并且特别是选自：
[0150] RDWDFDVFGGGTP (SEQ ID NO: 107) ;RSWDFDVFGGGTP (SEQ IDN0: 108)或 RYffDFDVFGGGTP(SEQ ID NO:109)；
[0151] xiv)选自以下的氨基酸序列：RYWDYDVFGGGTPV(SEQ ID N0:110);
[0152] RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO: 111) ;RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID NO: 112)或 RYWDFDVFGGGTPV(SEQ ID N0:113);并且特别是选自：RDWDFDVFGGGTPV(SEQ ID N0:111); RSWDFDVFGGGTPV(SEQ ID N0:112)或 RYWDFDVFGGGTPV(本文中的 SEQ ID N0:113)。
[0153] 因此，可以存在于W02011/095545所述的结合白蛋白的肽中的一些其他的（非限 制性）序列基序为：
[0154] i)SEQ ID NO' s:94-97或102-113的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其 中位置14的苏氨酸（T)残基被另一种氨基酸残基（优选但不限于，
[0155] A，N 或 D)替代；
[0156] ii)SEQ ID NO' s:93-113的序列基序中的任一种所述的氨基酸序列，其中位置8 的天冬氨酸（D)被苏氨酸（T)替代；
[0157] iii)SEQ ID N0's:94-97 或 SEQ ID N0's:102-113 的序列基序中的任一种所述的 氨基酸序列，其中（i)位置14的苏氨酸（T)残基被另一种氨基酸残基（优选但不限于，A， N或D)替代，并且（ii)位置8的天冬氨酸⑶被苏氨酸⑴替代。
[0158] 可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽(作为单一重复 或串联重复）的一些优选的但非限制性的实例是W009/127691的SEQ ID NO' s:2-115或 147-157的序列。
[0159] 可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽(作为单一重复 或串联重复）的一些非限制性的实例是W02011/095545的SEQ ID NO' s:54-74或103-108 的序列。
[0160] 可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述结合血清白蛋白的肽(作为单一重复 或串联重复）的一些特别优选的但非限制性的实例是SEQ ID NO's: 1-8的序列。SEQ ID NO' s:9-18是可以存在于本发明的抗-IgE多肽中的所述肽的串联重复的一些优选的但非 限制性的实例。
[0161] 本发明的多狀
[0162] 在本发明的抗-IgE多肽中，所述一个或多个(如一个或两个）针对IgE的ISV' s (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列)和所述一 个或多个(如一个或两个）结合血清白蛋白的肽可以适当地彼此连接，直接连接或通过一个 或多个适当的间隔臂或接头连接。例如，所述接头可以是"GS接头"(即，基本上由G和S残 基组成的接头)，如SEQ ID勵'8:162-171中的一种接头，其中965,2065,3065和3565接头 可能是特别适合的。在一些情形中，20GS接头的使用可能优于9GS接头，原因在于在一些情 形中，与通过9GS接头连接的结合白蛋白的肽相比，通过20GS接头连接的结合白蛋白的肽 表现出改善的（即，较少的）对(蛋白水解）降解的敏感性。
[0163] 例如，并且不限于，本发明的抗-IgE多肽可以包含：
[0164] -单个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列）和如本文所述的单个结合白蛋白的肽；它们可以直接或通过适当的 接头彼此连接；
[0165] -单个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列）和两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽(它们可以是相同的或不 同的，并且它们可以直接或通过适当的接头(如SEQ ID NO: 164的9GS接头）彼此连接）的 串联重复；它们可以直接或通过适当的接头彼此连接；
[0166] -单个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列)和两个如本文所述的单个结合白蛋白的肽(它们可以如本文所述，并 且它们可以是相同的或不同的）；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
[0167] -两个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和如本文所述的单个结合白蛋白的 肽；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
[0168] -两个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和由两个如本文所述的单个结合白 蛋白的肽(它们可以是相同的或不同的，并且它们可以直接或通过适当的接头彼此连接）形 成的串联重复；它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接；
[0169] -两个针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如39D11-型序列，并且 特别是39D11-样序列）（它们可以是相同的或不同的）和两个如本文所述的单个结合白蛋 白的肽(它们可以如本文所述，并且它们可以是相同的或不同的）；它们可以直接或通过一 个或多个适当的接头彼此连接。
[0170] 本发明的所述抗-IgE多肽的一些非限制性的实例可以示例性表示如下：其中 "[肽]"表示如本文所述的结合血清白蛋白的肽，"[肽-肽]"表示两个如本文所述的结 合血清白蛋白的肽(它们可以是相同的或不同的，并且它们可以直接或通过适当的接头连 接）的串联重复，"[抗-IgE] "表示针对IgE的ISV (并且特别是针对IgE的纳米抗体，如 39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列表示适当的接头(这是可选的)，N端在左 手侧，C端在右手侧。应该注意到，当下述示例性表示的多肽分别包含两个结合血清白蛋白 的肽或两个针对IgE的ISV' s时，这些可能是相同的或不同的。
[0171] [肽]-[抗-IgE]
[0172] [肽-肽]-[抗-IgE]
[0173] [抗-IgE]-[肽]
[0174] [抗-IgE]-[肽-肽]
[0175] [肽]-[抗-IgE]-[肽]
[0176] [肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]
[0177] [肽-肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]
[0178] [抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽]
[0179] [抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽-肽]
[0180] [抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]
[0181] [抗-IgE]-[肽-肽]-[抗-IgE]
[0182] [肽]-[抗-IgE]-[抗-IgE]-[肽]
[0183] [抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]-[肽]
[0184] [肽]-[抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]
[0185] [肽]-[抗-IgE]-[肽]-[抗-IgE]-[肽]
[0186] 从上文应该清楚，所述抗-白蛋白肽可能位于N端，可能位于C端，或者可能是接 头的一部分；或者，当存在多于一个结合白蛋白的肽时，可以是其任意适当的组合。在一个 优选的但非限制性的方面中，结合白蛋白的肽位于C端(例如，比较实施例15中给出的结 果)。
[0187] 优选地，本发明的抗-IgE多肽包含一个或两个、且更优选地仅一个针对IgE的ISV 和仅一个结合血清白蛋白的肽(或一个由两个结合血清白蛋白的肽形成的串联重复)。
[0188] 如提及的，在这些多肽和构建体中存在的针对IgE的ISV优选是针对IgE的纳米 抗体，如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序列，其中IGE026/IGE0045 (SEQ ID NO: 128) 是特别优选的实例。针对血清白蛋白的肽优选地选自SEQ ID NO' s:l-8的"单一重复"肽 或SEQ ID NO' s:9-18的"串联重复"肽。存在的接头(如果有一些的话）优选地选自SEQ ID N0' 8:162-171，其中特别优选965,2065,3065和3565。
[0189] 在一个具体而非限制性的方面中，本发明的多肽是这样的，以致，当在实施例16 所述的保存稳定性测定中检测时，对于在25° C保存1月后(在实施例16给出的进一步的 条件下）的所述多肽，在SE-HPLC上的前峰（pre-peak)少于10%，优选地少于5% ;和/或对 于在40° C保存1月后（在实施例16给出的进一步的条件下）的所述多肽，在SE-HPLC上 的前峰少于20%，优选地少于10%。例如，参考表19的比较结果。
[0190] 本发明的抗-IgE多肽的一些优选的但非限制性的实例在SEQ ID NO' s: 147-161 中给出（还参见表A-9)。本发明还涉及选自SEQ ID N0's:147-161的任一种的多肽，或与 SEQ ID NO' s: 147-161的任一种具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%的序 列同一性的多肽。
[0191] 在这些中，IGE109(IGE66G02E1D-20GS-NEXP001-9GS-NEXP002) (SEQ ID N0:155) 是特别优选的。因此，本发明的一个具体方面涉及与SEQ ID NO: 155具有至少80%，如至少 85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性的多肽。所述多肽优选地如本文进一步所述， 并且优选地按照本文提及的优选方面所述。
[0192] 如本文已经提及，与本领域已经记述的抗-IgE纳米抗体(如W004/041867中所述 的那些）相比，39D11及其如本文所述的变体（如39D11-型序列，并且特别是39D11-样序 列）通常还可能具有多种优点。基于本文记载的公开内容和数据，这些通常是技术人员应 该清楚的，并且例如，但不限于，这些可以是：
[0193] -39D11，39D11-型序列和39D11-样序列在人IgE与食蟹猴IgE之间交叉反应（如 本文进一步所述）；
[0194] -39D11，39D11-型序列和39D11-样序列可以具有提高的潜力（参见，例如实验部 分记载的数据）；
[0195] -39D11，39D11-型序列和39D11-样序列可以阻断人和食蟹猴IgE二者与高亲和 力IgE受体（Fe ( ε ) RI)和低亲和力受体（Fe ( ε ) RII)的相互作用（分别参见实施例6, 7和 8);并且通常在针对人受体和食蟹猴受体的亲和力之间具有理想的"平衡";和/或
[0196] -39D11，39D11-型序列和39D11-样序列在针对人高亲和力IgE受体和低亲和力 IgE受体的亲和力之间具有理想的"平衡"（同样参见实验部分记载的数据）；
[0197] 或者任意或所有前述的任意组合。
[0198] 这意味着，本文所述的39D11，39D11_型序列，特别是39D11-样序列可能不仅 用于本文所述的本发明的抗-IgE多肽（即，在包含至少一个所述结构单元和至少一个 W008/068280，W009/127691和W02011/095545所述的结合白蛋白的肽的构建体中），而且其 本身或作为其他多肽、蛋白或其他化合物或构建体的成分或结构单元具有优点。例如，但不 限于，本文所述的39D11，39D11-型序列，特别是39D11-样序列可以用于W004/041867和 /或W004/041865所述的类型的多肽中（S卩，替代其中所述的一种抗-IgE纳米抗体)。所述 多肽还可以是半衰期延长的，例如，通过乙二醇化或使用结合血清白蛋白的纳米抗体(包括 W004/041867，W004/041865或W006/122787中记述的那些，尽管那么应该认识到，所述多肽 可能具有有限的保存稳定性，如本文所述)。
[0199] 因此，在一些其他的方面中，本发明还涉及：
[0200] -这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个(如一个或两 个）39D11、39D11-型序列（如本文定义），特别是39D11-样序列（如本文定义）；并且更 特别是这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个(如一个或两个） 39D11-样序列（如本文定义），其为39D11的人源化的和/或序列优化的变体，如SEQ ID NO's: 120-133中的变体的一种(其中SEQ ID NO's: 128和129是特别优选的实例）。例如， 所述蛋白或多肽还可以包含两个或三个所述针对IgE的ISV's(其可以是相同的或不同的)， 它们可以直接或通过一个或多个适当的接头彼此连接。其也可以是半衰期延长的(例如，通 过乙二醇化）或另外修饰的(例如，通过W009/068627中通常所述的一些修饰进行）；
[0201]-(融合)蛋白、多肽、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个 (如一个或两个）（丨）39011，39011-型序列（如本文定义），特别是39011-样序列（如本文 定义）；并且更特别是这样的蛋白或多肽，其包含以下或基本上由以下组成：至少一个(如 一个或两个）39D11-样序列（如本文定义），其为39D11的人源化的和/或序列优化的变 体，如SEQ ID NO' s :120-133中的变体的一种（其中SEQ ID NO' s: 128和129是特别优选 的实例）；和（ii)至少一个其他氨基酸序列、蛋白、（多）肽、结合结构域、结合单位、基团、 残基或结构部分；它们适当地通过一个或多个适当的接头或间隔体彼此连接。例如，如其 他氨基酸序列可以是另一种针对IgE (例如，针对IgE上相同或不同的部分或表位）或针对 另一种靶标(如例如血清白蛋白或另一种血清蛋白，以提供增加的半衰期，或针对另一种治 疗靶标，以提供双特异性构建体）的ISV (如另一种纳米抗体)。例如，所述多肽等可以一般 如TO04/041867和/或W004/041865中所述（或者如W009/068627中所述，但是包含针对 IgE的ISV，而不是针对W009/068627中所用的IL-23的亚基的ISV's)，并且可以例如是二 价的(或多价的)、二互补位的（多互补位的）和/或双特异性的(或多特异性的）构建体(这 些术语如W009/068627 -般所述)。同样地，在所述蛋白或多肽中，所述39D11-样序列通常 可以如本文进一步所述，并且优选按照本文所述的优选方面所述。包含39D11-样序列的 双特异性抗-IgE/抗-白蛋白双特异性纳米抗体构建体的一些非限制性的实例在SEQ ID NO' s :175-182 (表 A-10)中给出。
[0202] 在另一个方面中，本发明涉及编码本文所述的一种针对IgE的氨基酸序列或多肽 的核酸。例如，所述核酸可以是遗传构建体的形式，如例如在W004/041867，W004/041865或 W009/068627 中一般所述。
[0203] 本发明还涉及制备本文所述的多肽、核酸、宿主细胞和组合物的方法。
[0204] 本发明的多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，技术人员将从本文的进一步描 述而清楚这些方式。例如，本发明的多肽可以以本身已知的用于制备抗体且特别是用于制 备抗体片段(包括但不限于，（单）结构域抗体和ScFv片段)的方式来制备。一些优选的但 非限制性的用于制备多肽和核酸的方法包括本文所述的方法和技术。
[0205] 本发明的多肽通常可以通过这样的方法来制备，所述方法至少包括下述步骤：适 当地连接针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个其他结合单位，如所述一个或 多个针对血清白蛋白的肽，它们任选地通过一个或多个适当的接头连接。所述免疫球蛋白 单可变结构域和肽（以及接头)可以通过本领域已知的和如本文进一步所述的方法偶联。优 选的技术包括连接编码所述免疫球蛋白单可变结构域和肽（以及接头）的核酸序列，从而 制备表达所述多肽的遗传构建体。用于连接氨基酸或核酸的技术是技术人员所清楚的，并 且同样参考标准手册，如上文提及的Sambrook等和Ausubel等，以及下述实施例。
[0206] 因此，本发明的多肽可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤： 提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，并且回收所表达的本发明的 多肽。所述方法可以以本身已知的方式进行，所述方式是技术人员所清楚的，例如，基于本 文进一步所述的方法和技术。
