聚阴离子卡波姆和Env多肽的免疫原性复合物及其制造方法和用途

聚阴离子卡波姆和Env多肽的免疫原性复合物及其制造方法和用途
【专利摘要】本发明涉及在聚阴离子卡波姆和Env多肽之间形成免疫原性复合物。描述了在包含诱导免疫应答和免疫的应用中免疫原性复合物的使用。也描述了形成和制造免疫原性复合物的方法。本发明也涉及包含低粘度、聚阴离子卡波姆和Env多肽的免疫原性组合物。描述了在包含诱导免疫应答和免疫的应用中这样的免疫原性组合物的使用。也描述了制造这样的免疫原性组合物的方法。
【专利说明】聚阴离子卡波姆和Erw多肽的免疫原性复合物及其制造方 法和用途
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 19(e)要求2011年11月14日提交的美国临时专利申请 第61/559, 512号的优先权。上述申请的公开内容通过引用全文纳入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明部分在由NIAID、NIH授予的HIVRAD基金5P01AI066287的美国政府资助 下完成。政府对本发明拥有某些权利。

【技术领域】
[0005] 描述了包括聚阴离子卡波姆和Env多肽之间的复合物的免疫原性组合物，以及这 些免疫原性组合物的应用和形成和制造这类复合物的方法。描述了包括低粘度，聚阴离子 卡波姆和Env多肽的免疫原性组合物，以及这些免疫原性组合物的应用和形成和制造这类 组合物的方法。
[0006] 背景
[0007] 获得性免疫缺陷综合征（AIDS)被认为是现代医学所面对的最大健康威胁之一。 迄今还没有这种疾病的治愈方法。
[0008] 在1983-1984,三个小组独立地鉴定了AIDS的疑似病原。参见，例如 Barre-Sinoussi等，（1983)Science220 :868-871;Montagnier等，在《人T细胞白血病 病毒》（HumanT-CellLeukemiaViruses)中（Gallo，Essex&Gross，编，1984);Vilmer 等，（1984)TheLancetl:753;Popovic等，（1984)Science224:497-500;Levy等，（1984) Science225 :840-842。这些分离株被不同地称为淋巴结病相关病毒（LAV)、III型人T淋 巴细胞病毒（HTLV-III)或AIDS相关逆转录病毒（ARV)。所有的这些分离株都是同一种病 毒的毒株，并且随后统称为人免疫缺陷病毒（HIV)。随着相关的AIDS致病病毒的分离，最 初被称为HIV的毒株现在称为HIV-I而相关的病毒被称为HIV-2。参见例如，Guyader等， (1987)Nature326:662-669 ;Brun-Vezinet等，（1986)Science233 :343-346;Clavel等， (1986)Nature324:691-695。
[0009] 已经产生了大量关于HIV病毒的信息；然而，至今还没有鉴定出有效的疫苗。已经 检测了包括由HIV编码的Env和Gag基因产物的几个疫苗开发的靶标。Gag基因产物包含， 但不限于Gag-聚合酶和Gag-蛋白酶。Env基因产物包含，但不限于单体gpl20多肽、寡聚 gp140多肽和gp160多肽。
[0010] 已经描述了HIVEnv多肽在免疫原性组合物中的应用。（参见例如，Hurwitz等 的美国专利号5, 846, 546,描述了包括各自表达不同HIVenv变体的至少4种不同重组 病毒的混合物的免疫原性组合物；和Vahlne等的美国专利号5, 840, 313,描述了相应于 HIV-lgpl20蛋白的表位的肽）。另外，Sia等的美国专利号5, 876, 731描述了针对HIV的候 选疫苗，其包括直接与含有序列GPGR的HIV-I分离株的V3环蛋白的B细胞表位的氨基酸序 列相连的Gag的T细胞表位的氨基酸序列。然而，这些Env多肽基组合物都没有显示出提供 足够的保护性免疫应答以用作有效的疫苗。最近，G.Krashias等（Vaccine. 28 :2482-2489, 2010)描述了包括gpl40 和CARBOPOL(TM)的疫苗。G.Krashias等发现CARBOPOL(TM)提供 了超过作为佐剂的错佐剂（alum)的改善的免疫应答。然而，G.Krashias等发现在gpl40和 CARBOPOL(TM)之间没有可检测的结合。
[0011] 概述
[0012] 本发明人惊讶地发现，在合适的条件性下，聚阴离子卡波姆可以与Env多肽形成 复合物。该复合物显示超过现有的佐剂化的HIV候选疫苗的改善的免疫原性。
[0013] 本文所述的是聚阴离子卡波姆和Env多肽之间的新型复合物。本发明的一个方 面包含包括与聚阴离子卡波姆聚合物形成复合物的Env多肽的免疫原性组合物。在一个 实施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在另一个可以与之前的实 施方式结合的实施方式中，聚阴离子卡波姆聚合物不含苯。在另一个可以与之前的实施方 式结合的实施方式中，聚阴离子卡波姆聚合物的浓度是约0.01% (w/ν)-约2.0% (w/v)、 约 0. 01 % (w/v)-约 0. 5% (w/v)或约 0. 01 % (w/v)-约 0. 2% (w/v)。在另一个可以与之 前的实施方式结合的实施方式中，聚阴离子聚合物包括CARB0P0L971PNF(TM)、CARB0P0L 974PNF(TM)或其组合，或优选CARB0P0L971PNF(TM)。在另一个可以与之前的实施方式 结合的实施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中， Env多肽包括一个或多个突变。在某些可以与之前的具有一个或多个突变的实施方式结合 的实施方式中，该一个或多个突变选自在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的 切割位点中的突变、在糖基化位点中的突变、Vl区的缺失、V2区的缺失以及上述的组合。优 选地，一个或多个突变包括在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中 的突变以及V2区的缺失。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，Env多肽包含 gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env多肽的多 肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些实施方式中，Env多肽包括 与SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、至少80%序列相同性、至少85%序列相 同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、至少97 %序列相同性、至少98 %序列相 同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方 式中，免疫原性组合物还包含选自不同HIV亚型的第二Env多肽作为Env多肽。在某些可 以与之前的包含第二Env多肽的实施方式结合的实施方式中，第二Env多肽和Env多肽与 聚阴离子卡波姆聚合物形成混合的复合物。在某些可以与之前的包含第二Env多肽的实施 方式结合的实施方式中，第二Env多肽与第二聚阴离子卡波姆聚合物形成单独的复合物或 者聚阴离子卡波姆聚合物与第二聚阴离子卡波姆聚合物是相同类型的聚合物。在某些可以 与之前的包含第二Env多肽的实施方式结合的实施方式中，Env多肽和第二Env多肽衍生 自HIVB亚型毒株和HIVC亚型毒株，反之亦然。在某些可以与之前的实施方式结合的实 施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种额外的HIV多肽。在某些可以与之前的包含 一种或多种额外的HIV多肽的实施方式结合的实施方式中，一种或多种额外的HIV多肽选 自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在 某些可以与之前的包含一种或多种额外的HIV多肽的实施方式结合的实施方式中，一种或 多种额外的HIV包含减少或消除多肽的活性而不负面影响额外的HIV多肽产生免疫应答的 能力的突变。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫原性复合物还包含佐 齐[J。在某些可以与之前的包含佐剂的实施方式结合的实施方式中，佐剂是MF59。
