用于降解有机磷酸酯的酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够水解有机磷酸酯(OP)分子的酶。特别地，本发明涉及来自农杆菌属（Agrobacterium）的OpdA酶的变体，其与天然存在的OpdA相比时显示改进的活性。本发明也涉及对有机磷酸酯甲基毒死蜱、二嗪农和乙基对硫磷具有有机磷酸酯水解活性的多肽。
【专利说明】用于降解有机磷酸酯的酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够水解有机磷酸酯(organophosphate) (OP)分子的酶。
【背景技术】
[0002]有机磷酸酯(OP)杀虫剂残余物是环境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染(废水被下游的灌溉者使用或允许直接流出农场)、以及在农业和园艺出口商品中存在超出允许水平的残余物。有机磷酸酯中毒是暴露在此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于暴露在化学战中所用的有机磷酸酯的军事人员也是如此。此外，储备的有机磷神经毒剂也需要对这些储备进行解毒处理。因此，需要一些生物修复(bioremediation)策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。
[0003]提出的一个方案涉及使用能够固定或降解有机磷酸酯残余物的酶。例如，这些酶可用于生物反应器中，污染的水可能会流经所述生物反应器，或是在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫(disinfestation)后用在洗涤溶液中以便降低残余物的水平和存留时间(withholding time)。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的 OP 水解酶(Mulbry, 1992 ；Mulbry 和 Kearney, 1991 ；Cheng 等，1999 ；US5, 484，728 ；US5, 589，386; Dong 等，2005)、来自脊椎动物的 OP 水解酶(Wang 等，1993 ；1998 ；Gan等，1991 ；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(W095/19440和W097/19176)。要求OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。
[0004]研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphatedihydrolase,称为 OPD>OPH 或 PTE)，其由黄杆菌菌种(Flavobacterium sp.)ATCC27551 和缺陷短波单胞菌MG (Brevundimonas diminuta MG)中的不同质粒上相同基因编码(Harper等，1988 ；MuIbry和Karns, 1989)。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯(氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a, b)。其反应机制直接或间接地涉及金属离子,优选为Co++、也包括Zn++、Cd++、Fe++和其它二价阳离子。OPD对于磷酸单酯或二酯没有可检测到的活性(Dumas 等，1989a, b ； 1990)。
[0005]已经在大肠杆菌(Escherichiacoli) (ePHP)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis) (mtPHP)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae) (mpPHP)的基因组中鉴定出了 OPD同源物(磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP)，不过仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid, 1995 ；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未检测到对任何测试的底物具有活性，例如P_硝基苯乙酸酯、双(P_硝基苯)磷酸酯、对氧磷(paraoxon)和P-硝基苯磷酸酯。已鉴定出一类相关性更远的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的内酯酶活性，同样OPD酶也具有非常低水平的内酯酶活性(小于针对OP底物活性的 0.001%) (Afriat 等人，2006)。
[0006]在脊椎动物中也鉴定出了 OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些生物中的功能仍是未知的。0PD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不过mpPHP的相似性稍低。在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的所有成员中，参与Zn++结合的氨基酸残基都是保守的(Buchbinder等，1998)。