[0207] 因此，用于制备本发明的多肽的方法可以包括下述步骤：
[0208] -在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作"本发明的宿主")中或在另一种适 宜的表达系统中，表达编码本发明所述的多肽的核酸(本文还叫作"本发明的核酸")，
[0209] 任选地接着进行：
[0210]-分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
[0211] 特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
[0212] -在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发 明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的多肽；
[0213] 任选地接着进行：
[0214] -分离和/或纯化这样获得的本发明的多肽。
[0215] 因此，本发明还涉及编码本文所述的ISV或多肽的核酸或核苷酸序列（还称为"本 发明的核酸")。本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选是双链DNA 的形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA，cDNA或合成的DNA (如具有特别适 用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
[0216] 按照本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。 本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，所述载体诸如 例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
[0217] 基于关于本文所述的ISV或多肽的信息，本发明的核酸可以以本身已知的方式制 备或获得，和/或可以从适当的天然来源分离。并且，技术人员应该清楚，为了制备本发明 的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少两个编码免疫球蛋白单可变结构域或单价多肽的核苷 酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，也可以以适当的方式连接在一起。
[0218] 用于产生本发明的核酸的技术应该是技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不 限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或更多个天然存在的和/或合成的序列（或者 其两个或更多个部分）组合，引入引起截断的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性 位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或 通过使用一个或多个"错配"引物的PCR反应的方法引入突变。这些以及其他技术应该是 技术人员所清楚的，并且也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及 下文的实施例。
[0219] 本发明的核酸还可以是这样的形式，其存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体 的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种 本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，所述元件诸如例 如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等）和本文提到的其 他遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作"本发明 的遗传构建体"。
[0220] 本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构 建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于整合到要用的宿主细 胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形 式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体 或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例 如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中）。
[0221] 在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包括：
[0222] a)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
[0223] b) -个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
[0224] 并且任选地还有
[0225] c) -个或多个本身已知的其他遗传构建体元件；
[0226] 其中术语"调节元件"、"启动子"、"终止子"和"可操作性地连接"具有它们在本领 域中的通用意思(如本文进一步所述）；并且其中存在于遗传构建体中的所述"其他元件"， 例如，可以是3' -或5' -UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因和/或可以 促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其他适宜的元件对于 熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体的类型；要用的宿主细 胞或宿主生物体；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时 的或可诱导的表达);和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但 不限于(单）结构域抗体和ScFv片段）表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本 上相似的方式使用。
[0227] 优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件， 以及任选地所述一个或多个其他元件，彼此"可操作性地连接"，这通常意指它们彼此是功 能性关系。例如，如果启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，则 所述启动子被视为与编码序列"可操作性地连接"（其中所述编码序列应该理解为"受控于" 所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且 通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
[0228] 本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体， 艮P，用于表达和/或生产本文所述的ISV或多肽。适当的宿主或宿主细胞是技术人员所清 楚的，并且例如可以是任何适当的真菌、原核或真核细胞或细胞系，或者任何适当的真菌、 原核或真核生物体，例如：
[0229] -细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌（Escherichia coli)菌株；变形菌属（Proteus)菌株，例如奇异变形菌（Proteus mirabilis)菌株；假单胞 菌属（Pseudomonas)菌株，例如突光假单胞菌（Pseudomonas f Iuorescens)菌株；以及革兰 氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属（Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 菌株或短芽孢杆菌（Bacillus brevis)菌株；链霉菌属（Streptomyces)菌株，例如浅青紫 链霉菌（Streptomyces Iividans)菌株；葡萄球菌属（Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄 球菌（Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属（Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球 菌（Lactococcus Iactis)菌株；
[0230] -真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属（Trichoderma), 例如 Trichoderma reesei ;脉抱菌属（Neurospora)，例如粗糖脉抱菌（Neurospora crassa);奠壳属（Sordaria)，例如大抱奠壳（Sordaria macrospora);曲霉菌 (Aspergillus)，例如黑曲霉（Aspergillus niger)或酱油曲霉（Aspergillus sojae);或其 他丝状真菌；
[0231] -酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属 (Saccharomyces),例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces),例如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe);毕赤 酵母属（Pichia),例如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)或甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica);汉逊酵母属（Hansenula),例如多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha);克 鲁维酵母属（Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis) ;Arxula, 例如Arxula adeninivorans ;亚罗酵母属（Yarrowia)，例如解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia Iipolytica)；
[0232] -两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes);
[0233] -昆虫来源的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目（1印idoptera)的细胞/细胞系， 包括但不限于贪夜蛾（Spodoptera) SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属（Drosophila)的 细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
[0234] -植物或植物细胞，例如在烟草（tobacco)植物中；和/或
[0235] -哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞 或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞（例如BHK-21细胞），以及人细胞或细胞系， 诸如 HeLa，COS (例如 C0S-7)和 PER. C6 细胞；
[0236] 以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单）结构域抗 体和ScFv片段）的所有其他宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。还 参见上文引用的公知【背景技术】，以及例如W094/29457 ;W096/34103 ;W099/42077 ;Frenken 等（Res Tmmunol. 149:589-99,1998) ;Riechmann 和 Muyldermans (1999)，同前所述；van der Linden (J.Biotechnol.(生物技术杂志）80:261-70, 2000) ; Joosten 等·（Microb. Cell Fact. 2:1,2003) ;Joosten 等.（Appl. Microbiol.Biotechnol.(应用微生物生物技术） 66:384-92,2005);以及本文所引用的其它参考文献。
[0237] 在另一个方面中，本发明涉及这样的宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达 (或在适当的环境中能够表达)本文所述的针对IgE的ISV' s、氨基酸序列或多肽中的一种； 和/或包含编码其的核酸。所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例可以如 W004/041867, W004/041865或W009/068627中一般所述。例如，包含至少一个如本文所述 的抗-IgE结构单元和至少一个W008/068280, W009/127691和W02011/095545所述的结合 白蛋白的肽的多肽可以有利地在酵母菌种，如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)中表达、 生产或制备。也参见W02011/095545,其也描述了在毕赤酵母属和其他宿主/宿主细胞中表 达/生产包含W02011/095545的结合白蛋白的肽的多肽。
[0238] 本文所述的ISV' s和多肽也可以表达为所谓的"内抗体（intrabodies)"，如 例如在 W094/02610, TO95/22618 和 US7, 004, 940 ;TO03/014960 中所述；在 Cattaneo 和 Biocca( "Intracellular Antibodies:Development and Applications (细胞内抗体：开 发和应用）"Landes 和 Springer-Verlag，I"7)中；以及在 Kontermann(Methods (方法） 34:163-170,2004)中所述。
[0239] 用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适当的技术是技术人员所清楚的，并且可以 取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。同样参考上文提及的手册和专 利申请。
[0240] 转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建 体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体 中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本文所述的ISV或多肽的步骤，例如，使用特异 性抗体进行。
[0241] 转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式）或宿主生物体(其可以是稳定的 突变系或株系的形式）形成本发明的其他方面。
[0242] 优选地,这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少）能够表 达(例如，在适宜的条件下）本文所述的ISV或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至 少一种细胞、部分、组织或器官中）。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他 世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
[0243] 为了生产/获得本文所述的ISV' s或多肽的表达，通常可以在（需要的）ISV或多 肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物 体。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物 体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。再次，参见在上文关于本 发明的遗传构建体的段落中提及的手册和专利申请。
[0244] 一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适 宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明 的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中）；所有这些可以由熟练的技术人员选择。 此外，在这样的条件下，所述ISV' s或多肽可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当 地诱导时表达。