[0014] 本发明的另一个方面包含通过（a)将聚阴离子卡波姆聚合物与Env多肽在pH低 于溶液中Env多肽的pi的条件下接触；(b)将聚阴离子卡波姆聚合物与Env多肽一起孵育 以允许Env多肽形成与聚阴离子卡波姆聚合物的复合物来产生上述的免疫原性组合物的 方法。在一个实施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在某些可以与 之前的实施方式结合的实施方式中，pH为3-6 ;3-5或3-4。在另一个可以与之前的实施方 式结合的实施方式中，聚阴离子卡波姆聚合物不含苯。在另一个可以与之前的实施方式结 合的实施方式中，在接触步骤（a)之后聚阴离子卡波姆聚合物的浓度是约0. 01 % (w/v)-约 2. 0% (w/v)、约 0· 01 % (w/v)-约 0· 5% (w/v)或约 0· 01 % (w/v)-约 0· 2% (w/v)。在另一 个可以与之前的实施方式结合的实施方式中，聚阴离子聚合物包括CARB0P0L971PNF(TM)、 CARB0P0L974PNF(TM)或其组合，或优选CARB0P0L971PNF(TM)。在另一个可以与之前的实 施方式结合的实施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方 式中，Env多肽包括一个或多个突变。在某些可以与之前的包含一个或多个突变的实施方 式结合的实施方式中，该一个或多个突变选自在防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41 多肽的切割位点中的突变、在糖基化位点中的突变、Vl区的缺失、V2区的缺失以及上述的 组合。优选地，一个或多个突变包括在防止gp40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切 割位点中的突变以及V2区的缺失。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，Env 多肽包含gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env 多肽的多肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些可以与之前的实 施方式结合的实施方式中，Env多肽包括与SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、 至少80 %序列相同性、至少85 %序列相同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、 至少97%序列相同性、至少98%序列相同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某 些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，向溶液加入选自不同HIV亚型的第二Env多 肽作为Env多肽。在某些可以与之前的包含第二Env多肽的实施方式结合的实施方式中， 第二Env多肽与含有Env多肽的聚阴离子卡波姆孵育以允许Env多肽和第二Env多肽同时 与聚阴离子卡波姆聚合物形成复合物。在某些可以与之前的包含第二Env多肽的实施方式 结合的实施方式中，第二Env多肽与第二聚阴离子卡波姆聚合物形成单独的复合物。在某 些可以与之前的包含第二聚阴离子卡波姆聚合物的实施方式结合的实施方式中，聚阴离子 卡波姆聚合物和第二聚阴离子卡波姆聚合物是相同类型的聚合物。在某些可以与之前的实 施方式结合的包含第二Env多肽的实施方式中，Env多肽和第二Env多肽衍生自HIVB亚 型毒株和HIVC亚型毒株，反之亦然。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，该 方法还包含加入一种或多种额外的HIV多肽的步骤。在某些可以与之前的实施方式结合 的包含一种或多种额外的HIV多肽的实施方式中，一种或多种额外的HIV多肽选自Gag多 肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在某些可以 与之前的实施方式结合的包含一种或多种额外的HIV多肽的实施方式中，一种或多种额外 的HIV包含减少或消除多肽的活性而不负面影响额外的HIV多肽产生免疫应答的能力的突 变。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，该方法还包含向溶液加入佐剂的步 骤。在某些可以与之前的包含佐剂的实施方式结合的实施方式中，佐剂是MF59。
[0015] 本发明的另一个方面包含在对象中产生免疫应答的方法，包括向所述对象给予按 照之前的组合物方面或由按照前述的方法方面的方法产生的免疫原性组合物，从而产生针 对Env多肽的免疫应答。在一个实施方式中，免疫原性组合物通过肌肉内、粘膜内、鼻内、皮 下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给药。在某些可以与之前的实施方式结合的 实施方式中，对象是哺乳动物。优选地，所述哺乳动物是人。在某些可以与之前的实施方式 结合的实施方式中，免疫应答包含体液免疫应答。在某些可以与之前的实施方式结合的实 施方式中，免疫应答包含细胞免疫应答。
[0016] 本发明的另一个方面包含通过（a)由用于在允许Env多肽表达的条件下表达Env 多肽的基因递送载体来转染所述对象的细胞，从而产生针对Env多肽的免疫应答；(b)向所 述对象给予按照之前的组合物方面或由按照之前的方法方面的方法产生的免疫原性组合 物，从而增强针对Env多肽的免疫应答来在对象中产生增强的免疫应答的方法。
[0017] 本发明的另一个方面包含对象中产生增强的免疫应答的方法，在允许Env多肽表 达的条件下，该对象先前已经由用于表达Env多肽的基因的递送载体转染进所述对象的细 胞，从而已经产生对Env多肽的免疫应答，该方法包括向所述对象给予按照之前的组合物 方面或由按照之前的方法方面的方法产生的免疫原性组合物，从而增强对Env多肽的免疫 应答。在一个实施方式中，免疫原性组合物通过肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴 道内、直肠内、口服或静脉内给药。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，对象 是哺乳动物。优选地，所述哺乳动物是人。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式 中，免疫应答包含体液免疫应答。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫应 答包含细胞免疫应答。
[0018] 本文所述的是包含低粘度、聚阴离子卡波姆和Env多肽的新型组合物。本发明的 一个方面包含包括具有低粘度、聚阴离子卡波姆聚合物的Env多肽的免疫原性组合物。在 一个实施方式中，Env多肽是HIVEnv多肽或甚至HIV-IEnv多肽。在另一个可以与之前的 实施方式结合的实施方式中，聚阴离子卡波姆聚合物不含苯。在另一个可以与之前的实施 方式结合的实施方式中，聚阴离子卡波姆聚合物的浓度是约0.01% (w/ν)-约2.0% (w/v)、 约 0. 01 % (w/v)-约 0. 5% (w/v)或约 0. 01 % (w/v)-约 0. 2% (w/v)。在另一个可以与之 前的实施方式结合的实施方式中，低粘度、聚阴离子聚合物包括具有低于25000cP(25°C，布 氏RVT，20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5重量％胶浆，轴#6)、低于20000cP、低于15000cP的平 均粘度的聚阴离子聚合物，或该低粘度、聚阴离子聚合物是CARB0P0L971PNF(TM)。在另一 个可以与之前的实施方式结合的实施方式中，Env多肽是三聚的。在某些可以与之前的实施 方式结合的实施方式中，Env多肽包括一个或多个突变。在某些可以与之前的具有一个或 多个突变的实施方式结合的实施方式中，该一个或多个突变选自在防止gpl40多肽切割成 gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中的突变、在糖基化位点中的突变、Vl区的缺失、V2区 的缺失以及上述的组合。优选地，一个或多个突变包括在防止gp40多肽切割成gpl20多肽 和gp41多肽的切割位点中的突变以及V2区的缺失。