[0007]最近，从农杆菌中(Agrobacterium)分离出OP 降解酶(W002/092803; Horne 等，2002; Jackson等，2009)。这种酶又称为OpdA，因其与OPD具有90%的氨基酸序列同一性。尽管OpdA与OPD在氨基酸水平上相关，它们已显示出针对不同OP的不同活性。
[0008]需要可用于生物修复策略中的其它OP降解酶。特别是，需要针对特定OP具有增强的活性的可用于生物修复领域的酶。
【发明内容】
[0009]本发明已鉴定的多肽与天然存在的OpdA相比具有改进的活性。
[0010]因此，在一方面，本发明提供一种多肽，其含有序列为如下的氨基酸:
[0011]i)如 SEQ ID NO:1 所示，
[0012]ii)与SEQ ID N0:1所示的序列至少95%相同，或
[0013]iii) i)或ii)的片段，其具有有机磷酸酯水解活性和/或其是至少270个氨基酸长，
[0014]其中，所述多肽包含下列中的一个或更多或全部；
[0015]a)在与SEQ ID NO:1的氨基酸51位相对应位置上的缬氨酸；
[0016]b)在与SEQ ID NO:1的氨基酸63位相对应位置上的丙氨酸；
[0017]c)在与SEQ ID NO:1的氨基酸156位相对应位置上的精氨酸；
[0018]d)在与SEQ ID NO:1的氨基酸203位相对应位置上的谷氨酸；以及
[0019]e)在与SEQ ID NO:1的氨基酸236位相对应位置上的天冬氨酸。
[0020]在一个实施方案中，所述多肽具有有机磷酸酯水解活性。
[0021]在另一个实施方案中，所述多肽与第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性，第二多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。更优选地，与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽以及氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽相比，所述多肽具有更强的有机磷酸酯水解活性。
[0022]在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二级速率常数(kMt/Km)。
[0023]在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDNO: 4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对二嗪农具有高至少1.5倍或2倍的二级速率常数(kMt/Km)。
[0024]在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对乙基对硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二级速率常数(K)。
[0025]在优选的实施方案中，与氨基酸序列选自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、优选全部三个的多肽相比，本发明的多肽针对乙基毒死蜱具有高至少1.2倍、或1.5倍的催化常数(kMt)。
[0026]关于以上四个实施方案，优选地，相对于氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的多肽、以及氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的多肽，本发明的多肽具有限定的活性。
[0027]在一个实施方案中,有机磷酸酯是芳香族的非乙烯基(non-vinyl)有机磷酸酯。更优选地，所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。在一个实施方案中，有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。
[0028]在一个实施方案中，本发明的多肽具有对乙基毒死蜱至少约ZxlO6Secr1.M'对甲基毒死蝶至少约3.5xl05sec_1.M'对二嗪农至少约3.6xl06sec_1.M'对乙基对硫磷至少约QxlO7sec-1.M—1、或对甲基对硫磷至少约SxlO6sec-1.M—1的二级速率常数(keat/Km)，或者其两个或更多个、优选全部五个的组合。更优选地，本发明的多肽具有对甲基毒死蜱至少约
3.5xl05sec、M \对二嚷农至少约3.6xl06sec、M \对乙基对硫憐至少约9xl07sec \ M 1的二级速率常数(kMt/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
[0029]在另一方面，本发明提供水解有机磷酸酯分子的多肽，其具有对甲基毒死蜱至少约3.5xl05sec、M \对二嚷农至少约3.6xl06sec、M \对乙基对硫憐至少约9xl07sec、M 1的二级速率常数(kMt/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