[0245] 熟练的技术人员还应该清楚，取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，ISV或多肽可 以（首先）以不成熟的形式(如上文提及）产生，其然后可以进行翻译后修饰。并且，也取决 于所用的宿主细胞/宿主生物体，所述ISV或多肽可以被糖基化。
[0246] 然后，本文所述的ISV或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿 主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如 (制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的多肽融合的 特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的ISV或 多肽的抗体）进行。
[0247] 本发明还涉及产品或组合物，所述产品或组合物含有或包含至少一种本文所述 的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物（S卩，针对IgE/包含至少一种本文所 述的针对IgE的ISV)，和任选地一种或多种本身已知的此类组合物的其他成分，S卩，这取 决于所述组合物的目的用途。所述产品或组合物可以例如是药物组合物（如本文所述）、 兽医用组合物或诊断应用的产品或组合物（也如本文所述)。所述产品或(药物）组合物的 一些优选的但非限制性的实例通常可以如W004/041867, W004/041865, W009/068627或 W02011/095545 中所述。
[0248] 本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物或包 含其的组合物在体外(例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或多细胞生物体 中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、IgE的增加水平 和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏性）相关的疾病或病症的人中）调节(如 W009/068627中一般定义）IgE和/或与IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应或 更一般地是与IgE相关和/或由IgE介导的任何疾病或病症（的方法或组合物）中的应用。
[0249] 本发明还涉及用于在体外(例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或 多细胞生物体中，特别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、 IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏性)相关的疾病或病症的 人中）调节IgE和/或与IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应的方法，所述方法 至少包括下述步骤：使IgE与本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合 物或者与包含其的组合物以适于调节IgE (或与IgE相关的目的或需要的作用、机制或反 应）的方式和量接触。
[0250] 本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物在制 备用于在体外(例如，在体外或细胞测定中）或体内（例如，在单细胞或多细胞生物体中，特 别是在哺乳动物中，更特别是在人中，如在有危险患有或患有与IgE、IgE的增加水平和/ 或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏性）相关的疾病或病症的人中）调节IgE或与 IgE相关的一种或多种生物学作用、机制或反应的组合物(诸如，但不限于，本文进一步所述 的药物组合物或制剂）中的应用。
[0251] 本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，其 用于治疗。
[0252] 特别地，本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化 合物用于治疗疾病或病症的应用，所述疾病或病症可以通过给有此需要的受试者施用（药 物有效量的)本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物(或适当的包含 其的组合物）得到预防或治疗。
[0253] 更具体地，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他 化合物，其用于与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏 性）相关的疾病或病症的治疗，或者更一般地，用于与IgE相关和/或由IgE介导的任意 疾病或病症的治疗。此类"IgE介导的"疾病或病症是技术人员所清楚的，并且，例如，可 以包括但不限于：这样的病况，如哮喘（asthma),变应性鼻炎（allergic rhinitis),枯草 热（hay fever),结膜炎（conjunctivitis),湿疫（eczema),荨麻疫（utricaria)，食物过 敏（food allergies)和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态反应（allergic reactions)，如针对昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的变态反应，以及针对药物的变态反应；并且 更一般地是与过敏性超敏反应和/或(特应性)变态反应（（atopic)allergy)相关的任何疾 病或病症。
[0254] 例如，目前Genentech销售称为奥马珠单抗(Xolair?)的针对IgE的单克隆抗体 用于IgE介导的病症。考虑所述ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，以 及包含其的组合物可以用于预防或治疗与在本申请的 优先权日:期前已经核准的和/或在 本申请的 优先权日:期后将要核准的适用奥马珠单抗的相同的疾病和病症。根据本文记载的 其他描述和数据，技术人员还应该清楚，与奥马珠单抗相比，所述ISV's、氨基酸序列、多肽、 蛋白、构建体或其他化合物，以及包含其的组合物具有实质性优点(例如，参见实验部分，其 中使用奥马珠单抗(获自商业来源)和通过用木瓜蛋白酶消化商业奥马珠单抗得到的Fab作 为参比化合物)。通常，对于药物应用，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体 或其他化合物可以配制成药物制剂或组合物，其包含至少一种本文所述的ISV或多肽和至 少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅剂，以及任选地一种或多种其它药物活性多肽 和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服 给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、 皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式一一取决于给药方式，其可以是固 体、半固体或液体一一以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在 本文中进一步描述。
[0255] 通常，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以 以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公 知【背景技术】（并且特别参见 W004/041862, W004/041863, W004/041865, W004/041867 和 W008/020079)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学（Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第 18 版，Mack 出版公司，美国（1990) ,Remington，the Science and Practice of Pharmacy(雷明顿，制药科学和实践)，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005); 或治疗抗体手册（Handbook of Therapeutic Antibodies) (S.Dubel， Ed.)， Wiley， Weinheim，2007 (例如，参见第 252-255 页）。
[0256] 例如，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以本身 已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv' s和双抗体）和其它药物活性蛋白的任何方式 配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适 于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药）或适于局部（即， 透皮的或皮内）给药的制剂。
[0257] 例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液 或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，W008/020079中第143 页提到的那些。通常优选水性溶液或混悬液。
[0258] 因此，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以全身 施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以包 封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接掺入患者日常饮食的食物。 对于口服治疗剂给药，本发明的ISV' S、氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋 形剂组合，并且以可吸收的片剂、口含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等 形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1%的本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗 体或多肽。当然，它们在所述组合物和制剂中的百分数可以变化，并且可以便利地为所给单 位剂型的约2-约60重量％。本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗 有效组合物中的量是这样的，以便获得有效的剂量水平。
[0259] 所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑 剂和甜味剂或调味剂，例如W008/020079中第143-144页提及的那些。当单位剂型是胶囊 时，除上述类型的物质之外，其还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物 质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶 囊可以用明胶、蜡、紫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含本文所述的ISV's、氨基酸序列、 纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯 甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任 何物质都应该是药用的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，所述的ISV's、氨基酸序列、 多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以结合在缓释制剂和装置中。
[0260] 用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建 体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配制成 用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
[0261] 本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物还可以通过输注 或注射进行静脉内或腹膜内施用，如在W008/020079中第144和145页进一步所述。
[0262] 对于局部给药，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式 应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体 结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体，如W008/020079中第145 页进一步所述。
[0263] 通常，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中 的浓度为约〇. 1-25重量-%,优选地约0. 5-10重量-%。在半固体或固体组合物诸如凝胶或 粉剂中的浓度为约〇. 1-5重量_%，优选地约0. 5-2. 5重量-%。
[0264] 需要用于治疗的本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物 的量不但随着所选的特定的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白或构建体而变化，而且随着给药途 径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于护理医生或临床 医生的判断力。
[0265] 理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为以适当的时间间隔施用的分剂量(例 如，作为每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量）而提供。所述亚剂量本身可以进一步分 害!]，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的给药；诸如从吸入器多次吸入，或者通过施用 多滴到眼睛中。
[0266] 给药方案可以包括长期的、日常的治疗。"长期"意指至少两周，并且优选地数周、 数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅 使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学）（Martin，E. W.，第4版），Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情 形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
[0267] 在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水 平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏性）相关的疾病或病症的方法，所述方 法包括向有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体 或化合物，和/或包含其的药物组合物。
[0268] 在本发明的上下文中，术语"预防和/或治疗"不但包括预防和/或治疗疾病，而且 通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种 或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/ 或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病和/或与之相关的 任何症状的严重性的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害，并且 通常包含对被治疗的患者有益的任何药理作用。
[0269] 待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。 熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和 病症的人。