在某些可以与之前的实施方式结合的 实施方式中，Env多肽包含gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽；gpl40Env多肽或 衍生自gpl40Env多肽的多肽；或者gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。在某些 实施方式中，Env多肽包括与SEQIDNO:22或23具有至少75%序列相同性、至少80%序 列相同性、至少85 %序列相同性、至少90 %序列相同性、至少95 %序列相同性、至少97 %序 列相同性、至少98%序列相同性、或至少99%序列相同性的氨基酸序列。在某些可以与之 前的实施方式结合的实施方式中，免疫原性组合物还包含选自不同HIV亚型的第二Env多 肽作为Env多肽。在某些可以与之前的包含第二Env多肽的实施方式结合的实施方式中， Env多肽和第二Env多肽衍生自HIVB亚型毒株和HIVC亚型毒株，反之亦然。在某些可 以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫原性组合物还包含一种或多种额外的HIV多 肽。在某些可以与之前的包含一种或多种额外的HIV多肽的实施方式结合的实施方式中， 一种或多种额外的HIV多肽选自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多 肽、Vpr多肽和Vpu多肽。在某些可以与之前的包含一种或多种额外的HIV多肽的实施方 式结合的实施方式中，一种或多种额外的HIV包含减少或消除多肽的活性而不负面影响额 外的HIV多肽产生免疫应答的能力的突变。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式 中，免疫原性组合物还包含佐剂。在某些可以与之前的包含佐剂的实施方式结合的实施方 式中，佐剂是MF59。
[0019] 本发明的另一个方面包含在对象中产生免疫应答的方法，包括向所述对象给予按 照之前的组合物方面的免疫原性组合物，从而产生针对Env多肽的免疫应答。在一个实施 方式中，免疫原性组合物通过肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服 或静脉内给药。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，对象是哺乳动物。优选 地，所述哺乳动物是人。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫应答包含体 液免疫应答。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫应答包含细胞免疫应 答。
[0020] 本发明的另一个方面包含通过（a)由用于在允许表达Env多肽的条件下表达Env多肽的基因递送载体来转染所述对象的细胞，从而产生针对Env多肽的免疫应答；(b)向所 述对象给予按照之前的组合物方面的免疫原性组合物，从而增强针对Env多肽的免疫应答 来在对象中产生增强的免疫应答的方法。
[0021] 本发明的另一个方面包含在对象中产生增强的免疫应答的方法，在允许Env多肽 表达的条件下，所述对象先前已经由用于表达Env多肽的基因的递送载体转染进所述对象 的细胞，从而已经产生对Env多肽的免疫应答，该方法包括向所述对象给予按照之前的组 合物方面的免疫原性组合物，从而增强对Env多肽的免疫应答。在一个实施方式中，免疫原 性组合物通过肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给药。 在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，对象是哺乳动物。优选地，所述哺乳动物 是人。在某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫应答包含体液免疫应答。在 某些可以与之前的实施方式结合的实施方式中，免疫应答包含细胞免疫应答。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1显示了在孵育各种时间长度之后，Env多肽-CARBOPOL(TM)复合物的免疫印 迹。组图㈧从左到右显示：（1)分子量标记物、⑵Env多肽复合物-0小时、（3)Env多肽 复合物-在4°C下1小时、（4)Env多肽复合物-在4°C下2小时、（5)Env多肽复合物-在 4°C下3小时、和（6)Env多肽复合物-在4°C下4小时。组图⑶从左到右显示：（1)分子 量标记物、（2)Env多肽复合物-在4°C下1小时、（3)Env多肽复合物-在20°C下1小时、 (4)在PBS中的Env多肽-在室温（25°C)下1小时、（5)分子量标记物、（6)Env多肽复合 物-在30°C下1小时、（7)Env多肽复合物-在37°C下1小时、和⑶在PBS中的Env多 肽-在37°C下1小时。在胶中CARBOPOL(TM)的终浓度是约0. 1%。
[0023] 图2显示单独CARBOPOL(TM)(左）或与Env(gpl40)多肽形成复合物的 CARBOPOL(TM)的动态光散射分析（10次测量值取平均）。单独CARBOPOL(TM)展示出约68nm 的流体力学半径。CARB0P0L(TM)+gpl40显示约86nm的半径，表明CARBOPOL(TM)和gpl40 在更高级的复合物中相互作用。在胶中CARB0P0L(TM)的终浓度为约0. 1%。
[0024]图 3 显示测试在室温（25°C)下用 0· 5 %CARB0P0L(TM)，I:I(v/v) (CARB0P0L(TM) 的终浓度为〇· 25% )孵育1小时（深灰色空心框）或3小时（浅灰色空心框）的Env多 肽的结合的ELISA试验。也相似地孵育不含CARB0P0L(TM)的Env多肽（作为对照）（实心 框）。y轴显示〇D450nm而X-由显示gpl20的浓度（μg/ml)。（A)显示与CD4-IgG2 (受体 CD4的替代物）结合的gpl20样品。（B)显示与bl2(CD4-结合位点中和单克隆抗体，单抗） 结合的gpl20样品。（C)显示在存在或不存在可溶⑶4,s⑶4的情况下与17b单抗（⑶4-诱 导的单克隆抗体）的结合。⑶4gG2和bl2单抗显示尽管用CARBOPOL(TM)孵育，构象受体结 合位点是抗原性完整的。17b单抗结合证实该蛋白能够经过CD4-诱导的构象变化，这是功 能性Env多肽的关键方面。
[0025] 图4是显示通过对单独Env多肽或与聚阴离子卡波姆（CARB0P0L(TM))形成复合 物的Env多肽的表面等离振子共振测量的反应单位（RU-y轴）的图。在左侧用白色柱显示 与结合到传感器芯片的可溶性CD4(sCD4)的结合。在右侧用灰色柱显示与结合到传感器芯 片上的聚糖依赖性单克隆抗体（2G12)的结合。
[0026] 图 5 是显示来自比较由CARB0P0L(TM)或MF59 (TM)或者CARB0P0L(TM) +MF59 (TM) 佐剂化的Env多肽（SF162gpl40)的兔子研究中的用gpl20-结合ELISA测量的血清中抗体 (几何平均效价-y轴）的图。用白色柱表示在第2次免疫后2周（2wp2)时的几何平均效 价。用浅灰色柱表示在第3次免疫后2周（2wp3)时的几何平均效价。用黑色柱表示在第 4次免疫后2周（2wp4)时的几何平均效价。
[0027]图6是显示用硫氰酸铵ELISA评价gpl20_特异性血清抗体的亲合力的图（亲合力 指数_y轴）。血清是来自比较由CARB0P0L(TM)或MF59 (TM)或者CARB0P0L(TM) +MF59 (TM) 佐剂化的Env多肽（SF162gpl40)的兔子研究。用白色柱表示在第2次免疫后2周（2wp2) 时的亲合力指数。用浅灰色柱表示在第3次免疫后2周（2wp3)时的亲合力指数。用黑色 柱表示在第4次免疫后2周（2wp4)时的亲合力指数。
[0028] 图7A-B显示从兔子研究中的免疫方案产生的Env-特异性抗体的中和潜力的结 果，该研究比较由CARBOPOL(TM)或MF59(TM)或者CARB0P0L(TM)+MF59(TM)佐剂化的Env 多肽（SF162gpl40)。每张图显示来自（a)用含MF59(TM)的Env多肽的免疫、（b)用Env多 肽-聚阴离子卡波姆复合物的免疫、和（c)用含MF59 (TM)的Env多肽-聚阴离子卡波姆复 合物的免疫的第3次（p3)和第4次（p4)免疫后抗体的ID50效价。图7A显示针对Ia级 和Ib级分离株的中和潜力。图7B显示针对2级分离株和对照的中和潜力。