[0030]在一个实施方案中，多肽包含a)至e)中的至少三个。在另一个实施方案中，多肽包含a)和c)、以及b)、d)和e)中的至少一个。在又一实施方案中，多肽包含b)、d)和e)。在还一个实施方案中，多肽包含a)至e)。
[0031]优选地，本发明的片段包含至少i)或ii)的氨基酸20至296，更优选至少i)或
ii)的氨基酸15至325，以及甚至更优选至少i)或ii)的氨基酸10至350。
[0032]优选地，多肽由如SEQ ID NO:1所示氨基酸的序列所组成。
`[0033]在一个实施方案中，多肽包含如SEQ ID N0:5所示的氨基酸的序列。
[0034]在另一个实施方案中，多肽包含或由如SEQ ID N0:5所示的氨基酸的序列所组成。
[0035]在另一方面，本发明提供水解有机磷酸酯分子的多肽，其具有对甲基毒死蜱至少约3.5xl05sec、M \对二嚷农至少约3.6xl06sec、M \对乙基对硫憐至少约9xl07sec、M 1的二级速率常数(kMt/Km)，或者其两个或更多个、优选全部三个的组合。
[0036]在一个实施方案中，本发明的多肽是基本纯化的和/或重组体。
[0037]在一个实施方案中，本发明的多肽是进一步含有至少一种其它多肽序列的融合蛋白。所示至少一个其它多肽可以是，例如，增强本发明多肽稳定性的多肽、促进融合蛋白从细胞(例如细菌细胞或酵母细胞)中分泌的多肽(如N端疏水信号肽)、或协助纯化融合蛋白的多肽(如麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)。
[0038]在一个实施方案中，本发明的多肽固定在固体支持物(support)上。
[0039]在另一个实施方案中，所述多肽存在于微生物细胞或者在微生物细胞的提取物、优选粗提物中。
[0040]在又一方面，本发明提供分离的和/或外源的多核苷酸，其包含序列为如下的核苷酸:
[0041]i)如 SEQ ID NO:6 所示，
[0042]ii)编码本发明的多肽，或
[0043]iii)与i)或ii)的全长互补。
[0044]在一个实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接于能够指导多核苷酸在细胞中、优选微生物细胞中表达的启动子。
[0045]在又一方面，所提供的是含有本发明多核苷酸的载体。
[0046]在另一方面，所提供的是含有本发明多核苷酸和/或本发明载体的宿主细胞。本发明宿主细胞的实例包括、而非限制于植物细胞或微生物细胞。优选地，微生物细胞是细菌细胞或如酵母细胞的真菌细胞。在一个实施方案中，所述细胞适合发酵。
[0047]在另一方面，本发明提供含有至少一种本发明细胞的转基因非人类生物。
[0048]在一个实施方案中，所述转基因非人类生物是植物、微生物生物，优选细菌或真菌。
[0049]在再一方面，本发明提供本发明宿主细胞和/或本发明的生物的提取物，其中提取物包含本发明的多肽、以及任选的本发明的多核苷酸。
[0050]在又一方面，本发明提供组合物，其包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、和本发明的提取物中的一种或更多，以及一种或更多可接受的载体。
[0051]在一个实施方案中，所述组合物包含阳离子，例如，而并非必须限制于Zn2+、Fe2+、C。2+、Cd2+或者其两种或更多的组合。
[0052]在另一方面，本发明提供用于水解有机磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有机磷酸酯分子与本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物和本发明的组合物中的一种或更多种相接 触。
[0053]在优选的实施方案中，以上各方面的方法包括
[0054]a)获得本发明的多肽，和
[0055]b)使有机磷酸酯分子与所述多肽接触。在这种实施方案中，所述多肽可形成例如本发明的宿主细胞、本发明的提取物、或本发明的组合物的部分。
[0056]在一个实施方案中，所述有机磷酸酯分子是在选自土壤、水、生物材料或其组合的样本中或在表面上。
[0057]在又一个实施方案中，所述方法包括将所述多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、提取物和组合物中的一种或多种应用至实地(in the field) 土壤或液体中，如绵羊药浴液(sheep dip)、水坝或废水。
[0058]在另一方面，本发明提供在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物或本发明的组合物中的一种或更多种。
[0059]也提供本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的提取物以及本发明的组合物中的一种或更多种在制造药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性。
[0060]此外，提供本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的提取物以及本发明的组合物中的一种或更多种作为药物的用途，所述药物用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性。
[0061]在还一方面，本发明提供产生本发明多肽的方法，所述方法包括在允许表达编码所述多肽的多核苷酸的条件下培养本发明的宿主细胞、或本发明的载体，以及回收表达出的多肽。[0062]在优选的实施方案中，所述方法包括
