用于基于血红蛋白的氧载体的口服递送的制作方法
【专利摘要】描述了一种制备适合于口服递送的含有基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此形成的组合物。有三种示例性组合物构造，其包括(1)负载血红蛋白的纳米粒子溶液,(2)包有肠溶衣的血红蛋白胶囊和(3)包有肠溶衣的血红蛋白片剂。为了促进血红蛋白的生物利用度和生物相容性，在每种HBOC制剂中添加肠吸收促进剂。保护层确保完整血红蛋白结构在肠道中递送而不会在胃中降解。所述HBOC制剂可以用于预防或即刻治疗高山症(HAS)或用于治疗低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他缺氧病症。除了递送氧以外，来自HBOC制剂的血红蛋白的血红素基团可以向人体提供血红素铁以辅助产生更多的红细胞。
【专利说明】用于基于血红蛋白的氧载体的口服递送
[0001]著作权声明/许可
[0002]本专利文件的一部分公开内容含有接受著作权保护的内容。著作权所有者不反对任何人对专利文件或专利公开内容如其在专利和商标局专利文件或档案中出现的那样进行原样复制，，但在除此以外的任何情况下，著作权所有人均保留著作权所有。以下声明适用于如下所述的以及在所附附图中的工艺/方法、实验和数据:著作权'? 2010, BillionKing International Limited,保留所有权利。
【技术领域】
[0003]本发明涉及一种用于制备适合口服递送的包含基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此制备的组合物。可口服递送的HBOC组合物适合用于治疗多种其中需要增强组织氧合的病症。
[0004]发明背景
[0005]血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至机体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从机体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其可以在离体状态下被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧体。
[0006]已在开发基于血红蛋白的氧载体(HBOC)作为利用全血制品治疗的替代方式。典型地，过去HBOC已经用作用 于紧急情况下失血性休克的复苏液。然而，存在许多的并发症妨碍了 HBOC的广泛使用。此类并发症包括小尺寸血红蛋白的溢出、心肌梗塞、高血压和肾毒性(Bonaventura等人，2007; Natanson等人，2008)。稳定和纯化HBOC中的血红蛋白的多种尝试已经得到了有前景的结果；然而，仍然没有FDA-批准的HBOC用于常规临床使用。
[0007]尽管大量的研究已经致力于用于静脉递送的HBOC制剂，此类静脉递送在非医院环境中是不便的或不可能的。因此，在本领域中对于可以在非医院环境中口服递送的HBOC组合物存在着需求。此类组合物可以用来治疗医药或环境条件引起的其中需要增强组织氧合的病症。
[0008]其中需要增强氧合的一种环境是在高海拔处。高山症(HAS)典型地出现在快速升高至2，500米以上的海拔时。每天数以千计的人旅行到高海拔，诸如山区，其中约20%经历HAS的症状，包括头痛、恶心、头晕和睡眠障碍。通常，症状是足够轻微的，他们可以通过限制活动并且留在同一海拔适应环境几天而缓解。不恰当地适应环境且继续登高，则该病症可能进展为高原脑水肿或高原肺水肿，高原脑水肿或高原肺水肿是威胁生命的病症，需要积极治疗(Paralikar, 2010) ?