[0270] 本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生 或异常的对IgE的敏感性(如超敏性)、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物 学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用药物 活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物 组合物。特别地，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过调节IgE、其生物学或 药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导进行治疗的疾病或病症，所述方 法包括对有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构 建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。特别地，所述药物有效量可以是足以调节IgE、 其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导的量；和/或提供足 以调节IgE、其生物学或药理学活性、和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导的本文 所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物的水平的量。
[0271] 此外，本发明涉及预防和/或治疗可以通过对患者施用本文所述的ISV、氨基酸序 列、多肽、蛋白、构建体或化合物进行预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括 对有此需要的受试者施用药物活性量的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或 化合物，和/或包含其的药物组合物。
[0272] 更具体地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和病症组成的组的 至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用药物活性量的本文 所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
[0273] 在另一个方面中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方 法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的受试者施用药物活性量 的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物组合物。
[0274] 在上述方法中，本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物， 和/或包含其的药物组合物，可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制 剂或组合物。因此，例如，本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物 和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内（例如，静脉内、皮下、肌内或者通过避开胃肠道的 任何其它施用途径)、鼻内、经皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要 用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的给药途径和用于所述给药的适当的 药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其它因素。
[0275] 本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物和/或包含其的 组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病 或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，这取决于下列因素，诸如要被预防或治疗 的疾病或病症，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的所述特定的ISV、 氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物，要用的特定的给药途径和药物制剂或组合物，患 者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
[0276] -般地，所述治疗方案包括以一个或多个药物有效量或剂量施用一种或多种本文 所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物，或者一种或多种包含其的组 合物。给药的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
[0277] 通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治疗的具体疾 病或病症，要用的特定的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物的功效，具体的给药 途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建 体或其他化合物一般以每天每kg体重1克-0. Ol微克的量施用，优选地每天每kg体重0. I 克-〇. 1微克，诸如每天每kg体重约1，10,100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用 (例如，通过输注）或者在一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常 剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这 些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从 通过基本上相同的途径施用的针对相同靶标的相当的常规抗体或抗体片段的通常施用的 量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人 员公知的类似因素的不同。
[0278] 通常，在上述方法中，将使用单一的本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建 体或化合物。然而，使用两种或更多种本文所述的ISV' S、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体 或其他化合物也在本发明范围之内。
[0279] 本文所述的ISV's、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物还可以与一种或 多种其它药物活性化合物或成分（principles)组合应用，S卩，作为组合治疗方案，其可以引 起或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选 择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
[0280] 特别地，本文所述的ISV' s、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或其他化合物可以与 其它药物活性化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分用于或者能够用于 预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，结果可以获得或可以不获得增效效应。所述化 合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
[0281] 当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的 给药途径或者通过不同的给药途径在基本上相同的时间或在不同时间（例如，基本上同时 地、连续地、或者按照交替方案)施用。当所述物质或成分通过相同的给药途径同时施用时， 它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行 施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
[0282] 此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一 物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案 施用，并且所述组合应用可以引起或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性 物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物 质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它 们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同 时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
[0283] 按照本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或病症 的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例 基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效 果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方 面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
[0284] 通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理 想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。
[0285] 在另一个方面中，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或 化合物在制备用于预防和/或治疗至少一种与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常 的对IgE的敏感性(如超敏性）相关的疾病或病症的药物组合物中的应用；和/或在一种或 多种本文提及的治疗方法中的应用。
[0286] 待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人。熟 练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病 症的人。
[0287] 本发明还涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、多肽、蛋白、构建体或化合物在制备用 于预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多 肽而得到预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的应用。
[0288] 更特别地，本发明涉及本文所述的ISV、氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于 预防和/或治疗与IgE、IgE的增加水平和/或过量产生或异常的对IgE的敏感性(如超敏 性）相关的疾病或病症、特别是用于预防和治疗本文列出的一种或多种所述疾病或病症的 药物组合物中的应用。
[0289] 同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本文所述的ISV's、氨基酸序列、 纳米抗体或多肽还可以适当地与一种或多种其它活性成分如本文提及的那些组合。
[0290] 定义
[0291] 除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对 于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册）（第 2 版）Vols. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社），1989)，F. Ausubel 等·（Current protocols in molecular biology (现代分子生物学方法），Green Publishing&Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes II (基因 II), John Wiley&Sons, New York, N. Y. , 1985), Old 等·（Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering (基因操作原理：基因工程导言）（第2版）University of California Press，Berkeley，CA，1981) ;Roitt 等·（Immunology (免疫学）（第 6 版）Mosby/Elsevier, Edinburgh，2001), Roitt 等·（Roitt，s Essential Immunology (Roitt 基础免疫学）（第 10 版）Blackwell Publishing，UK，2001)，和 Janeway 等·（Immunobiology (免疫生物学） (第 6版）Garland Science Publi shing/Churchil I Livingstone，New York，2005)，以及 本发明所引用的一般【背景技术】。
[0292] 熟练的技术人员应该清楚，除非另外指明，没有特别详细描述的所有方法、步 骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经以本身已知的方式进行。例如，同 样参考标准手册和本文提及的一般【背景技术】以及其中引用的其他参考文献；以及例如 下述综述：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)，Levin和 Weiss (Mol. Biosyst. 2 (I) : 49-57, 2006)，Irving 等.（J. Immunol. Methods (免疫学方法杂志） 248(1-2):31-45,2001)，Schmitz 等·（Placenta21Suppl. A:S106-12,2000)，Gonzales 等.（Tumour Biol. 26(1) :31-43, 2005)，其描述了用于蛋白质工程的技术，诸如亲和力成熟 和其他用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的技术。
[0293] 术语"序列"用在本文中(例如，在如"免疫球蛋白序列"，"抗体序列"，"可变结构域 序列"，"VHH序列"，"多肽序列"或"蛋白序列"的术语中）通常应该理解为包含相关的氨基 酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更局限的解释。
[0294] 核酸或氨基酸被认为是"（以)基本上分离的(形式存在)" 一一例如，与其从中获得 的反应介质或培养基相比一一此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少 一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种 污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别 地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸或氨基酸是"基本上分离的"。当使用 适当的技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，"以基本上分离 的形式存在"的核酸或氨基酸优选地基本上是均质的。
[0295] 当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别"包含"另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或 "基本上由"另一个核苷酸序列或氨基酸序列"组成"时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨 基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般 意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含核苷酸或氨基酸残基的片 段，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管最先提及的序列实 际上是怎样产生或获得的（例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行）。通过 非限制性实例的方式，当认为多肽包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可以意指所述免疫 球蛋白单可变结构域序列已经结合在所述多肽的序列内，但是更通常地，这一般意指所述 多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而不管所述多肽是怎样产生或获得 的。此外，当认为核酸或核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核酸或核苷酸序 列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物（例如，多肽）时，由后一个核苷酸序列编码 的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分（换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提 及的、较大的核酸或核苷酸序列相同的阅读框内）。