[0029] 图8A-B显示了表示HIV-I假病毒的血清中和的幅度和效力（ID50效价）的热图。 显示了来自每组中5只兔子中每只的结果。黑色的样品证明与1000-9999的血清稀释50% 中和；深灰色的样品证明与100-999的血清稀释50%中和；并且浅灰色遮蔽的样品证明与 20-99的血清稀释50%中和。图8A显示针对Ia级和Ib级分离株的幅度和效力。图8B显 示针对2级分离株的幅度和效力。
[0030] 图9A-E显示针对各种分离株的中和ID50效价。图9A显示针对Ia级分离株 (2wp3(p3)、2wp4(p4)和 2wp5(p5)) :MW965.26(C亚型）和SF162.LS(B亚型）的中和ID50 效价。图9B显示针对另一种Ia级分离株（2wp3 (p3)、2wp4 (p4)和2wp5 (p5)) :MN(B亚型） 的中和ID50效价。图9C显示针对两种lb级分离株（2wp3(p3)、2wp4(p4)和2wp5(p5)): Bal. 26 (C亚型）和TVL21 (B亚型）的中和ID50效价。图9D显示针对两种2级分离株 (2wp3(p3)、2wp4(p4)和 2wp5(p5)) :ZM249M.PL1(C亚型）和Dul56. 12(C亚型）的中和ID50 效价。图9E显示针对另一种2级分离株（2wp3 (p3)、2wp4 (p4)和2wp5 (p5)) :Du422.I(C亚 型）的中和ID50效价。
[0031] 图10显示了由gpl20-结合ELISA测量的针对TVlgpHOEnv多肽的总抗体结合效 价。也包含了预采血（用作对照）的背景效价。通过使用作为包被蛋白的TVlgpHOEnv多 肽来确定抗体效价。显示数据值代表每组中单独一式三份试验的5只兔子的几何平均效价 (GMT) 〇
[0032]图11显示来自实施例6的所有10组兔子收集的血清的抗体亲合力，这些兔子用 由MF59(TM)(并且在一例中由MF59(TM)和CARBOPOL(TM))佐剂化的单价或多价的Env多 肽免疫。从左至右的组为：Du422.lgpl40、Dul56. 12gpl40、CAP45gpl40、ZM249M.PLlgpl40、 HIV-25711-2 (EF117272)gpl40、CAP255 (EF203982)gpl40,CAP239 (EF203983)gpl40、 ZM249M.PLlgpl40+CAP239 (EF203983)gpl40+Du422.IgpHO(仅含MF59 (TM))、ZM249E PLlgpl40+CAP239(EF203983)gpl40+Du422.1gpl40(含MF59(TM)和CARBOPOL(TM))、和 TVlgpl40。以增加的灰度显示了以下每组的亲合力（从左到右）：预采血、第2次免疫后2周 (2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次免疫后2周（2wp4)和第5次免疫后2周（2wp5)。 如由I.K.Srivastava等，（J.Virol. 2002)所述，使用作为包被抗原的TVlgpHOEnv多肽的 NH4SCN置换ELISA来确定亲合力。
[0033] 图12A-B显示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒血清中 和的幅度和效力（ID50效价）的热图。黑色的样品证明与超过10000的血清稀释50%中 和；有白色数字的深灰色的样品证明与1000-9999的血清稀释50%中和；深灰色的样品证 明与100-999的血清稀释50%中和；并且浅灰色遮蔽的样品证明与20-99的血清稀释50% 中和。
[0034] 图13A-C显示了表示使用在第4次免疫后2周收集的血清对扩大组的毒株的 HIV-I假病毒的血清中和的幅度和效力（ID50效价）的热图。黑色的样品证明与1000-9999 的血清稀释50%中和；深灰色的样品证明与100-999的血清稀释50%中和；并且浅灰色遮 蔽的样品证明与20-99的血清稀释50%中和。
[0035] 图14A-E显示在第3次免疫后（p3) 2周后和第4次免疫后（p4) 2周得到的血清 的ID50中和效价，如使用HIV-I假病毒试验测定。图14A显示了针对两种IA级分离株： MW965. 26(C亚型）（左）和SF162.LS(B亚型）（右）的中和效价。图14B显示针对第三种 IA级分离株：丽.2 (B亚型）的中和效价。图14C显示了针对两种IB级分离株：Bal. 26(B 亚型）（左）和TVL21 (C亚型）（右）的中和效价。图14D显示了针对两种2级分离株： ZM249M.PLl(C亚型）（左）和Dul65. 12 (C亚型）（右）的中和效价。图14E显示针对第三 种2级分离株：Du422.I(C亚型）的中和效价。
[0036] 图15显示用gpl20_结合ELISA测量的从全部9组收集的兔血清的结合抗体效 价（几何平均效价-y轴）。从左至右的组为：〇11156.128?140、〇11422.18?140、2]\1249^PLlgpl40、CAP239gpl40、TVlgpl40,TVlgpHOΛV2、SF162gpl40ΛV2、ZM249M.PLlgpHO+ CAP239gpl40+Du422.lgpl40+TVlgpl40(组 8,多价给予）、和CAP239gpl40/Du422.IgpHO/ ZM249M.PLlgpl40/TVlgpl40 (组9,依次给予）。以增加的灰度显示了以下每组的几何平均 效价（从左到右）：预采血、第2次免疫后2周（2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次 免疫后2周（2wp4)和放血。
[0037] 图16显示从全部9组收集的兔血清的抗体亲合力。从左至右的组为： Dul56. 12gpl40、Du422.lgpl40、ZM249M.PLlgpl40、CAP239gpl40、TVlgpl40、TVlgpl40AV2、 SF162gpl40AV2、ZM249M.PLl+CAP239+Du422.1+TVlgpl40(组 8)和CAP239gpl40/ Du422.lgpl40/ZM249M.PLlgpl40/TVlgpl40(组9)。显示了每组的亲合力指数（从左到右）： 第2次免疫后2周（2wp2)、第3次免疫后2周（2wp3)、第4次免疫后2周（2wp4)和放血。 如由I.K.Srivastava等，（J.Virol. 2002)所述，使用作为包被抗原的TVlgpHOEnv多肽的 NH4SCN置换ELISA来确定亲合力。
[0038] 图17A-F显示了通过用10种gpl20Env多肽中的每种的免疫和依次免疫实验诱导 的抗体针对一组病毒分离株（X-轴）的中和潜力（ID50效价，y-轴）。图17A显示Dul56. 12 gpl2〇 (左）和Du422·Igpl2〇 (右）的中和潜力（以ID5O效价计）。图I7B显示ZMM9M. PLlgpl2〇 (左）和CAP45 (EF2O396O)gpl2〇 (右）的中和潜力（以ID5O效价计）。图I7C显 示CAP84(EF2〇3963)gpl2〇(左）和CAP239(EF2〇3983)gpl2〇(右）的中和潜力（以ID5O效 价计）。图17D显示TVlgpl20 (左）和SF162gpl20 (右）的中和潜力（以ID50效价计）。 图17E显示TVlgpl40 (左）和SF162gpl40 (右）的中和潜力（以ID50效价计）。图17F 显示由CAP239gpl20、Du422.1gpl20、ZM249.PLlgpl20 和TVlgpl20s依次免疫（左）和 在单个图上显示的全部测试组（右）的中和潜力（以ID50效价计）。
[0039] 图18A-B显示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒的血清 中和的幅度和效力（ID50效价）的热图。深灰色的样品证明与>10000的血清稀释50%中 和；并且浅灰色的样品证明与1000-9999的血清稀释50%中和。
[0040] 图19显示用在用C亚型gp120的第4次免疫后2周（第22周）收集的合并兔血 清（I:100稀释）针对经固定的TVlgpHOEnv多肽进行的单克隆抗体（单抗）竞争ELISA 的结果，为了定位免疫后引发的抗-Env抗体的表位特异性。测试的Env多肽的分离株示于 上方。在竞争试验中使用的表位和单抗沿着左侧显示。