[0009]高海拔处的较低氧水平通过刺激外周化学感受器而增加通气，导致过度换气。过度换气减少了肺泡二氧化碳水平，导致低二氧化碳血症和血液的碱中毒。同时，脑血流增加以确保足够的氧供。由此引起的血液pH的改变和大脑压力的增加导致上述轻微的症状。响应于缺氧环境，人体启动一系列适应机制，即，适应环境。例如，肾脏分泌过多的碳酸氢盐并保留氢离子。最后，血液和脑脊液PH以及通气率恢复。另一重要调节是缺氧刺激肾脏释放激素促红细胞生成素。骨髓中的促红细胞生成素-敏感性定向干细胞被刺激分化成红细胞(RBC)。可以生成新的RBC并在血流中循环4-5天(Barrett等人，2009)。长期适应环境导致血容量和RBC细胞群增加，因此携氧能力可以增加。血液碱中毒将氧-血红蛋白解离曲线左移。同时，伴随的RBC中的2，3-二磷酸甘油酸增加将曲线右移。结果，p50的净增加(血红蛋白和氧之间的亲和力减小)增加了组织可利用的02 (Barrett等人，2009)。
[0010]在过去已经采取了多种方式来治疗HAS。采用乙酰唑胺的治疗增加了适应环境的速率(Paralikar，2010)。乙酰唑胺——肾碳酸酐酶抑制剂——减少碳酸氢盐的重吸收从而保持氢离子的平衡。而且，乙酰唑胺抑制脑脊液的产生并减少脑脊液压力。还已经发现类固醇，特别是地塞米松，有效缓解症状(Hackett等人，1988)。然而，两种药物(乙酰唑胺和类固醇)均不以增强细胞氧递送为目标来减轻病症。另外，已有报道中草药红景天可以提高血氧水平(Xiu, 2002)。然而,红景天有副作用包括易怒、烦躁不安和失眠。
[0011]关于HB0C，已经有一些尝试来建立血红蛋白的替代递送机制。一种方式配制血红蛋白-囊泡，其模拟RBC的细胞结构。血红蛋白-囊泡通过将血红蛋白包封在薄脂质双层膜内而形成。然而，此类制剂，和现有技术HBOC —样，被设计用于静脉递送。
[0012]口服药物递送对于患者是便利的，特别是在非临床环境中；然而，需要解决几个潜在的问题，特别是对于基于蛋白的药物诸如HBOC。首先，肽或蛋白可能被胃中的低pH胃介质和胰液中的蛋白酶降解和消化。其次，肽或蛋白的高分子量和亲水性妨碍了它们在肠中的吸收。因此，在本领域中需要口服递送HBOC组合物，以确保安全和有效地递送氧至有增强氧输送的需求的患者中。这样的组合物可以用于治疗具有HAS或其他低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他基于缺氧的疾病的患者。
【发明内容】
[0013]本发明涉及一种制备适合于`口服递送的含有基于血红蛋白的氧载体(HBOC)的药物组合物的方法以及由此制备的基于血红蛋白的氧载体。本发明的制剂具有用于通过氧递送预防或即刻治疗高山症(HAS)的特殊应用；然而，本发明的口服制剂可以在需要利用HBOC增强氧递送至组织的任何情况下使用，诸如用于治疗低氧病症包括失血、贫血、低氧的癌组织、和其他缺氧疾病。
[0014]本发明的HBOC制剂使用负载血红蛋白的纳米粒子胶囊或片剂来促进血红蛋白的生物利用度和生物相容性。不同构造的保护层确保血红蛋白的完整结构，而不会在胃中降解。可以添加任选的附加的赋形剂用于定时释放或控制释放组合物或用于组合物保存和/或稳定。
[0015]在一个实施方案中，通过提供下述包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统中的至少一种将基于血红蛋白的氧载体口服递送至需要其的受试者:纳米粒子溶液、包有肠溶衣的胶囊和/或包有肠溶衣的片剂。所述递送系统被构造成使得基于血红蛋白的氧载体在肠道中释放并使得血红蛋白以基本上未降解的形式被递送至患者血流。如本文中所用，术语“基本上未降解的形式”是指至少90%的血红蛋白分子保留了相当的天然血红蛋白的结构。
[0016]附图简述
[0017]图1显示负载血红蛋白的纳米粒子的形成和结构。[0018]图2显示包有肠溶衣的血红蛋白胶囊的结构。
[0019]图3显示包有肠溶衣的血红蛋白片剂的结构。
[0020]图4显示负载血红蛋白的纳米粒子的透射电镜图像。
[0021]图5显示包有肠溶衣的血红蛋白胶囊在(I)模拟胃液，(2)模拟肠液和还有(3)依次模拟胃液和模拟肠液中的溶出曲线。
【具体实施方式】
[0022]本发明针对HBOC的口服递送制剂，其经口服施用将氧递送至脉管系统。描述了三种不同类别的用于口服施用的HBOC。血红蛋白不同地负载在每种组合物中以建立HBOC的个体化的和特定的释放和吸收性质。在根据本发明的组合物中，血红蛋白蛋白质被包封在耐酸材料中以避免在施用所述组合物的受试者的胃中的酸降解并且使得能够在所述受试者的肠道中吸收。所述三种药物构造为:(I)负载血红蛋白的纳米粒子溶液，(2)包有肠溶衣的血红蛋白胶囊和(3)包有肠溶衣的血红蛋白片剂。在药物组合物中使用多种血红蛋白，包括各种分子量的纯化血红蛋白、交联血红蛋白、未聚合的四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白和缀合的血红蛋白。可以在本发明的口服药物组合物中使用的血红蛋白的实例在美国专利号 7, 932，356,7, 989，593,8, 048，856,8, 084，581,8, 106，011 中给出，它们的公开内容通过引用合并于本文中。