[0063]i)提供容器，其容纳含有适合发酵的本发明细胞(如大肠杆菌)的液体组合物、以及发酵所需的成分，和
[0064]ii)提供有益于所述容器中容纳的液体组合物发酵的条件。
[0065]在另一方面，本发明提供用于检测有机磷酸酯存在的生物传感器，所述生物传感器包含本发明的多肽、以及检测有机磷酸酯分子被所述多肽水解的手段。
[0066]在又一方面，本发明提供用于水解有机磷酸酯分子的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的多肽、本发明的宿主细胞、本发明的提取物和本发明的组合物中的一种或多种。
[0067]除非另有具体规定，本文的任何实施方案应加以必要的修改以适用于任何其它实施方案。
[0068]本发明并非局限于仅用于示例目的的本文所述的具体实施方案的范围。如本文所述，功能上同等的产物、组合物和方法明显在本发明范围内。
[0069]在本说明书全文中，除非另有具体规定或上下文另外要求，当提到单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组时，应当包括一个以及多个(即一个或更多个)这些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组。
[0070]在下文将通过下列非限制性的实施例以及参照附图描述本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0071]图1:有机磷酸酯杀虫剂的化学分类。
`[0072]图2:通过野生型OpdA (OPA)和改良的变体(含N端Met的A900)降解有机磷(organophosphorus)杀虫剂二嚷农。
[0073]图3:三小时后在模拟的绵羊药浴溶液中，A900 (含N端Met)和OpdA (OPA)的剂
量率对二嗪农降解程度的影响。
[0074]图4:通过压力计量的呼吸计量法(manometric respirometry)测试评估A900(含N端Met)(菱形)和苯甲酸钠(三角形)的生物降解能力。A900对细菌呼吸的抑制也通过在苯甲酸钠和A900两者(正方形)存在下测量呼吸速率得以评估。
[0075]序列表沣释:
[0076]SEQ ID NO: 1—A900 的氨基酸序列。
[0077]SEQ ID NO: 2—OpdA的氨基酸序列(移除N端28个氨基酸并添加N端Met的天然OpdA)o
[0078]SEQ ID NO: 3—OpdA变体M4的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID N0:4—0PH 的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO: 5—N端添加Met的A900的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID N0:6—编码A900的核苷酸序列。
[0082]SEQ ID N0:7—TAT 信号肽。
【具体实施方式】
_3] 通用技术和定义
[0084]除非另有特别定义，本文所用的所有技术和科学术语应认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传、免疫、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。
[0085]除非另有说明，本发明所使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术均为本领域技术人员公知的标准过程。此类技术通篇描述并阐述于如下来源的文献中，例如J.Perbal的 A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 和 Sons (1984)、J.Sambrook等的 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989)、T.A.Brown (编)的 Essential Molecular Biology:A Practical Approach第一和第二卷，IRL Press (1991)、D.M.Glover 和 B.D.Hames (编)的 DNA Cloning:APractical Approach 第一至第四卷，IRL Press (1995 和 1996))、以及 F.M.Ausubel等(编)的 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates 和Wiley-1nterscience (1988,包括迄今为止所有的更新版)、Ed Harlow 和 David Lane (编)的 Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)和J.E.Coligan 等(编)的 Current Protocols in Immunology, John ffiley&Sons (包括迄今为止所有的更新版)。
[0086]术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意思是“X和Y”或者“X或Y”，并且应认为对两个意思或任一个意思提供明确的支持。