[0041] 图20A-F显示了通过用10种构建体中的每种的免疫豚鼠诱导的抗体针对一组病 毒分离株（X-轴）的中和潜力（ID50效价，y-轴）。图20A显示Dul56. 12gpl20(左）和 Du422.1gpl20(右）的中和潜力（以ID50效价计）。图20B显示ZM249M.PL1gpl20(左）和 CAP45 (EF203960)gpl20 (右）的中和潜力（以ID50 效价计）。图 20C显示CAP84 (EF203963) gpl2〇(左）和CAP239(EF2〇3983)gpl2〇(右）的中和潜力。图 20D显示TVlgpl2〇(左） 和SF162gpl20(右）的中和潜力（以ID50效价计）。图20E显示TVlgpl40(左）和 SF162gpl40(右）的中和潜力（以ID50效价计）。图20D在单张图上显示了所有测试组的 中和潜力。
[0042] 图21显示了表示使用在第3次免疫后2周收集的血清的HIV-I假病毒血清中和 的幅度和效力（以ID50效价计）的热图。深灰色的样品证明与>10000的血清稀释50%中 和；并且浅灰色的样品证明与1000-9999的血清稀释50%中和。
[0043] 图22显示用来自实施例10的豚鼠研究的第3次免疫后2周（第14周）收集的 合并兔血清（I:500稀释）针对经固定的TVlgpl40Env多肽进行的单克隆抗体（单抗）竞 争ELISA的结果，为了定位免疫后引发的抗-Env抗体的表位特异性。测试的Env多肽的分 离株示于上方。在竞争试验中使用的表位和单抗沿着左侧显示。
[0044] 图23显示用来自实施例10的豚鼠研究的第4次免疫后2周（第26周）收集的 合并兔血清（I:500稀释）针对经固定的TVlgpl40Env多肽进行的单克隆抗体（单抗）竞 争ELISA的结果，为了定位免疫后引发的抗-Env抗体的表位特异性。测试的Env多肽的分 离株示于上方。在竞争试验中使用的表位和单抗沿着左侧显示。
[0045] 图24A-K显示在免疫开始后的几个时间点上（y轴），55只用由 MF59 (TM) +CARB0P0L971 (TM)佐剂化的gpl20Env多肽免疫的兔子的体重（y轴）。图24A显 示兔1-5。图24B显示兔6-10。图24C显示兔11-15。图24D显示兔16-20。图24E显示 兔21-25。图24F显示兔26-30。图24G显示兔31-35。图24H显示兔36-40。图241显示 兔41-45。图24J显示兔46-50。图24K显示兔51-55。
[0046] 优选实施方式详述
[0047]HIV-I包膜糖蛋白（Env)是暴露于体液免疫反应的主要病毒蛋白，因此其是开发 疫苗的重要靶标。使用Env引发强效抗HIV-I中和抗体已经由于各种因素而复杂化。关键 因素是抗原变异和Env的结构复杂性。重组Env糖蛋白已经显示出在没有佐剂的情况下次 佳的免疫原性。因此，除了优化Env-免疫原的设计以外，新型佐剂和/或递送系统的鉴定 在产生疫苗介导的针对HIV的保护性免疫应答中是重要的。
[0048] 由于Env是特别不稳定的并且具有构象依赖性中和表位，不使其变性或负面改变 抗原结构的佐剂是优选的。下面的实施例证明了当在与Env多肽的复合物中使用时，交联 的、聚丙烯酸聚合物（聚阴离子卡波姆或CARBOPOL(TM))引发了强免疫应答。聚丙烯酸聚合 物是特别有益的，在于它们可以与其它的诸如MF59 (TM)的佐剂结合以甚至进一步改善免 疫应答。重要地，当与MF59 (TM) -起使用聚阴离子卡波姆时，实施例显示了在中和抗体的 总幅度和强度中的改善。总之，实施例证明聚阴离子卡波姆可以与Env形成复合物而不改 变多肽的抗原结构或稳定性并且复合物在单独接种疫苗或与其它诸如MF59 (TM)的佐剂组 合之后引发更好的免疫应答。尽管不受限于理论，改善的免疫应答可能是由于聚阴离子卡 波姆向免疫系统中的特定细胞导向或呈递Env多肽和/或聚阴离子卡波姆在储存期间和接 种疫苗之后使得Env多肽稳定。另外，Env多肽可以用低粘度的，具有低于25000cP(25°C， 布氏RVT，20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5 重量％胶浆，轴 #6)、低于 20000cP、低于 15000cP 的平均粘度的聚阴离子聚合物佐剂化。这样的低粘度，聚阴离子聚合物是优选的示例是 CARB0P0L97IPNF(TM)。
[0049] 除非另有说明，公开的组合物和方法的实施将仅需要化学、生物化学、分子生物 学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充 分描述。参见，例如《雷明顿药物科学》(Remingtor^sPharmaceuticalSciences),第18版 (宾夕法尼亚州伊斯顿（Easton，Pa.):马克出版公司（MackPublishingCompany) ,1990); 《酶学方法》（MethodsInEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社有限公司 (AcademicPress，Inc.));《实验免疫学手册》（HandbookofExperimentalImmunology)， 第I-IV卷，（D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986,布莱克威尔科学出版社（Blackwell ScientificPublications));Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》（MolecularCloning: ALaboratoryManual)(第二版，1989);《分子生物学简单方法》（ShortProtocolsin MolecularBiology),第四版，（Ausubel等编，1999，JohnWiley&Sons);《分子生物学技术： 强化实验室课程》（MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse)， (Ream等编，1998,学术出版社）；《PCR(生物技术丛书引言）》（PCR(Introductionto BiotechniquesSeries)),第二版，（Newton和Graham编，1997,SpringerVerlag) 〇
[0050] 聚阴离子卡波姆聚合物
[0051] 在本文所述的组合物和方法中使用的聚阴离子卡波姆聚合物是丙烯酸聚合物。这 些丙烯酸聚合物可以是均聚物或共聚物。聚阴离子卡波姆聚合物在CARBOPOL(TM)的商品 名下市售可得。丙烯酸聚合物在例如，美国专利号2, 909, 462和3, 790, 665中描述。
[0052] 尽管存在许多待选的从中形成具有改善的免疫原性的复合物的聚阴离子卡波姆 聚合物，优选的聚阴离子卡波姆聚合物是具有较少交联并且在苯存在下不形成以避免残留 的苯的那些聚合物（潜在的更有毒性的有机化合物）。基于优选的特性，选择CARB0P0L971P NF(TM)聚合物，由于其含有残留的乙酸乙酯溶剂（按照ICH规定的III类溶剂）而不是苯。 我们也考虑974PNF，其是化学上相似的并且有更多的显示其安全的毒理学和其它支持性 数据，但是由于它是非常高分子量的交联的聚丙烯酸，我们决定选择971PNF，由于其是相 对轻的交联聚合物并且会有助于溶剂化。由于可以得到974PNF的法规和毒理学信息，并 且它们可能适用于971PNF，我们在我们的研究中满意地选择后者。
[0053] 取决于聚合物的这些聚合物的分子量的范围被估计为从740000至4-5百万道尔 顿。没有测量该类型的交联的（即，三维的）聚合物的实际分子量的方法，因此必须通过其 它诸如动态光散射等的方式来估计大小。均聚物的主链是相同的，例如，聚合的丙烯酸。主 要的差异与交联密度和估计的分子量相关，而不是使用的交联剂。采用在交联剂密度中非 常小的调节，可以产生大量的总分子结构相似但是在应用性质中，例如粘度不同的聚阴离 子卡波姆聚合物。交联密度可以通过在丙烯酸主链上交联剂位置的少量位移来改变。因为 实际交联剂本身对特定丙烯酸聚合物的生物性质可能有很少的影响，对于这些聚合物，化 妆品、篮洗用品和香精香料协会（CTFA)已经获得系列专用名（familymonograph)，"卡波 姆（carbomer)"。
[0054]诸如CARB0P0L(TM)、PEMULEN(TM)和N0VE0N(TM)等的聚阴离子卡波姆聚合物是 本发明范围内的聚合物。这些特定的聚阴离子卡波姆聚合物与聚烯基醚或二乙烯基乙二醇 (divinylglycol)交联。
[0055] 聚阴离子卡波姆聚合物是平均约0. 2微米直径的颗粒的絮凝粉末。每个颗粒可以 被视为通过交联互连的聚合物链的网状结构。没有交联，初级颗粒会是缠结的但不是化学 结合的线性聚合物链的集合。这些线性聚合物在诸如水的极性溶剂中是可溶的。在水中， 当暴露于高于4-6的pH环境中时，聚阴离子卡波姆聚合物相比它们原始的体积溶胀1000 倍（并且10倍于它们的原始直径）以形成胶。由于这些聚合物的PKa是6±0. 5,在聚合物 主链上的羧酸基团离子化，导致带负电的颗粒之间的排斥，其增加了聚合物的溶胀。交联的 聚合物并不溶于水。