[0296] "基本上由ISV组成的"多肽意指所述免疫球蛋白单可变结构域与所述多肽完全相 同，或者与所述多肽相对应，其具有添加到所述免疫球蛋白单可变结构域的氨基末端、羧基 末端或者氨基末端和羧基末端两端的有限数目的核酸或氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸 残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2,3,4,5或6个氨基 酸残基。
[0297] 出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之 间的"序列同一性"百分数（在本文也称为"氨基酸同一性"）可以通过用[第一氨基酸序列 中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸 序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100% ]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基 的每一个缺失、插入、取代或添加 一一与第一氨基酸序列相比一一都视作在单一氨基酸残 基(位置）上的差异，即，视作本发明所定义的"氨基酸差异"。备选地，两个氨基酸序列之间 的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的计算机算法使用标准设置进行计算，所 述算法诸如 NCBI Blast ν2·0。例如，在TO04/037999，EP0967284，EP1085089，TO00/55318， W000/78972，W098/49185和GB2357768中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技 术、计算机算法和设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两个氨基酸序列之间的 "序列同一性"的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作"第一"氨基 酸序列，并且将另一个氨基酸序列视作"第二"氨基酸序列。
[0298] 此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓 的"保守"氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有 相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学 特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从 W004/037999, GB335768, W098/49185, W000/46383 和 W001/09300 中可知；并且可以基于 W004/037999以及W098/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择此类取代 的(优选）类型和/或组合。
[0299] 所述保守取代优选地是这样的取代，S卩，其中下列组（a) - (e)内的一个氨基酸被 同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基:Ala，Ser，Thr， Pro和Gly ; (b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp,Asn，Glu和Gln ; (c)极 性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys ;⑷大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，lie，Val和 Cys ;以及（e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取 代成Ser ;Arg取代成Lys ;Asn取代成Gln或取代成His ;Asp取代成Glu ;Cys取代成Ser ; Gln取代成Asn ;Glu取代成Asp ;Gly取代成Ala或取代成Pro ;His取代成Asn或取代成 Gln ; IIe取代成Leu或取代成Val ;Leu取代成Ile或取代成Val ;Lys取代成Arg，取代成 Gln或取代成Glu ;Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成lie ;Phe取代成Met，取代成Leu或 取代成Tyr ;Ser取代成Thr ;Thr取代成Ser ;Trp取代成Tyr ;Tyr取代成Trp ;和/或Phe 取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
[0300] 当比较两种氨基酸序列时，术语"氨基酸差异"是指与第二序列相比，在第一序列 位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2 个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本文所述的氨基酸序列和/或多肽中，术语 "氨基酸差异"是指，与考虑的CDR序列相比，在具体的CDR序列的位置上的单个氨基酸残基 的插入、缺失或取代。
[0301] "氨基酸差异"可以是任意一个、两个、三个、四个、五个、六个或最多七个取代、缺 失或插入，或其任意组合，其改善多肽的特性或者其至少不使本文所述的多肽的理想的特 性或理想的特性的平衡或组合减少太多。在这一方面，与包含所述一个或多个CDR序列而 没有所述一个、两个、三个、四个、五个、六个或最多七个取代、缺失或插入的多肽相比，所产 生的本发明的多肽应该至少以相同的、大约相同的或更高的亲和力结合IgE，所述亲和力通 过表面等离子体共振测量。
[0302] 在这一方面，所考虑的氨基酸序列可以是通过使用本身已知的一种或多种亲和力 成熟技术进行亲和力成熟而来源于具体的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0303] 例如，并且取决于用来表达所述多肽的宿主生物体，可以以这样的方式设计所述 缺失和/或取代，即，去除一个或多个翻译后修饰的位点（如一个或多个糖基化位点)，这在 本领域技术人员的能力范围之内。
[0304] 认为能够"结合"或"特异性结合"、对特定表位、抗原或蛋白（或者对其至少一部 分、片段或表位）"具有亲和性"和/或"具有特异性"的多肽(如本发明的免疫球蛋白、抗体、 免疫球蛋白单可变结构域、多肽、或通常是抗原结合分子或其片段）是"针对"（"against" 或"directed against")所述表位、抗原或蛋白的或关于所述表位、抗原或蛋白是"结合"分 子，或者认为是"抗"-表位、"抗"-抗原或"抗"-蛋白的(例如，"抗" -IgE-的)。
[0305] 术语"(交叉）阻断（（cross)_block)"、"被(交叉）阻断（（cross)_blocked)"、"(交 叉）阻断（（cross) -blocking) "、"竞争性结合"、"(交叉）竞争（（cross) -compete)"、" (交叉） 竞争（（cross)-competing)"和"(交叉）竞争（（cross)-competition)"在本文可以互换使 用，用来意指免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂干扰其他 免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂与给定靶标的结合的能力。 免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种对靶标 的结合的程度，且因此其能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定 法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用BIAcore机器，其可以使用表面等离子 体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方 法来测量免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂之间对于它们 与所述靶标的结合的竞争。
[0306]以下概括描述用于确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他 结合试剂是否交叉阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的BIAcore测定法。应该理解， 所述测定法可以与本文所述的任何免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其 他结合试剂一起使用。按照供应商的建议使用BIAcore机器(例如，BIAc 〇re3000)。因此，在 一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将靶蛋白（例如IgE)偶联到CM5BIAc 〇re芯片 上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上 (易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。将两种待检测 它们彼此交叉阻断的能力的测试结合试剂(称为A*和B*)以结合位点1 :1摩尔比例混合在 适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设结合试剂的分子量 是所述结合试剂的总分子量除以所述结合试剂上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每 种结合试剂的浓度应该足够高，足以易于饱和所述结合试剂关于捕获在BIAcore芯片上的 靶标分子的结合位点。在所述混合物中的结合试剂处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所 述浓度典型地为1. 〇〇 - 1. 5微摩尔(基于结合)。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶 液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中和相同的浓 度。将测试混合物通过靶标-包被的BIAcore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方 式处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的结合试剂。典型地，这通过 用30mM HCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结 合的量。再次处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的结合试剂。 然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物 的最大理论结合，并且是每种结合试剂在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记 录的混合物的结合小于该理论最大值，则这两种结合试剂是彼此交叉阻断的。因此，通常， 按照本发明的交叉阻断的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试 剂是一种将在上述BIAcore交叉阻断测定法中与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在 第二免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂时，所记录的结合 是组合的两种免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂的最大理论结 合(如上文定义）的80%-0. 1%(例如，80%-4%)，特别地是最大理论结合的75%-0. 1%(例如， 75%-4%)，且更特别地是最大理论结合的70%-0. 1% (例如，70%-4%)。上述BIAcore测定法是 用来确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否是按照本 发明彼此交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白 单可变结构域、多肽或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5BIAc〇re芯片上的靶 标结合(这通常在靶标上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在这 样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式确定。以这种 特定的形式，抗-His抗体将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表 面，并被所述抗-His抗体捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再 生循环之后，新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His抗体包被的表面上。除了使用 N端His-标记的靶标给出的实例之外，可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领 域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，HA标记 和抗-HA抗体；FLAG标记和抗-FLAG抗体；生物素标记和链霉抗生物素蛋白）。
[0307] 以下概括描述用于确定针对靶标（例如IgE)的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白 单可变结构域、多肽或其他结合试剂是否交叉阻断或如本文所定义那样能够交叉阻断的 ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单 可变结构域、多肽或其他结合试剂中的任一种一起使用。本测定法的一般原理是使得针对 所述靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或结合试剂包被到ELISA平 板的孔上。将过量的量的第二潜在的交叉阻断的、抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白 单可变结构域或多肽添加到溶液中（即，不与ELISA平板结合)。然后向孔中加入有限量的 靶标。所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽和溶液中的免疫球蛋 白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽竞争与有限量的靶标分子的结合。洗涤平板，以 去除未与包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽结合的过量的靶标，且 还去除第二溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽以及在所述第二 溶液相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽和靶标之间形成的任何复合 物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二溶液 相的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的条件下所述包被的免疫球蛋白、 抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断 所包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的免疫球蛋白、抗体、免疫球 蛋白单可变结构域或多肽将能够引起所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结 构域或多肽可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第一免疫球蛋白、抗体、免疫球 蛋白单可变结构域或多肽如Ab-X作为固定的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域 或多肽的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板， 以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的量的第二免疫球蛋白、抗体、免 疫球蛋白单可变结构域或多肽即Ab-Y添加到该ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板 的过程中，每孔Ab-Y靶标结合位点的摩尔比每孔所用的Ab-X靶标结合位点的摩尔至少10 倍高。