[0087]如本文所用，除非与所述的相反，所述术语大约指特定值的+/_20%，更优选+/-10%,甚至更优选+/_5%。
[0088]在本说明书全文中的“包含(comprise)” 一词或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体,应理解为意图包括所述的元素、整数或步骤,或是一组元素、整数或步骤，但并不排除任何其它元素、整数或步骤，或是其它组元素、整数或步骤。
[0089]如本文所用，术语“水解(hydrolyses)”、“水解(hydrolysing)”、“水解活性”及其变体指本发明的多肽催化化学键水解的能力。在优选的实施方案中，所述多肽“降解”有机磷酸酯，以使得所述酶活性的产物对例如哺乳动物和/或鱼毒性减低，和/或不如有机磷酸酯底物稳定。
[0090]如本文所用，术语“更强的有机磷酸酯水解活性”指本发明的多肽与之前已知多肽相比，对有机磷酸酯具有更高的二级速率常数(kMt/Km)，所述之前已知多肽例如而非限制于氨基酸序列如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4、优选全部三个所示的多肽。在优选的实施方案中，术语“更强的有机磷酸酯水解活性”指本发明的多肽，其具有下列中一个或更多个、优选全部三个:
[0091]i)与氨基酸序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、优选全部三个所示的多肽相比，针对甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二级速率常数G^atAm)，
[0092]ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4、优选全部三个所示的多肽相比，针对二嗪农具有高至少1.5倍或2倍的二级速率常数G^atAm)，以及
[0093]iii)与氨基酸序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、优选全部三个所示的多肽相比，对乙基对硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二级速率常数G^atAm)。
[0094]如本 文所用，短语“在与氨基酸位相对应位置上”指氨基酸参照确定的氨基酸序列相对于周围氨基酸而言的相对位置。例如，在某些实施方案中，本发明的多肽可具有附加的N端氨基酸以协助细胞内定位或细胞外分泌，当比对例如SEQ ID NO:1时其改变所述氨基酸的相对位置。在一个实例中，根据进行的蛋白质比对，技术人员很容易理解在SEQ ID NO:1的氨基酸位置14上的脯氨酸是与SEQ ID NO:1的氨基酸位置15上的脯氨酸相对应的氨基酸。在一个实施方案中，所述多肽包含在指定的残基位上确定的氨基酸。
[0095]如本文所用，术语“处理/治疗(treating)”、“处理/治疗(treat)”或“处理/治疗(treatment)”包括施用治疗有效量的例如本发明的多肽、或其编码多核苷酸，其足以减少或消除至少一个由有机磷酸酯所导致的毒性症状。
[0096]本文所用术语“生物材料”在其最广泛意义上包括生物起源的任何产物。这样的产物包括，而非限制于用于人类食品和动物饲料。所述产品包括液体介质，其包括水和如牛奶的液体食物，以及如酸奶的半固体食物，等等。本发明也延伸至固体食物，特别是动物饲料。在一个实施方案中，生物材料优选为植物材料例如，而非限制于水果、蔬菜、甘蔗、油菜种子、小麦种子、大麦种子、高粱种子、水稻、玉米、菠萝或棉花种子。
[0097]如本文所用，术语“提取物”指包含本发明的多肽、优选也包含本发明的多核苷酸或载体的本发明的宿主细胞或非人类转基因生物的任何部分。所述部分可以是整体，如植物的种子、水果、叶、茎或根，或是通过至少部分均质化和/或纯化所获得。所述术语包括从宿主细胞分泌的部分，并因此包括培养上清。优选地，所述提取物是相对粗的提取物，其未经历纯化步骤将本发明的多肽从与其共产生的其它多肽中纯化出来。提取物也可以是含有本发明多肽的组合物。
[0098]有机磷酸酯
[0099]有机磷酸酯是合成的有机磷酯和相关的化合物，例如磷酰胺酸酯(phosphoroamidate)。其具有通式(RR’X)P=0或(RR，X)P=S，其中R和R’是短链基团。在磷酰胺酸酯中，R’是伯胺或仲胺。对于杀虫的有机磷酸酯，X是良好的离去基团(leavinggroup)，其对于乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制是必需的。
[0100]本发明的多肽水解有机磷酸酯的磷酸酯键。所述有机磷酸酯可以具有芳香族或脂肪族尚去基团(X)以及也可含有乙烯基基团(图1)。
[0101]优选地，所述有机磷酸酯的离去基团具有小于8的电离常数(pKa) (Jackson等，2009)。
[0102]尽管有机磷酸酯作为杀虫剂的用途是众所周知的，然而其也用作针对哺乳动物的神经毒气。因此，本发明的多肽也能够用于水解不是杀虫剂的有机磷酸酯。在具体优选的实施方案中，本发明的多肽用于水解0-乙基S-(2- 二异丙胺)乙基-甲基硫代磷酸酯(VX)。
[0103]Ui