[0056] 特定类型的聚阴离子卡波姆聚合物的特性：CARB0P0L934P(TM)是与烯丙基蔗糖 交联的并且在溶剂苯中聚合。CARBOPOL971P(TM)(71G，974P)与烯丙基季戊四醇交联并 且在乙酸乙酯中聚合。聚卡波非是在二乙烯基乙二醇中交联的聚合物并且在溶剂苯中聚 合。所有在乙酸乙酯中制造的聚合物由1-3%氢氧化钾中和。虽然CARBOPOL971P(TM) 和CARBOPOL974P(TM)在相似条件下通过相同的过程生产；它们之间的差异是CARBOPOL 971P(TM)相比CARBOPOL974P(TM)具有稍低水平的交联剂。CARBOPOL71G(TM)是 CARBOPOL(TM)的颗粒形式。
[0057] 尽管结构和性质之间的关系在学术上和工业上都是感兴趣的。不同等级的聚阴离 子卡波姆聚合物展现出不同的流变性质、粒度的反射、交联之间的分子量（Me)、Mc的分布 和总单位的分数，其以末端出现，例如游离的链末端。相邻的交联之间的分子量（Mc)与交 联剂的密度大概成反比。这些可以由交联的单体的官能团、丙烯酸与交联单体的相对比、和 交联反应的效率计算，假设可忽略链端。另外，分子量可以与溶胀胶的和/或来自平衡溶胀 率的流变性质定性比较。简单来说，诸如CARBOPOL971P(TM)的低粘度、低刚性聚合物有 较高的Me。相反，它们有较低的交联剂密度。交联剂水平越高，平衡溶胀率越低。在弹性的 网络理论中，弹性模量G与交联之间的分子量（Me)成反比。
[0058]CARBOPOL971P(TM)提供了非常低的粘度和在低用量水平下的出色屈服值。由 CARBOPOL971P(TM)形成的悬浮液会有较长的流变性。CARBOPOL71G(TM)聚合物会提供 与CARBOPOL971P(TM)相同的粘度和流变性，但是由于其颗粒性质，它易于处理和分散。
[0059] 详细毒性：像其它高分子量聚合物，聚阴离子卡波姆聚合物证明基于它们的物理 和化学性质的低毒性和刺激潜力。因此，已经由设计这些产品的合适的监管机构或非监管 机构发现这样交联的，高分子量丙烯酸聚合物在多种化妆品、去污剂和药物应用中是安全 的。
[0060] 卡波姆是USP-NF、美国采用名委员会（USAN)和CTFA采用的各种CARBOPOL(TM) 聚合物的通用（即，非专利）名称。化妆品原料审查（CIR)专家组在他们的用于化妆品 原料的卡波姆的安全性的评价中如下概述了卡波姆的毒性：用大鼠、豚鼠、小鼠和狗的急 性口服研究显示当摄取时，卡波姆910、-934、-940和-941有低毒性。在大白鼠中，卡波 姆910的吸入LC5tl是1.71mg/l。暴露于卡波姆910的大鼠的皮肤LC5tl为超过3.0g/kg。 在静脉内注射5ml/kg的剂量的水溶液中1 %、2%或3%卡波姆934的兔子中没有出现死 亡。当用100%卡波姆910或934测试时，兔子显示出最小的皮肤刺激，并且当用卡波姆 910、-934、-934P、-940、-941、和/或他们的各种盐在0· 20-100%的浓度下测试时，零到中 等的眼睛刺激。用高至5. 0g/kg/天卡波姆934的大鼠的亚慢性喂食（49天）和高至进食 中5. 0%卡波姆934P的大鼠和狗的亚慢性喂食（21和/或90天）导致低于正常体重。在 以5. 0 %的进食水平喂食卡波姆934P维持90天的大鼠中，绝对肝重和肝与身体和脑的重量 比降低，但是没有观察到病理学变化。本领域技术人员当选择在本文所述的组合物和方法 中使用的聚阴离子卡波姆聚合物时容易考虑这样的问题。
[0061] 用卡波姆934 (CARB0P0L934 (TM))及其各种盐进行的临床研究显示这些聚合物在 0. 5%、5. 0%、10. 0%和100%的浓度下有低的皮肤刺激和致敏的潜力。当用1. 0%浓度在 人上测试时，卡波姆940、941及其各种盐也证明低的皮肤刺激和致敏潜力。另外，含有高至 0. 25%卡波姆934的制剂证明低的人皮肤刺激、致敏、光毒性和光接触变应原性的潜力。用 于评价卡波姆940和-941的皮肤刺激和致敏潜力的临床数据被限于仅1. 0 %的浓度被测试 的研究中。用于评价光毒性和光接触变应原性的临床数据被限于仅0. 25%浓度的卡波姆 934被测试的制剂研究。
[0062] CIR专家组注意到作为卡波姆中杂质的苯的存在并且推荐努力将它减少到可能 的最低水平。在该目标的追求中，卢比作先进材料公司（LubrizolAdvancedMaterials,Inc.)已经开发了新的使用替代的聚合溶剂体系（例如，乙酸乙酯、环己烷等）的 CARBOPOL(TM)聚合物。因此，优选使用诸如在苯存在下不形成的CARB0P0L971PNF(TM)的 聚阴离子卡波姆聚合物。这些聚阴离子卡波姆聚合物与苯聚合的聚阴离子卡波姆聚合物是 化学上相同的，并且因此列在美国环保局的TSCA名录上作为丙烯酸聚合物或丙烯酸共聚 物。
[0063] 对于乙酸乙酯聚合的聚合物的初步毒性测试结果与之前的产品基本相似。在人重 复贴片测试中，他们不是首要的刺激物或致敏物。在兔子中，皮肤LD50超过2000mg/kg体 重。相似地，其对于兔眼刺激最小。不能得到急性口服LD50,因为足够的聚合物的插管是不 可能的。在乙酸乙酯中制造的聚阴离子卡波姆聚合物上的结果与这些聚合物的期望结果是 一致的。即，它不是兔子皮肤的刺激物；未稀释的聚合物对兔子眼是温和到中等的刺激物， 而1 %溶液（中和或未中和的）不是眼刺激物；施涂与人皮肤不会造成任何皮肤刺激或致 敏。在大鼠中的LD50超过5000mg/kg并且在兔子中皮肤LD50超过2000mg/kg。
[0064] 考虑到聚阴离子卡波姆聚合物的物理性质和结构中的相似性，本领域技术人员会 认为聚阴离子卡波姆聚合物会产生与CARB0P0L971PNF(TM)相似的结果。因此，本领域技 术人员容易选择任意数量的可得的聚阴离子卡波姆聚合物来产生本文中基于前述的令人 惊讶的结果。
[0065] 当选择低粘度，聚阴离子聚合物时，平均粘度低于25000cP(25°C，布氏RVT， 20rpm，中和至ρΗ7· 3-7. 8,0· 5重量％胶浆，轴#6)、低于20000cP或低于15000cP。低粘度， 聚阴离子聚合物是优选的示例是CARB0P0L971PNF(TM)。
[0066]Env多肽
[0067]Env多肽包含衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIVEnv的分子。HIV-I的包膜蛋白是 约160kDa的糖蛋白（gpl60)。在宿主细胞的病毒感染期间，由宿主细胞蛋白酶切割gpl60 来形成gpl20和整合?旲蛋白，gp41。gp41蛋白被铺定（并且跨越）在病毒颗粒的?旲双层中， 而gpl20部分凸入周围的环境中。由于在gpl20和gp41之间没有共价连接，从病毒颗粒和 感染的细胞的表面释放游离的gpl20。Env多肽也可以包含gpl40多肽。Env多肽可以单体 或三聚体存在。
[0068]Env多肽包含衍生自Env多肽的gpl20区的分子。gpl20的一级氨基酸序列是具有 约60000道尔顿的多肽核心的大约511个氨基酸。多肽由N-连接的糖基化广泛修饰以增 加分子的表观分子量至120000道尔顿。gpl20的氨基酸序列（和因此的gpl40和gpl60) 含有由5个高变的结构域分散的5个相对保守的结构域。在HIV-1hxb_2毒株的gpl20 -级 序列中18半胱氨酸残基的位置，和在gpl20序列中24N-连接的糖基化位点的13的位置对 于如果不是全部的大多数gpl20序列是共同的。高变结构域含有广泛的氨基酸取代、插入 和缺失。尽管有这种变异，如果不是全部的大多数gpl20序列保留了病毒结合到病毒受体 CD4的能力。
[0069]Env多肽（例如，gpl20、gpl40和gpl60)包含形成β-折叠的4条反向平行的 β-链（β-2、β-3、β-20和β-21)的"桥连的片层"。从一对β-链（β-2和β-3)挤出 的是两个环，Vl和V2。β-2折叠大约出现在氨基酸残基113(Cys)到氨基酸残基117(Thr) 而β-3大约出现在氨基酸残基192(Ser)到氨基酸残基194(Ile)，相对于SF-162。"V1/V2 区"大约出现在氨基酸位置120 (Cys)到残基189 (Cys)，相对于SF-162。（参见例如Wyatt 等，（1995)J.Virol. 69 :5723-5733;Stamatatos等，（1998)J.Virol. 72 :7840-7845)。从第 二对β-链（β-20和β-21)挤出的是一个"小环"结构，本文中也称为"桥连片层小环"。 根据本文的教导和W000/39303,小环和桥连片层小环的位置可以相对于ΗΧΒ-2确定。表1 提供了一列编码基于SF162链和相应的SEQIDNO的代表性Env多肽的合成基因。