然后，加入靶标，以致每孔加入的靶标的摩尔比用于包被每孔的Ab-X靶标结合位点 的摩尔至少25倍低。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标 的试剂，以测量由所述包被的抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽 (在该情形中为Ab-X)特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述 包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽(在该情形中为Ab-X)、第二溶液 相免疫球蛋白或多肽(在该情形中为Ab-Y)、仅有靶标缓冲剂（S卩，无靶标）和靶标检测试剂 的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的免疫球蛋白、 抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽(在该情形中为Ab-X)、仅有第二溶液相免疫球蛋白、 抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽缓冲剂（即，无第二溶液相免疫球蛋白、抗体、免疫球 蛋白单可变结构域或多肽)、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以 以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种免 疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽用作包被免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白 单可变结构域或多肽和哪种用作第二(竞争剂）免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构 域或多肽导致的任何假象(例如，Ab-X与Ab-Y之间对于靶标的显著不同的亲和力），该交叉 阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的免疫球 蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽，Ab-Y是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免 疫球蛋白单可变结构域或多肽，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的免疫球 蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽，Ab-X是在溶液中的竞争免疫球蛋白、抗体、免 疫球蛋白单可变结构域或多肽。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标 免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽的条件下（即，阳性对照孔）获得的靶标 检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或多肽 能够引起靶标检测信号（即，由所述包被的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域或 多肽结合的靶标的量)减少60%-100%，特别地70%-100%，且更特别地80%-100%，则Ab-X和 Ab-Y被定义为是交叉阻断的。
[0308] 用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其他结 合试剂是否如本文定义那样交叉阻断、能够交叉阻断、竞争性结合或是交叉竞争性的其他 方法记述在，例如，Xiao-Chi Jia 等·（Journal of Immunological Methods (免疫学方法 杂志）288:91 - 98, 2004), Miller 等·（Journal of Immunological Methods (免疫学方法 杂志）365:118 - 125,2011)中，和/或是本文中记述的方法（例如，参见实施例6, 7,8,9， 10)。
[0309] 本发明的多肽的"半衰期"通常可以如W008/020079中的57页段〇)中所述和如 本文提及那样定义，是指所述多肽的血清浓度在体内减少50%所花费的时间，例如，由于所 述多肽的降解和/或通过天然机制对所述多肽的清除或螯合（sequestration)导致减少。 本发明的多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物代谢动力学分 析确定。适当的技术对于本领域技术人员应该是清楚的，并且例如，通常如W008/020079 中第57页段〇)中所述。在W008/020079中第57页段〇)中还提到，半衰期可以用参数如 tl/2-α、?1/2-β和曲线下面积（AUC)表示。例如，参考标准手册，如Kenneth等.（Chemical Stability of Pharmaceuticals:AHandbook for Pharmacists(药物的化学稳定性：药剂师 手册），John Wiley&Sons Inc，1986)以及 M Gibaldi 和 D Perron ("Pharmacokinetics (药 物代谢动力学）",Marcel Dekker，第2修改版，1982)。术语"半衰期增加"或"增加的半衰 期"也如W008/020079中第57页段〇)中定义，并且特别是指tl/2-β的增加，具有或不具 有tl/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0310] 除非另外指明，术语"免疫球蛋白"一一不管其在本文中用来指重链抗体还是常规 的4-链抗体一一用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、及其所有部分、结构域 或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如V ffl结构域或VH/\结构域)。
[0311] 术语（多肽或蛋白的）"结构域"用在本文中是指折叠的蛋白结构，其具有独立于 所述蛋白的其余部分保持其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白的独立的功能特性， 并且在多种情形中可以添加、去除或转移到其他蛋白上，而不失去所述蛋白的其余部分和/ 或所述结构域的功能。
[0312] 术语"免疫球蛋白结构域"用在本文中是指抗体链(诸如例如，常规4-链抗体或重 链抗体的链)的球状区域，或是基本上由所述球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特 征在于，其保留抗体分子特有的免疫球蛋白折叠，其由以两个β-折叠排列的约7个反向平 行的β -链的两层夹心组成，任选地通过保守的二硫键稳定。
[0313] 术语"免疫球蛋白可变结构域"用在本文中意指基本上由四个"构架区"组成的免 疫球蛋白结构域，所述四个构架区在本领域和本文下文中分别称为"构架区1"或"FR1"； "构架区2"或"FR2"；"构架区3"或"FR3"；和"构架区4"或"FR4";所述构架区通过三个 "互补决定区"或"CDRs"中断，所述互补决定区在本领域和本文下文中分别称为"互补决定 区1"或"⑶RrY'互补决定区2"或"⑶R2";和"互补决定区3"或"⑶R3"。因此，免疫球蛋 白可变结构域的一般结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。正是 免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原-结合位点而赋予抗体针对抗原的特异性。
[0314] 术语"免疫球蛋白单可变结构域"可与"单可变结构域"和"ISV"互换使用，其定义 这样的分子，其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域中并且由单个免疫球蛋白结 构域形成。这使得免疫球蛋白单可变结构域与"常规的"免疫球蛋白或其片段分开，在"常 规的"免疫球蛋白或其片段中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用形 成抗原结合位点。典型地，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域（VH)和轻链可变结构 域（VL)相互作用形成抗原结合位点。在这一情形中，VH与VL二者的互补决定区（CDRs)将 促成抗原结合位点，即，总共有6个CDRs将参与抗原结合位点的形成。
[0315] 考虑到上述定义，常规4-链抗体(如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE分子；本领域中是 已知的）或来源于所述常规4-链抗体的Fab片段，F (ab'）2片段，Fv片段，如二硫键连接的 Fv或scFv片段，或双抗体（均为本领域已知的）的抗原-结合结构域通常不被认为是免 疫球蛋白单可变结构域，原因在于，在这些情形中，与抗原的各个表位结合通常不通过一个 (单个）免疫球蛋白结构域发生,而是通过一对(缔合的）免疫球蛋白结构域如轻链和重链可 变结构域发生，即，通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对发生，它们共同结合所述各个抗原的 表位。
[0316] 相反，免疫球蛋白单可变结构域能够在不与另外的免疫球蛋白可变结构域配对的 条件下特异性结合抗原的表位。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH、VHH或VL 结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDRs形成。
[0317] 因此，所述单可变结构域可以是轻链可变结构域序列（例如，VL-序列）或其适当 的片段；或重链可变结构域序列（例如，VH-序列或VHH序列）或其适当的片段；只要其能 够形成单抗原结合单位（即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单位，以使所 述单抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单位）。
[0318] 在本发明的一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序 列（例如，VH-序列）；更具体地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规4-链抗 体的重链可变结构域序列或是来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
[0319] 例如，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是（单）结构域抗体（或适于用作（单） 结构域抗体的氨基酸），"dAb"或dAb (或适于用作dAb的氨基酸）或纳米抗体（如本文定 义，并且包括但不限于VHH);其他单可变结构域，或其任意一种的任何适当的片段。
[0320] 特别地，所述免疫球蛋白单可变结构域可以是纳米抗体? (如本文定义）或其 适当的片段。[注意：纳米抗体? (Nanobody?),纳米抗体? (Nanobodies?) 和纳米克降? (Nanoclone?)为埃博灵克斯股份有限公司的注册商标]关于纳 米抗体的一般描述，参考下文的进一步描述，以及本文引用的现有技术，如例如，在 W008/020079 (第 16 页）中所述。
[0321] 〃VHH结构域〃，还称为VHHs，VhH结构域，VHH抗体片段，和VHH抗体，最初被 描述为〃重链抗体〃（即，"缺乏轻链的抗体";Hamers-Casterman等· Nature (自然） 363:446-448,1993)的抗原结合免疫球蛋白（可变）结构域。已经选择术语〃VHH结构 域〃来将这些可变结构域与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中 叫作"V H结构域"或"VH结构域"）区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结 构域(其在下文中叫作"\结构域"或"VL结构域"）区分。关于VHH' s和纳米抗体的进 一步描述，参考 Muyldermans 的综述论文（Reviews in Molecular Biotechnology (分 子生物技术综述）74:277-302, 2001)，以及参考下述作为一般【背景技术】提到的专利申请： Vrije Universiteit Brussel 的 W094/04678, W095/04079 和 W096/34103 ;Unilever 的 W094/25591, W099/37681,W000/40968,W000/43507,W000/65057,W001/40310,W001/44301, EP1134231 和W002/48193;Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的W097/49805， W001/21817, TO03/035694, TO03/054016 和 TO03/055527 ;Algonomics N.V.和埃博灵 克斯股份有限公司（Ablynx N.V.)的W003/050531 ;加拿大国家研究委员会（National Research Council of Canada)的W001/90190;抗体研究所（Institute of Antibodies)的 W003/025020 (=EP1433793);以及埃博灵克斯股份有限公司的 W004/041867, W004/041862， W004/041865, W004/041863, W004/062551, W005/044858, W006/40153, W006/079372, W006/122786, W006/122787和W006/122825,和埃博灵克斯股份有限公司的其他公布的专 利申请。还参考这些申请中提及的进一步的现有技术，特别是在国际申请W006/040153第 41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。如在这些参考文献中 所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体）可以特别地特征在于在一个或 多个构架序列中存在一个或多个"标志残基"。关于纳米抗体的进一步的描述，包括纳米抗 体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰，部分或片段，衍生物或"纳米抗体融合体"，多 价构建体(包括接头序列的一些非限制性的实例）和增加纳米抗体的半衰期的不同的修饰 以及其制剂，例如，可见于W008/101985和W008/142164。关于纳米抗体的进一步的一般描 述，参考本文引用的现有技术，如例如，记述在W008/020079 (第16页）中。
[0322] 〃结构域抗体（Domain antibodies) 〃，还称为〃Dab〃s，〃结构域抗体（Domain Antibodies) 〃，和〃dAbs〃（术语〃结构域抗体〃和〃dAbs〃被 GlaxoSmithKline 集团公司 (GlaxoSmithKline group of companies)用作商标）已经记述在，例如，EP0368684，Ward 等·（Nature (自然）341:544-546,1989)，Holt 等.（Tends in Biotechnology (生物技术 趋势）21:484-490, 2003)和 W003/002609 中，以及在，例如 W004/068820, W006/030220， W006/003388中，和在Domantis Ltd.的其他公布的专利申请中。结构域抗体基本上对应 于非骆驼科哺乳动物、特别是人4-链抗体的VH或VL结构域。为了结合作为单抗原结合结 构域的表位，即，不分别与VL或VH结构域配对，需要对所述抗原结合特性的特异性选择，例 如，通过使用人单VH或VL结构域序列的文库进行。如同VHHs，结构域抗体具有约13至约 16kDa的分子量，并且，如果来源于完整的人序列，对于例如在人中的治疗应用，不需要人源 化。
[0323] 还应该注意到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的而在本发明的情形中较不优 选，但是单可变结构域可以来源于某些鲨鱼（shark)物种（例如，所谓的" IgNAR结构域"， 参见例如W005/18629)。
[0324] 因此，在本发明的意思内，术语"免疫球蛋白单可变结构域"或"单可变结构域"包 括来源于非人来源的多肽，优选来源于骆驼科动物的多肽，优选骆驼重链抗体。其可以被 人源化，如之前所述。并且，该术语包括来源于非骆驼科动物来源的多肽，例如来源于小鼠 或人的多肽，其已被"骆驼源化"，如例如，记述在Davies和Riechmann (FEBS339:285-290， 1994 ;Biotechnol. 13:475-479,1995 ;Prot.Eng.9:531-537,1996)以及 Riechmann 和 Muyldermans (J. Immunol. Methods (免疫学方法杂志）231:25-38,1999)中。