[0104]术语“多肽”和“蛋白质” 一般可互换使用，其指可或不可通过添加非氨基酸基团而修饰的单个多肽链。应当理解，这样的多肽链可与其它多肽或蛋白或如辅因子的其它分子相结合。本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”也包括本文所述的多肽的变体、突变体、生物活性片段、和/或修饰。
[0105]通过GAP (Needleman和Wunsch, 1970)分析确定多肽的％同一性(GCG程序)，空位插入罚分=5，以及空位延伸罚分=0.3。查询序列至少250个氨基酸长，并且GAP分析在至少250个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。更优选地，查询序列至少300个氨基酸长，并且GAP分析在至少300个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，查询序列至少350个氨基酸长，并且GAP分 析在至少350个氨基酸长的区域对两个序列进行比对。甚至更优选地，GAP分析在两个序列的全长对其进行比对。
[0106]如本文所用“生物活性片段”是本文所述的多肽的一部分，其保留全长多肽所定义的活性。只要生物活性片段保留所定义的活性，其可以是任意尺寸。优选地，生物活性片段是至少300，优选至少350个氨基酸长。此外，生物活性片段指具有“有机磷酸酯水解活性”的片段。
[0107]对于所定义的多肽，应了解，高于上面所提供的％同一性的数字将包括优选的实施方案。因此，在合适的情况下，根据最小％同一性数字，优选所述多肽包括与相关指定的SEQ ID NO具有至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，更优选至少99%，更优选至少99.1%，更优选至少99.2%，更优选至少99.3%，更优选至少99.4%，更优选至少99.5%，更优选至少99.6%，更优选至少99.7%，更优选至少99.8%，以及甚至更优选至少99.9%同一性的氨基酸序列。
[0108]对“基本纯化的”或“纯化的”，我们指的是已经从其天然状态所关联的一种或多种脂质、核酸、其它多肽或其它污染分子中分离出的多肽。优选地，所述基本纯化的多肽是至少60%，更优选地至少75%，以及更优选地至少90%不含其它天然关联的成分。虽然目前没有证据证明本发明的多肽存在于天然中，术语天然状态或天然关联的也包括本发明的宿主细胞所产生的多肽。
[0109]在提及多肽的上下文中术语“重组的”指当被细胞产生或在无细胞表达系统中产生时，相比其天然状态，具有改变的量或改变的速率的多肽。在一个实施方案中，所述细胞不是天然产生所述多肽的细胞。本发明的重组多肽包括没有从产生该多肽的转基因(重组)细胞、或无细胞表达系统的其它成分中分离出的多肽，以及在这样的细胞或无细胞系统中产生的、随后从至少一些其它成分中纯化出来的多肽。 [0110]通过在本文定义的核酸中引入合适的核苷酸改变，或通过体外合成所需的多肽，可以制备本文所述多肽的氨基酸序列突变体。此类突变体包括，例如氨基酸序列中的残基的删除、插入或取代。只要最终的多肽产物具有所需的特征，就可进行删除、插入和取代的组合以得到最终的构建体。
[0111]突变的(改变的)多肽可以使用本领域任何已知的技术制备，例如使用定向进化或合理设计的策略(见下文)。源自突变/改变的DNA的产物可使用本文所述技术容易地进行筛选，以确定其是否具有有机磷酸酯水解活性(参见，例如实施例1和2)。在另一个实例中，通过将有机磷酸酯溶解于约5%的甲醇中并使其与酶在pH8.0的50mM Tris-HCl中在25°C反应以测量有机磷酸酯水解活性。使用标准过程根据实际的有机磷酸酯测量酶活性。例如，以分光光度法通过监测在276nm处的吸光度的增加以测量毒死蜱(Dumas等，1989b)，而用放射性标记的二嗪农(乙基-1-14C ；14.8MBq/mmol)通过曾经用于放射性标记的OP底物的放射分区分析可监测二嗪农的水解(Campbell等，1998)。
[0112]在设计氨基酸序列的突变时，突变位点的定位以及突变的性质取决于待修饰特征。可对突变位点进行单个或系列修饰，例如，通过(I)首先以可供选择的保守氨基酸进行取代，然后根据得到的结果进行更多基团的选择、(2)删除靶残基、或(3)在定位的位点附近插入其它残基。
[0113]氨基酸序列的删除通常为约I至15个残基，更优选地为大约I至10个残基且典型地为大约I至5个连续的残基。[0114]取代突变为多肽分子中的至少一个氨基酸残基被去掉并在其原来的位置上插入一个不同的残基。目的位点是在其位点上获自各种株或物种的特定残基都相同的那些。这些位置可能对生物学活性是重要的。优选以相对保守的方式取代这些位点，特别是落入至少3个其它相等保守位点的序列中的那些。保守取代的实例见表1。
[0115]在优选的实施方案中，与本文特别定义的多肽相比，突变/变体多肽仅具有保守取代。
[0116]在优选的实施方案中，与本文特别定义的多肽相比，突变/变体多肽具有I个或2个或3个或4个保守氨基酸改变。保守氨基酸改变详细提供在表1中。优选地，如果没有特别指出，所述多肽在给定的氨基酸位置上包含SEQ ID NO:1所提供多肽的对应位置上所发现的氨基酸。
[0117]关于其它可进行的取代突变的指南描述于Yang等(2003)、Cho等(2004)，Horne等(2006)和 Jackson 等(2009)。
[0118]如果在指定位点上的氨基酸不符合表1所提供的氨基酸取代，则优选该指定氨基酸。
[0119]表1.示例性的取代
[0120]
【权利要求】