[0023]在负载血红蛋白的纳米粒子溶液中，血红蛋白被包埋在由阴离子聚合物和阳离子壳聚糖链组成的聚合电解质络合物内确保血红蛋白的完整结构并且使得能够经由口服施用途径有效吸收。可以与壳聚糖络合的阴离子聚合物包括聚(甲基丙烯酸)_聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMAA-PMMA)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)和Y-谷氨酸(Y-PGA)0阴离子组分和阳离子组分的比例保持在产生带正电荷的纳米粒子的比率，发现该比例使得具有增强的与带负电荷的肠上皮细胞的粘膜附着(Dilnnhaupt等人，2011)。
[0024]壳聚糖，一种阳离子多糖，通过碱脱乙酰作用衍生自几丁质。该多糖链由N-葡糖胺和N-乙酰葡糖胺单元构成。壳聚糖是无毒的且与软组织相容的(Iwasaki等人，2004)。更重要的是，壳聚糖具有附着于粘膜表面并且暂时地打开上皮细胞间的紧密连接的特殊性质(Artursson等人，1994)，使其成为理想的肠吸收促进剂。
[0025]在水基条件下在室温下，不使用将破坏血红蛋白的完整结构的有害有机溶剂，通过聚合电解质络合作用产生负载血红蛋白的纳米粒子。纳米粒子包括三种主要组分:阴离子聚合物、壳聚糖和血红蛋白。图1图示了阳离子壳聚糖链、预混合的阴离子聚合物链和血红蛋白的络合过程，由此产生带正电荷的负载血红蛋白的纳米粒子的最终产物。将阴离子聚合物和血红蛋白的预混合溶液调整至闻于血红蛋白的等电点的最终pH，引起蛋白质表面上的正电荷，因此引起与阴离子聚合物的强亲和力。形成纳米粒子的示例性方法公开在Makholf 等人,2011、Sonaje 等人，2010、Lin 等人,2008、Brunei 等人，2010 中，它们的公开内容通过引用合并。
[0026]已经证明壳聚糖表现出针对大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌活性，因此对于长期储存不需要防腐剂(Sudarshan等人，1992)。然而，为了延长药物组合物的保质期，任选地向纳米粒子混合物添加维生素C或N-乙酰半胱氨酸(NAC)。维生素C或N-乙酰半胱氨酸充当抗氧化剂以防止无活性的高铁-血红蛋白的形成，高铁-血红蛋白不能递送氧。无活性的成分(赋形剂)任选地包括着色剂、风味剂、干燥剂、用于促进口服组合物的吞咽的额外包衣等。
[0027]在一个实施方案中，制备50mL0.05%w/v PMAA-PMMA共聚物水溶液并将其调整至PH7。向制备的PMAA-PMMA共聚物溶液中加入血红蛋白(200mg)，并充分混合以形成第一混合物。制备相同体积(50mL)的0.05%w/v壳聚糖(分子量:130k)水溶液，并且将其调整至pH4.5。然后在磁性搅拌下在室温下将第一混合物逐滴加入至pH经调整的壳聚糖溶液。通过在20，OOOrpm超离心I小时收集纳米粒子。将在超离心后包含多个纳米粒子的小球(pellet)重新悬浮在5mL去离子水中用于进一步表征。使用动态光散射和激光多普勒电泳(Zetasizer HS3000，Malvern)测量粒度和ζ电位，它们的结果在表1中给出。产生粒度为约574nm的高度带正电荷(41mV)的负载血红蛋白的纳米粒子。与通过相同程序制备的空白纳米粒子相比，将血红蛋白负载至聚合电解质络合物中增加了粒度和ζ电位两者。负载血红蛋白的纳米粒子的球形形态也显示在通过透射电镜(JEM-2011，JE0L)获得的图4中。包封率/解离率百分比(ΑΕ%)和最终产品浓度在表1中给出。通过HPLC-UV系统(Watersl525, Waters)以约410nm的波长测量并确定血红蛋白的量。使用的柱为基于二氧化娃凝胶过滤柱(BioSep-SEC-S2000SEC, 300X7.8mm, Phenomenex)。流速和进样体积分别为25mL/min和30 μ L。ΑΕ%通过下面的方程计算:
【权利要求】
1.一种通过提供下述包含基于血红蛋白的氧载体的递送系统中的至少一种来将所述基于血红蛋白的氧载体施用至需要其的受试者的方法: (a)纳米粒子溶液； (b)包有肠溶衣的胶囊；和/或 (C)包有肠溶衣的片剂， 其中所述递送系统被构造成在肠道中释放所述基于血红蛋白的氧载体使得所述血红蛋白以基本上未降解的形式被递送到所述受试者的血流。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于血红蛋白的氧载体包含纯化血红蛋白、交联血红蛋白、未聚合的四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白、或缀合的血红蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送系统包含纳米粒子溶液并且所述纳米粒子溶液包含壳聚糖、阴离子聚合物、和/或带正电荷的纳米粒子中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述壳聚糖选自壳聚糖、几丁质、壳聚糖寡糖、或其衍生物。