[0070]表 1 :
[0071]
[

【权利要求】
1. 一种免疫原性组合物，所述组合物包含与聚阴离子卡波姆聚合物形成复合物的Env 多肽。
2. -种免疫原性组合物，其包含含有低粘度、聚阴离子卡波姆聚合物的Env多肽。
3. 如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子卡波姆聚合物 不含苯。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子卡波 姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约2. 0% (w/v)。
5. 如权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子卡波 姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约0. 5% (w/v)。
6. 如权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子卡波 姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约0. 2% (w/v)。
7. 如权利要求1和3-6中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子聚 合物包含 CARBOPOL971P NF(TM)、CARBOPOL974P NF(TM)或其组合。
8. 如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述聚阴离子聚合 物包含 CARBOPOL971P NF(TM)。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽是三聚 的。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽包含 一个或多个突变。
11. 如权利要求10所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一个或多个突变选自在 防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中的突变、在糖基化位点中的突 变、VI区的缺失、V2区的缺失以及上述的组合。
12. 如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一个或多个突变包含在 防止gpl40多肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中的突变以及V2区的缺失。
13. 如权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl60Env多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽。
14. 如权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl40Env多肽或衍生自gpl40Env多肽的多肽。
15. 如权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽包含 gpl20Env多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。
16. 如权利要求1-8中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽包含 与SEQ ID NO :22或23有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
17. 如权利要求1-16中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包 含选自与所述Env多肽不同HIV亚型的第二Env多肽。
18. 如权利要求1-16中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包 含选自与所述Env多肽相同HIV亚型的不同毒株的第二Env多肽。
19. 如权利要求17或18所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第二Env多肽和所 述Env多肽与所述聚阴离子卡波姆聚合物形成混合的复合物。
20. 如权利要求17或18所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第二Env多肽与第 二聚阴离子卡波姆聚合物形成单独的复合物。
21. 如权利要求20所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述聚阴离子卡波姆聚合物 和所述第二聚阴离子卡波姆聚合物是相同类型的聚合物。
22. 如权利要求17-21中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述Env多肽和 所述第二Env多肽衍生自HIV B亚型毒株和HIV C亚型毒株或反之亦然。
23. 如权利要求1-22中任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含 一种或多种额外的HIV多肽。
24. 如权利要求23所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一种或多种额外的HIV多 肽选自Gag多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。
25. 如权利要求23或24所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述一种或多种额外的 HIV多肽包含降低或消除所述多肽的活性而不负面影响所述额外的HIV多肽产生免疫应答 的能力的突变。
26. 如权利要求1-25所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
27. 如权利要求26所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂是水包油乳液。
28. 如权利要求27所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述水包油乳液是包含角鲨 烷的亚微米制剂。
29. 产生按照权利要求1和3-28中任一项的免疫原性组合物的方法，所述方法包含： (a) 在pH低于溶液中所述Env多肽的pi的条件下将所述聚阴离子卡波姆聚合物与所 述Env多肽接触； (b) 所述聚阴离子卡波姆聚合物与所述Env多肽一起孵育使得所述Env多肽形成与所 述聚阴离子卡波姆聚合物形成复合物。
30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH为3至6之间。
31. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH为3至5之间。
32. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述pH为3至4之间。
33. 如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，在接触步骤（a)后所述聚阴 离子卡波姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约2. 0% (w/v)。
34. 如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，在接触步骤（a)后所述聚阴 离子卡波姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约0. 5% (w/v)。
35. 如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，在接触步骤（a)后所述聚阴 离子卡波姆聚合物的浓度为约〇. 01% (w/ν)-约0. 2% (w/v)。