1.一种多肽，其含有序列如下的氨基酸:
i)如SEQ ID NO:1 所示， ii)与如SEQID NO:1所示的序列至少95%相同，或
或ii)的片段，其具有有机磷酸酯水解活性和/或至少270个氨基酸长， 其中，所述多肽包含下列中的一种或更多或全部； a)在与SEQID NO:1的氨基酸51位相对应位置上的缬氨酸； b)在与SEQID NO:1的氨基酸63位相对应位置上的丙氨酸； c)在与SEQID NO:1的氨基酸156位相对应位置上的精氨酸； d)在与SEQID NO:1的氨基酸203位相对应位置上的谷氨酸；以及 e)在与SEQID NO:1的氨基酸236位相对应位置上的天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的多肽，其具有有机磷酸酯水解活性。
3.根据权利要求2所述的多肽，其与氨基酸序列选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQID N0:4的第二多肽相比具有更强的有机磷酸酯水解活性。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的多肽，其具有下列中的两种或更多或全部: i)与氨基酸序列选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的二级速率常数(kMt/Km)， ii)与氨基酸序列选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的二级速率常数(kMt/Km)， iii)与氨基酸序列选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的二级速率常数(kMt/Km)，或者 iv)与氨基酸序列选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对乙基毒死蝶高至少1.2倍的催化常数(keat)。
5.根据权利要求4所述的多肽，其具有: i)与氨基酸序列选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对甲基毒死蜱高至少2倍的二级速率常数(kMt/Km)， ii)与氨基酸序列选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对二嗪农高至少1.5倍的二级速率常数(kMt/Km)， iii)与氨基酸序列选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对乙基对硫磷高至少2倍的二级速率常数(kMt/Km)，和 iv)与氨基酸序列选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，针对乙基毒死蝶高至少1.2倍的催化常数(keat)。
6.根据权利要求2至5的任一项所述的多肽，其中所述有机磷酸酯的离去基团具有低于8的pKa。
7.根据权利要求2至6的任一项所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是芳香族非乙烯基有机磷酸酯。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的多肽，其中所述有机磷酸酯是乙基对硫磷、甲基对硫磷、二嗪农、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或马拉硫磷。
9.根据权利要求2至8任一项所述的多肽，其具有下列中的两个或更多: i)对乙基毒死蜱至少约ZxKfsec'M—1的二级速率常数(keat/Km)，ii)对甲基毒死蝶至少约3.5xl05sec' IVT1的kcat/Km,
iii)对二嗪农至少约3.6xl06sec^.M—1 的 kcat/Km, iv)对乙基对硫磷至少约gxKfsec—1.1VT1的keat/Km,或 v)对甲基对硫磷至少约SxlO6Secr1.1VT1的kcat/Km。
10.根据权利要求9所述的多肽，其具有: i)对乙基毒死蜱至少约ZxIO6sec'M—1的二级速率常数(keat/Km)， ii)对甲基毒死蝶至少约3.5xl05sec' IVT1的kcat/Km,
iii)对二嗪农至少约3.6xl06sec^.M—1 的 kcat/Km, iv)对乙基对硫磷至少约QxlO7Secr1.1VT1的keat/Km,以及 v)对甲基对硫磷至少约SxlO6Secr1.1VT1的kcat/Km。
11.根据权利要求1至10的任一项所述的多肽，其包含a)至e)中的至少三个，或包含a)和c)、以及b)、d)和e)中的至少一个。
12.根据权利要求11所述的多肽，其包含b)、d)和e)。
13.根据权利要求1至12的任一项所述的多肽，其包含a)至e)。
14.根据权利要求1至13的任一项所述的多肽，其中所述片段包含至少SEQID NO:1的氨基酸20至296。
15.一种多肽，其水解有机磷酸酯分子，并且其具有对甲基毒死蜱至少约3.SxlO5Sec-1.M'对二嗪农至少约3.6xl06sec_1.M_\对乙基对硫磷至少约gxKfsec' M—1的二级速率常数(kcat/Kffl)，或者其两个或更多个的组合。
16.根据权利要求1至15的任一项所述的多肽，其是进一步含有至少一种其它多肽序列的融合蛋白。
17.根据权利要求1至16的任一项所述的多肽，其固定在固体支持物上。