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述阴离子聚合物选自聚(甲基丙烯酸)-聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或Y-谷氨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送系统是包有肠溶衣的胶囊并且所述包有肠溶衣的胶囊包括聚丙烯酸树脂包衣的明胶胶囊，所述明胶胶囊由冻干形式的所述基于血红蛋白的氧载体和一种或者多种的稳定剂、冷冻保护剂、或肠吸收促进剂填充。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肠吸收促进剂选自聚氧乙烯-20-失水山梨醇单油酸酯、聚( 环氧乙烷)_聚(环氧丙烷)_聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物、环糊精、油酸、癸酸钠、辛酸钠、去氧胆酸钠或胆酸钠。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述递送系统是包有肠溶衣的片剂并且所述包有肠溶衣的片剂包含冻干形式的所述基于血红蛋白的氧载体以及一种或多种的稳定剂、冷冻保护剂、肠吸收促进剂、或形成片剂的赋形剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述包有肠溶衣的片剂还包含选自聚(甲基丙烯酸)_聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或邻苯二甲酸醋酸纤维素中的一种或多种的包衣材料。
10.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的纳米粒子溶液。
11.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的包有肠溶衣的月父囊。
12.—种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的包有肠溶衣的片剂。
13.一种口服的基于血红蛋白的氧载体递送系统，其包含权利要求1的纳米粒子溶液、包有肠溶衣的胶囊或包有肠溶衣的片剂中的两种或多种。
14.一种通过根据权利要求1向受试者口服施用基于血红蛋白的氧载体递送系统来预防和/或治疗高山症(HAS)和/或低氧病症的方法，其中所述递送系统被构造成以控制释放的方式将基于血红蛋白的氧载体沿所述受试者的肠道递送至靶部位，其中所述沿肠道递送至靶部位是PH-依赖性的。
15.一种通过根据权利要求1向受试者口服施用基于血红蛋白的氧载体递送系统来预防和/或治疗贫血和/或低氧病症的方法，其中所述递送系统被构造成以控制释放的方式将基于血红蛋白的氧载体沿所述受试者的肠道递送至靶部位，其中所述沿肠道递送至靶部位是PH-依赖性的。
16.一种制备基于血红蛋白的氧载体制剂的方法，包括: a)在水基条件下在室温下通过聚合电解质络合作用将至少一个血红蛋白分子包埋在聚合电解质络合物中，以形成带正电荷的负载血红蛋白的纳米粒子；或 b)冻干含血红蛋白的溶液，然后将所述冻干的血红蛋白分子包封在包有肠溶衣的胶囊或包有肠溶衣的片剂中。
17.权利要求16所述的方法，其中含有阴离子聚合物和血红蛋白的溶液被预混合并且调节至闻于血红蛋白的等电点的pH以便在所述血红蛋白的蛋白质表面上引起正电荷并使得在所述包埋或所述包封之前形成与所述阴离子聚合物的强亲和力。
18.权利要求17所述的方法，其中在调节pH之后向所述溶液中加入维生素C或N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为稳定剂。
19.权利要求16所述的方法，其中在所述冻干之前向所述含血红蛋白的溶液中加入冷冻保护剂和肠吸收促进剂。
20.权利要求19所述的方法，其中所述冷冻保护剂是葡萄糖、蔗糖或海藻糖中的一种或多种。
21.权利要求19所述的方法，其中所述肠吸收促进剂是聚氧乙烯-20-失水山梨醇单油酸酯、聚(环氧乙烷)_聚(环氧丙烷)_聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物、环糊精、油酸、癸酸钠、辛酸钠、去氧胆酸钠或胆酸钠中的一种或多种。
22.权利要求16所述的方法，其中所述包有肠溶衣的片剂还包含形成片剂的赋形剂。
【文档编号】A61K9/16GK103781489SQ201280043382
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2011年9月6日
【发明者】黄炳镠, 郭瑞仪 申请人:黄炳镠, 郭瑞仪