[0325] VHH结构域的氨基酸残基按照Kabat等（"Sequence of proteins of immunological interest (免疫学感兴趣的蛋白的序列)"，美国公众健康服务中心（US Public Health Services)，NIH Bethesda，MD,出版 Νο·91)给出的关于 Vh 结构域的通用 编号方式进行编号，如例如在Riechmann和Muyldermans (J. Immunol. Methods (免疫学方法 杂志）231:25-38,1999)的图2所示，这种编号方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域。本 领域中已知用于编号V h结构域的氨基酸残基的备选方法，所述方法也可以以类似的方式用 于VHH结构域。然而，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另外指明，遵循用于上述VHH 结构域的Kabat所述的编号方式。
[0326] 应该注意--关于Vh结构域和VHH结构域在本领域是公知的--每个⑶Rs中 的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与Kabat编号方式所示的氨基酸残基的总数相 对应（即，在实际序列中，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不被占据，或者实际 序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照 Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。VH 结构域和VHH结构域中氨基酸残基的总数通常在110-120的范围内，通常在112-115的范 围内。然而，应该注意，更短或更长的序列也可以适用于本文所述的目的。
[0327] ⑶R区的确定也可以按照不同的方法进行。在Kabat所述的⑶R确定中，VHH的 FRl包含位置1-30的氨基酸残基，VHH的⑶Rl包含位置31-35的氨基酸残基，VHH的FR2 包含位置36-49的氨基酸，VHH的⑶R2包含位置50-65的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置 66-94的氨基酸残基，VHH的⑶R3包含位置95-102的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含位 置103-113的氨基酸残基。
[0328] 免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体（包括VHH结构域）可以进行 人源化。特别地，人源化的免疫球蛋白单可变结构域，如纳米抗体（包括VHH结构域）可以 是通常如前述段落中定义的免疫球蛋白单可变结构域，但是其中存在至少一个是人源化取 代和/或对应于人源化取代的氨基酸残基（特别地，在至少一个构架残基中）。可以这样确 定潜在有用的人源化取代：通过比较天然存在的V hh序列的构架区的序列与一种或多种密 切相关的人Vh序列的相对应的构架序列，之后可以向所述Vhh序列中引入这样确定的一个 或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并 且可以检测所得到的人源化的Vhh序列针对靶标的亲和力，稳定性，表达的容易性和水平， 和/或其它需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试验和误差程度，熟练的技术人员可 以确定其它适当的人源化取代（或其适当的组合）。此外，基于前述内容，免疫球蛋白单可 变结构域，诸如纳米抗体(包括VHH结构域）（的构架区）可以是部分人源化的或完全人源 化的。
[0329] 免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体（包括VHH结构域和人源化的 VHH结构域），还可以通过在一个或多个⑶Rs的氨基酸序列中引入一个或多个改变而进行 亲和力成熟，与各自的母体分子相比，所述改变使得所产生的免疫球蛋白单可变结构域针 对其各自的抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单可变结构域分子可以 通过本领域已知的方法制备，例如，如Marks等·（Biotechnology (生物技术）10:779-783， 1992) ,Barbas 等.（Proc. Nat. Acad. Sci，USA (美国国家科学院学报)91:3809-3813,1994)， Shier 等.（Gene(基因）169:147-155,1995)，Yelton 等.（Immunol.(免疫学）155:1994-2004， 1995)，Jackson 等.（J. Immunol.(免疫学杂志）154:3310-9,1995), Hawkins 等·（J. MoI. Biol.(分子生物学杂志）226:889896,1992), Johnson 与 Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display (使用噬菌体展示的抗体亲和力成熟)，Oxford University Press (牛津大学出版社)，1996)所述。
[0330] 由免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体或纳米抗体起始设计/选择和/或制备 多肽的方法在本文中还称为"格式化（formatting) "所述免疫球蛋白单可变结构域；并且 组成多肽的一部分的免疫球蛋白单可变结构域被认为是"格式化的"或采用所述多肽的"格 式"。基于本发明的公开内容，熟练的技术人员将清楚免疫球蛋白单可变结构域可以被格式 化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发 明的另一个方面。
[0331] 例如，并不限于，一个或多个免疫球蛋白单可变结构域可以用作"结合单位"、"结 合结构域"或"结构单元"（这些术语可互换使用）来制备多肽，所述多肽任选地可以包含一 个或多个可以作为结合单位的免疫球蛋白单可变结构域或肽（即，针对IgE上相同的或另 一个表位和/或针对一个或多个不同于IgE的其他抗原、蛋白或靶标)。
[0332] 单价多肽仅包含一个结合单位（如例如，免疫球蛋白单可变结构域）或基本上仅 由一个结合单位（如例如，免疫球蛋白单可变结构域）组成。包含两个以上结合单位（如 例如，免疫球蛋白单可变结构域）的多肽在本文中还称为"多价"多肽，并且存在于所述多 肽中的结合单位/免疫球蛋白单可变结构域在本文中还称为是"单价形式"的。例如，"二 价"多肽可以包含两个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过一个接头序列连接，而"三 价"多肽可以包含三个免疫球蛋白单可变结构域，其任选地通过两个接头序列连接；等等。
[0333] 在多价肽中，所述两个以上的免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的， 并且可以是针对相同的抗原或抗原决定簇（例如，针对相同的部分或表位或针对不同的部 分或表位），或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或其任意适当的组合。包含至 少两个结合单位的多肽（如例如，免疫球蛋白单可变结构域），其中至少一个结合单位是针 对第一抗原（即，IgE)并且至少结合单位是针对第二抗原（即，不同于IgE)，也称为"多特 异性"多肽，并且存在于所述多肽中的所述结合单位（如例如，免疫球蛋白单可变结构域） 在本文中也称为是"多特异性形式"的。因此，例如，本发明的"双特异性"多肽是这样的多 肽，其包含至少一个针对第一抗原（即，IgE)的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个针对 第二抗原（即，不同于IgE)的其他免疫球蛋白单可变结构域，而本发明的"三特异性"多肽 是这样的多肽，其包含至少一个针对第一抗原（即，IgE)的免疫球蛋白单可变结构域，至少 一个针对第二抗原（即，不同于IgE)的其他免疫球蛋白单可变结构域，和至少一个针对第 三抗原（即，不同于IgE和第二抗原）的其他免疫球蛋白单可变结构域；等等。
[0334] 通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。 现在将通过非限制性实验部分和附图来进一步举例说明本发明，其中：
[0335] 附图图例
[0336] 图1:39D11的多种人源化的和序列优化的变体与39D11比较的序列比对。
[0337] 图2:39D11的多种人源化的和序列优化的变体与人源化变体IgE009比较的序列 比对。
[0338] 图3: PK/H)研究的研究设计。
[0339] 图4:游离IgE的血浆水平。在单次注射赋形剂、IgE109或Xolair后随时间的游 离IgE的水平。图上的数据表示每组动物的中值。
[0340] 实验部分
[0341] 实施例1:免疫
[0342] 四头美洲驼（No. 002, No. 004, No. 193, No. 197)用 50-100 微克剂量的人 IgE (Scripps Laboratories，San Diego, CA，Cat#I0224)(美洲驼 002 和 004)或 50-100 微 克的人IgE κ链（DiateC，0sl〇,挪威）免疫4-6次。各次免疫之间的时间间隔在1-5周之 间变化。对于动物002和004,蛋白配制在Stimmune佐剂（Cedi Diagnostics, Lelystad, 荷兰）中，或对于动物193和197,配制在完全弗氏佐剂（CFA)或不完全弗氏佐剂（IFA) (Difco, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中。
[0343] 在免疫之前、在免疫方案过程中和在免疫结束后，获得来自美洲驼002,004,193 和197的血样的血清。将人IgE以2微克/ml包被在NuncMaxisorb平板上，用在PBS中的 1%的酪蛋白封闭，并且用免疫之前和免疫之后的美洲驼血清的连续稀释液温育。使用HRP 缀合的山羊-抗-美洲骑IgG(Bethyl Labs, Montgomery, TX)和TMB发色原按照标准方法 检测平板固定的美洲驼IgG。光学密度值的比较清楚地显示免疫在所有四头动物中都诱导 了针对IgE的体液免疫应答。
[0344] 使用Ficoll-Hypaque按照供应商的使用说明由血样制备外周血单核细胞。从这 些细胞和从淋巴结提取的总RNA用作RT-PCR的起始材料来扩增编码纳米抗体的基因片段。 将这些片段克隆到来源于PUC119的噬菌粒载体中，所述载体包含LacZ启动子，大肠杆菌噬 菌体PlII蛋白编码序列，针对氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因，和携带数个限制性位 点的多克隆位点。与纳米抗体?编码序列在一个阅读框内，所述载体编码C端c-myc标记 和（His)6标记。信号肽是gen3前导序列，其将表达的纳米抗体?.转移到周质中。噬菌 体按照标准方案制备（Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual (肽和蛋白的噬菌体展示：实验室手册)，Academic Press ;第I版（1996年10月28日）），并 且在过滤除菌后在后续使用之前保存在4°C。总之，构建了 4个噬菌体文库（002,004,193 和197)，所述文库大小为3. 5xl06-28xl06,并且插入的百分数为96-100%。
[0345] 实施例2 :选择结合IgE的纳米抗.体
[0346] 制备食蟹猴IgE-Fc片段，并且用作鉴定具有人和食蟹猴IgE交叉反应性的 IgE-特异性的纳米抗体的工具。从来自2只雄性和2只雌性食蟹猴的外周血单形单核细 胞（monomorphonuclear cells)提取 RNA。食蟹猴 IgE 序列（SEQ ID N0:173)使用不同的 引物（SEQ ID NO' s: 189-192)通过RT-PCR扩增。将得到的片段克隆到克隆载体中并且测 序。将食蟹猴IgEc ( ε ) 2-c ( ε ) 3-c ( ε ) 4片段克隆在来源于pCIneo的表达载体中，所述载 体包含人巨细胞病毒（CMV)即时早期增强子/启动子区，SV40晚期聚腺苷酸化信号，针对氨 苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因，多克隆位点和鼠 IgK轻链前导序列。与食蟹猴IgE-Fc 编码序列在同一阅读框中，所述载体编码C端（His)IO标记。顺式作用的病毒DNA元件， 艮P，oriP基因座允许在表达埃巴病毒核抗原-1的HEK-EBNA细胞中的附加型复制。收集培 养物上清，并且使用阳离子交换（Source30S)，然后通过亲和纯化（His TrapTMFF)和脱盐 (Desalting26/10Hiprep，所有柱来自 GE Healthcare)纯化食蟹猴 IgE Fc。
[0347] 制备人高亲和力IgE受体Fc( ε )RI a (gene bank P12319)的Fe融合体作为工 具。合成人Fe eRIa，并作为与人IgG Fe片段的融合体克隆到表达载体中。生成稳定 转染的CHO细胞（ATCC)，并且收集培养物上清。然后使用蛋白质A(Mabsel ect sure;GE Healthcare)纯化人 Fe ( ε ) RI ( α ) Fe 片段。
[0348] 利用噬菌体展示富集IgE-特异性的纳米抗体。按照标准方法由从美洲驼No. 002， 004,193和197获得的文库制备噬菌体。噬菌体文库用于对平板固定的食蟹猴IgE Fc的 两轮（R1/R2)选择。食蟹猴IgEc( ε )2_c( ε )3_c( ε )4_Fc以0. 2-2微克/ml的浓度固定 在Nunc Maxisorp ELISA平板上。使用胰蛋白酶洗脱或Fe (e)RIa洗脱回收平板固定的 噬菌体。分析R1/R2选择的输出物（output)的富集系数(相对于对照，在洗脱物中存在的 噬菌体数量（#))。基于这些参数，选择最好的选择用于进一步的分析。挑取单个菌落并且 培养在96深孔平板（Iml体积）中，并且通过加入IPTG诱导纳米抗体表达。按照标准方法 制备周质提取物。纳米抗体表达为含有C端c-myc以及6His标记的融合蛋白。
[0349] 实施例3 :在a筛诜测定中筛诜阳断IgE的纳米抗体
[0350] 为了筛选具有人/食蟹猴交叉反应性的阻断IgE的纳米抗体，分析周质提取物阻 断人IgE(Diatec，0slo,挪威）或食蟹猴IgE c( ε )2_c( ε )3_c( ε )4与人Fc( ε )RI(a)-Fc 的相互作用的能力。为了这一目的，设置两个α筛选测定(放大的发光邻近效应均相测定 (Amplified Luminiscent Proximity Homogeneous Assay) ;Perkin Elmer, Waltman, MA)〇 简言之，通过链霉抗生物素蛋白供体珠子捕获0. 05nM生物素酰化的hlgE或0. InM生物 素酰化的食蟹猴IgE c ( ε ) 2-c ( ε ) 3-c ( ε ) 4,并且通过抗-hFc-接受体珠子捕获0. 05nM Fc(ε )RI。
[0351] 分析单独纳米抗体克隆的稀释的周质提取物。使用已知抑制人IgE/Fc ( ε ) RI ( α ) Fe相互作用的奥马珠单抗Fab片段作为阳性对照。测定在Envisiona筛选选项适配的多 模式读取仪（Envision alphascreen option fitted multimode reader) (Perkin Elmer, Waltman，MA)中读取。如果周质提取物的存在使得接受体珠子的荧光信号减少，则单独克隆 被评分为推定的HuIgE/HuFc ( ε ) RI ( a ) Fc相互作用或食蟹猴IgEc ( ε ) 2-c ( ε ) 3-c ( ε ) 4/ HuFc( ε )RI(a)Fc相互作用抑制性的。当针对人IgE检测时，所有四种文库包含非阻断和 阻断的克隆，但是只有文库197回收食蟹猴交叉反应性的中和纳米抗体。选择食蟹猴交叉 反应性的抑制性纳米抗体并且测序。序列分析揭示出1个家族(命名为家族12)，其细分为 两个亚家族 12. 1 (包括克隆 39D11，39D8,42D7 和 42G5;分别为 SEQ ID N0's:119，115，116 和 117)和 12. 2(克隆 36G5 ;SEQ ID N0:118)和一种独特的克隆（39B02 ;SEQ ID N0:114)。 相应的DNA序列在SEQ ID NO's: 183-188中给出。这种低的多样性表明产生并且鉴定阻断 IgE与Fc ( ε )RI ( α )的相互作用的食蟹猴-交叉反应性的纳米抗体是非常困难的。
[0352] 实施例4 :结合IgE的纳米抗体的解离谏率确定
[0353] 通过表面等离子体共振在Biacore TlOO仪器上确定单独的抑制性纳米抗体克隆 周质提取物的解离速率常数（koff)。将人IgE(DiateC，0sl 〇,挪威）以3100RU的密度， 胺-偶联到CM5传感器芯片上。剩余的反应性基团使用乙醇胺灭活。在周质提取物的单一 稀释液中评估纳米抗体结合和解离速率。奥马珠单抗Fab片段以IOOnM的单一浓度进行检 测。每种样品以45μ1/π?η的流速注入2分钟，以允许与芯片-结合的抗原结合。接着，在 芯片上以相同的流速传送不含周质提取物的结合缓冲液，以允许结合的纳米抗体的自发解 离。通过注入再生溶液（4. 5Μ MgCl2)而去除在监测的解离阶段后保持结合的分析物。每 个亚家族和所述独特的克隆39Β2 (全部选择用于纯化和更详细的分析）的最佳代表的数据 显示在表1中。