18.根据权利要求1至17的任一项所述的多肽，其存在于微生物细胞或者在微生物细胞的提取物、优选粗提物中。
19.一种分离的和/或外源的多核苷酸，其包含序列为如下的核苷酸: i)如SEQ ID NO:6 所示， ii)编码根据权利要求1至18的任一项所述的多肽，或 iii)与i)或ii)的全长互补。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其可操作地连接于能够指导所述多核苷酸在细胞中、优选微生物细胞中表达的启动子。
21.—种载体,其包含根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸。
22.—种宿主细胞，其包含根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸、和/或根据权利要求21所述的载体。
23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其是植物细胞或微生物细胞，优选细菌细胞或真菌细胞。
24.一种转基因非人类生物，其包含至少一种根据权利要求22或权利要求23所述的细胞。
25.根据权利要求24所述的转基因非人类生物，其是植物、微生物生物，优选细菌或真菌。
26.一种根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、和/或根据权利要求24或权利要求25所述的生物的提取物，其中所述提取物包含根据权利要求1至18任一项所述的多肽、以及任选地根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸。
27.一种组合物，其含有根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、和根据权利要求26所述的提取物中的一种或多种，以及一种或多种可接受的载体。
28.一种用于水解有机磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有机磷酸酯分子接触根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、根据权利要求26所述的提取物以及根据权利要求27所述的组合物中的一种或更多种。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述有机磷酸酯分子在选自土壤、水、生物材料或其组合的样本中或在表面上。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其包括将所述多肽、宿主细胞、提取物或组合物中的一种或更多种应用至实地土壤或液体中。
31.一种在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的方法，方法包括向受试者施用根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、根据权利要求26所述的提取物以及根据权利要求27所述的组合物的一种或更多种。
32.根据权利要求1至8的任一项所述的多肽、根据权利要求9或权利要求10所述的多核苷酸、根据权利要求11所述的载体、根据权利要求12或权利要求13所述的宿主细胞、根据权利要求16所述的提取物以及根据权利要求17所述的组合物的一种或更多种，在制造用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的药物中的用途。
33.根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、根据权利要求19或权利要求20所述的多核苷酸、根据权利要求21所述的载体、根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、根据权利要求26所述的提取物以及根据权利要求27所述的组合物的一种或更多种，作为用于在受试者中治疗由有机磷酸酯分子所导致的毒性的药物的用途。
34.一种用于产生根据权利要求1至18的任一项所述的多肽的方法，所述方法包括:在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞，以及回收表达的多肽。
35.一种用于检测有机磷酸酯存在的生物传感器，所述生物传感器包含根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、以及检测有机磷酸酯分子被所述多肽水解的手段。
36.一种用于水解有 机磷酸酯分子的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至18的任一项所述的多肽、根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞、根据权利要求26所述的提取物以及根据权利要求27所述的组合物的一种或更多种。
【文档编号】A61K38/46GK103814127SQ201280045762
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月20日
【发明者】C·斯科特, J·奥克肖特, R·拉塞尔, N·弗伦克, S·科措尼斯, 刘凯燕 申请人:联邦科学工业研究组织