36. 如权利要求29-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子卡波姆聚合物 不含苯。
37. 如权利要求29-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子聚合物包含 CARB0P0L971P NF(TM)、CARB0P0L974P NF(TM)或其组合。
38. 如权利要求29-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子聚合物包含 CARB0P0L971P NF(TM)。
39. 如权利要求29-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽是三聚的。
40. 如权利要求29-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含一个或多 个突变。
41. 如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述一个或多个突变选自在防止gpl40多 肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中的突变、在糖基化位点中的突变、VI区的缺 失、V2区的缺失以及上述的组合。
42. 如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述一个或多个突变包含在防止gpl40多 肽切割成gpl20多肽和gp41多肽的切割位点中的突变以及V2区的缺失。
43. 如权利要求29-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl60Env 多肽或衍生自gpl60Env多肽的多肽。
44. 如权利要求29-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl40Env 多肽或衍生自gpl40Env多肽的多肽。
45. 如权利要求29-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含gpl20Env 多肽或衍生自gpl20Env多肽的多肽。
46. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述Env多肽包含与SEQ IDNO :22或23 有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
47. 如权利要求29-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含选自与所述 Env多肽不同HIV亚型的第二Env多肽。
48. 如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二Env多肽与含有所述Env多肽的 所述聚阴离子卡波姆聚合物孵育使得所述Env多肽和所述第二Env多肽同时与所述聚阴离 子卡波姆聚合物形成复合物。
49. 如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述第二Env多肽与第二聚阴离子卡波姆 聚合物形成单独的复合物。
50. 如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子卡波姆聚合物和所述第二 聚阴离子卡波姆聚合物是相同类型的聚合物。
51. 如权利要求47-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述Env多肽和所述第二 Env多肽衍生自HIV B亚型毒株和HIV C亚型毒株或反之亦然。
52. 如权利要求29-51中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包含加入一种或多 种额外的HIV多肽。
53. 如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外的HIV多肽选自Gag 多肽、Nef多肽、Prot多肽、Tat多肽、Rev多肽、Vif多肽、Vpr多肽和Vpu多肽。
54. 如权利要求52或53所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外的HIV多肽包 含降低或消除所述多肽的活性而不负面影响所述额外的HIV多肽产生免疫应答的能力的 突变。
55. 如权利要求29-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含向所述溶液 加入佐剂。
56. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述佐剂是水包油乳液。
57. 如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述水包油乳液是包含角鲨烷的亚微米 制剂。
58. -种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包含向所述对象给予按照权利要求 1-28中任一项或按照权利要求29-57中任一项的方法制备的免疫原性组合物，从而产生对 所述Env多肽的免疫应答。
59. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过肌肉内、粘膜 内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给药。
60. 如权利要求58或59中所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
61. 如权利要求58-60中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
62. 如权利要求58-61中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包含体液免疫 应答。
63. 如权利要求58-62中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包含细胞免疫 应答。
64. -种在对象中产生增强的免疫应答的方法，所述方法包含： (a) 在允许Env多肽表达的条件下，由用于表达所述Env多肽的基因递送载体转染所述 对象的细胞，从而产生对所述Env多肽的免疫应答； (b) 向所述对象给予按照权利要求1-28中任一项或按照权利要求29-57中任一项的方 法制备的免疫原性组合物，从而增强对所述Env多肽的免疫应答。
65. -种在对象中产生增强的免疫应答的方法，在所述对象中先前已经在允许Env多 肽表达的条件下由用于表达Env多肽的基因递送载体转染进所述对象的细胞，从而已经产 生对所述Env多肽的免疫应答，所述方法包含向所述对象给予按照权利要求1-28中任一项 或按照权利要求29-57中任一项的方法制备的免疫原性组合物，从而增强对所述Env多肽 的免疫应答。
66. 如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过肌肉内、粘膜 内、鼻内、皮下、皮内、透皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给药。
67. 如权利要求65或66中所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
68. 如权利要求65-67中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
69. 如权利要求65-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包含体液免疫 应答。
70. 如权利要求65-69中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包含细胞免疫 应答。
【文档编号】A61K39/385GK104271155SQ201280055731
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2011年11月14日
【发明者】S·W·巴尼特, A·德伊 申请人:诺华股份有限公司