[0354] 表1 :纳米抗体（周质提取物）的解离速率值。
[0355]

【权利要求】
1. 免疫球蛋白单可变结构域，其⑴与39D11(SEQ ID N0:119)竞争结合（人）IgE ;和 /或（ii)与39D11结合（人）IgE上相同的表位；和/或（iii)交叉阻断39D11与（人） IgE的结合。
2. 根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域，其包含以下或基本上由以下组 成： a) 包含以下或基本上由以下组成的⑶R1 :(i)氨基酸序列SYDMS(SEQ ID N0:134)和 /或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID N0:135)或（ii)与氨基酸序列SYDMS(SEQ ID N0:134)和/ 或氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO: 135)仅具有3、2或1个（如本文定义的）氨基酸差异的 氨基酸序列；和/或 b) 包含以下或基本上由以下组成的⑶R2 :(i)氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)或（ii)与氨基酸序列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID N0:136)具有至少 80%，如至少 85%，例如至少90%，至少94%，或大于95%的序列同一性的氨基酸序列；或（iii)与氨基酸序 列 SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)仅具有 7、6、5、4、3、2 或 1 个（如本文定义的）氨 基酸差异的氨基酸序列；和/或 c) 包含以下或基本上由以下组成的⑶R3:(i)氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)和/或氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138)或（ii)与氨基酸序列 DEDYALGPNEYDY(SEQ ID NO: 137)和 / 或氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY(SEQ ID NO: 138) 具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，至少92%或大于95%的序列同一性的氨基 酸序列；或（iii)与氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)和/或氨基酸序列 DEEYALGPNEFDY(SEQ ID N0:138)仅具有7、6、5、4、3、2或1个（如本文定义的）氨基酸差异 的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1或2任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其中CDR1包含以下 或基本上由以下组成：氨基酸序列SYDMS(SEQ ID N0:134)，优选地，氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO: 135)，CDR2包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列SIDTGGDITHYADSVKG(SEQ ID NO: 136)，并且CDR3包含以下或基本上由以下组成：氨基酸序列DEDYALGPNEYDY(SEQ ID N0:137)，优选地，氨基酸序列DEEYALGPNEFDY(SEQIDN0:138)。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其与氨基酸序列 39D11 (SEQ ID NO: 119)具有至少70%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的 序列同一性。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其为39D11的人源化 的和/或序列优化的变体，所述变体包含选自以下的一个或多个突变(与SEQ ID NO: 119相 比）：E1D，V5L，E6Q，F29Y，S31N，S35A 或 S35G，G44R，N75K，M77T 或 M77L，K83R，W91Y，D97E， YlOOeF 和 / 或 Q108L，按照 Kabat 编号。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其选自：SEQ ID NO' s :120-133中的任一个，或与SEQ ID NO' s :120-133中的任一个具有至少70%，如至少 80%，例如至少85%，如至少90%或大于95%的序列同一性的免疫球蛋白单可变结构域。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，其选自SEQ ID NO' s :128 和 129。
8. 蛋白、多肽、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成：适当地通过一个或 多个适当的接头或间隔体彼此连接的（i)至少一个（如一个或两个）根据权利要求1-7中 任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域和（ii)至少一个其他氨基酸序列、蛋白、（多）肽、 结合结构域、结合单位、基团、残基或结构部分。
9.根据权利要求8所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其与权利要求1-7中任一项所 述的相对应的免疫球蛋白单可变结构域本身相比，具有增加的半衰期。 1 〇.根据权利要求9所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中与权利要求1 -7中任一项 所述的相对应的免疫球蛋白单可变结构域本身相比，所述一个或多个其他基团、残基、结构 部分或结合单位为所述蛋白、多肽、构建体或化合物提供增加的半衰期。
11. 根据权利要求10所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中为所述蛋白、多肽、构建 体或化合物提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位选 自由以下组成的组：血清蛋白或其片段，能够结合血清蛋白的结合单位，Fc部分，和能够结 合血清蛋白的小蛋白或肽。
12. 根据权利要求11所述的蛋白、多肽、构建体或化合物，其中为所述蛋白、多肽、构建 体或化合物提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由以下组成的组：能够 结合血清白蛋白（如人血清白蛋白）的结合单位或血清免疫球蛋白（如IgG)。
13. 多肽、蛋白、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下组成： a) -个或多个（如一个或两个）针对IgE的免疫球蛋白单可变结构域；和 b) -个或多个（如一个或两个，包括但不限于串联重复的）针对（人）血清白蛋白的 肽，所述肽能够结合到（人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的 (至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491和/或 V493。
14. 根据权利要求13所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其包含以下或基本上由以下 组成： a) -个或多个（如一个或两个）根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变 结构域；和 b) -个或多个（如一个或两个，包括但不限于串联重复的）针对（人）血清白蛋白的 肽，所述肽能够结合到（人）血清白蛋白的亚口袋（中），所述亚口袋包含人血清白蛋白的 (至少）一个或多个以下氨基酸残基：V442, S443, T446, L484, L487, H488, K490, T491和/或 V493。
15. 根据权利要求13或14任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其中所述一个或 多个针对（人）血清白蛋白的肽选自SEQ ID NO' s:1-18中的任一个。
16. 根据权利要求15所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其选自：SEQ ID NO' s :147-161中的任一个，或与SEQ ID NO' s :147-161中的任一个具有至少80%，如至少 85%，例如至少90%，如至少95%的序列同一性的多肽。
17. 根据权利要求16所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其为SEQID NO: 155。
18. 根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域作为结合结构域或结 合单位在制备根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物中的应用。
19. 核酸或核苷酸序列，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变 结构域；或编码根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物。
20. 根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列，其是遗传构建体的形式。
21. 根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列的应用，所述核酸或核苷酸序列编码根 据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项 所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，或用于制备编码根据权利要求1-7中任一项所述的免 疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物 的遗传构建体。
22. 宿主或宿主细胞，其表达或者在适当的环境下能够表达根据权利要求1-7中任一 项所述的免疫球蛋白单可变结构域、根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建 体或化合物；和/或其包含根据权利要求19所述的核酸或核苷酸序列或根据权利要求19 所述的遗传构建体。
23. 组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白 单可变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，或根据权 利要求19和20中任一项所述的核酸或核苷酸序列。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其为药物组合物。
25. 根据权利要求24所述的组合物，其为药物组合物，还包含至少一种药用载体、稀释 剂或赋形剂和/或辅剂，并且其任选地包含一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
26. 制备根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域、根据权利要求 8-17中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤： a) 在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达系统中，表达根据权利要 求19所述的核酸或核苷酸序列，或根据权利要求20所述的遗传构建体； 任选地接着： b) 分离和/或纯化这样获得的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结 构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽。
27. 制备根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求 8-17中任一项所述的多肽的方法，所述方法至少包括下述步骤： a) 在使得所述宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种根据权利要求1-7中任一项所 述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽的条件下培养和 /或维持根据权利要求22所述的宿主或宿主细胞； 任选地接着： b) 分离和/或纯化这样获得的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结 构域或根据权利要求8-17中任一项所述的多肽。
28. 制备根据权利要求13-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物的方法，所 述方法至少包括下述步骤：连接至少一个根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单 可变结构域和一个或多个针对（人）血清白蛋白的肽以及任选地一个或多个接头。
29. 根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17 中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于治疗。
30. 根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17 中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗至少一种与IgE相关、 与IgE的增加水平和/或过量产生相关或与异常的对IgE的敏感性(如超敏性)相关的疾病 或病症。
31. 根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17 中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗能够通过调节IgE、其 生物学活性或药理学活性和/或其中涉及IgE的生物学途径或信号传导而治疗的至少一种 疾病或病症。
32. 根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域或根据权利要求8-17 中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，其用于预防和/或治疗哮喘，变应性鼻炎，枯 草热，结膜炎，湿疹，荨麻疹，食物过敏和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态 反应，如针对昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的那些变态反应，以及针对药物的变态反应；并且更 一般地是与过敏性超敏反应和/或(特应性）变态反应相关的任何疾病或病症。
33. 用于预防和/或治疗至少一种与IgE相关、与IgE的增加水平和/或过量产生相关 或与异常的对IgE的敏感性(如超敏性）相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：对有此 需要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结 构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药 物组合物。
34. 用于预防和/或治疗能够通过调节IgE、其生物学活性或药理学活性和/或其中涉 及IgE的生物学途径或信号传导而治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括：对 有此需要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可 变结构域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其 的药物组合物。
35. 用于预防和/或治疗以下疾病或病症的方法：哮喘，变应性鼻炎，枯草热，结膜炎， 湿疹，荨麻疹，食物过敏和其他变态反应，包括严重的和/或危及生命的变态反应，如针对 昆虫叮咬或蜇叮、蛇咬等的那些变态反应，以及针对药物的变态反应；并且更一般地是与过 敏性超敏反应和/或(特应性）变态反应相关的任何疾病或病症，所述方法包括：对有此需 要的受试者施用药物活性量的根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构 域，根据权利要求8-17中任一项所述的多肽、蛋白、构建体或化合物，和/或包含其的药物 组合物。
【文档编号】A61P37/08GK104271598SQ201280040978
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年6月23日
【发明者】彼得·梅尔特斯, 西格利德·科内利斯, 盖伊·赫尔曼斯, 约·韦尔凯门, 弗兰克·卡米尔·韦尔东克, 斯特凡妮·斯塔埃朗 申请人:埃博灵克斯股份有限公司