具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质的制作方法
【专利摘要】本发明提供当用作核酸递送载体时能够实现高细胞内表达效率的阳离子脂质。式(1)代表的化合物其中Xa和Xb各自独立地是X1或X2；s是1或2，R4是具有1-6个碳原子的烷基，na和nb各自独立地是0或1，R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，且R3a和R3b各自独立地是甾醇残基、脂溶性维生素残基或具有12-22个碳原子的脂肪族烃基。
【专利说明】具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质
【技术领域】
[0001]本发明涉及具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质，含有所述阳离子脂质的脂质膜结构，及其用途。
【背景技术】
[0002]对于核酸治疗的实施，要求有效且安全的核酸递送载体。尽管病毒载体是具有良好表达效率的核酸递送载体，但从安全性的方面来看它们具有实际问题。因此，可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体的开发正在进行中。其中，使用阳离子脂质的载体是目前最通常使用的非病毒核酸递送载体。
[0003]阳离子脂质主要由胺部分和脂质部分构成，其中显示阳离子性的胺部分和聚阴离子核酸静电相互作用以形成带正电的脂质体或脂质膜结构，其促进摄取到细胞内，并将核酸递送到细胞内。
[0004]作为通常并广泛使用的已知阳离子脂质，可以提及DOTAP和D0DAP。这些已知的阳离子脂质当与磷脂组合时形成带正电的脂质体或脂质膜结构，其与核酸静电相互作用，以便能够将核酸递送至靶细胞(非专利文件I)。
[0005]专利文件I描述了含有大量氨基以便增加摄取到细胞内的量的阳离子脂质。该文件争辩认为，该阳离子脂质显示高细胞摄取效力并作用于具有不同细胞膜组成的各种细胞。
[0006]在另一方面，对于使用阳离子脂质以展示体内实际效果的核酸递送载体，良好的体内动力学，特 别是血液中的高稳定性，在靶诸如肿瘤中高度聚集的特性等需要得到满足。鉴于该问题，Wheeler等人显示，含有pKa调节至约中性的阳离子脂质的脂质膜结构在静脉内注射后在血液中显示长寿命，在肿瘤部位中聚集，并且可以介导核酸在肿瘤部位中的表达(非专利文件2)。
[0007]尽管如上所示已经开发了具有改进的体内动力学的阳离子脂质，但是鉴于核酸递送载体通常将外源物质引入细胞内的特性，期望从小摄取量获得大效果输出。也就是说，当脂质膜结构被用作表达载体到细胞内的递送载体时，期望增加每个单位引入细胞内的脂质膜结构的表达水平，并提高细胞内表达效率。为了提高细胞内表达效率，除了体内动力学，有必要也改进细胞内动力学，诸如摄取过程，从内体逃逸等，核膜渗透性等。此外，已知核酸从载体的解离和转录因子的结合能力的增强对于促进细胞内转录是必要的(非专利文件3)。
[0008]促进核酸从脂质膜结构的细胞内解离的实例包括其中一个胺部分和两个脂质部分经由二硫键键合的化合物(专利文件2)和其中一个胺部分和两个脂质部分各自经由二硫键键合的化合物(专利文件3)。描述了这些化合物具有通过利用二硫键的细胞内裂解从脂质膜结构解离与胺部分相互作用的核酸的效果。
[0009]然而，尽管该领域有进展，但通过使用常规阳离子脂质的核酸递送载体实现的细胞内表达效率并不完全令人满意。[0010][文件列表]
[专利文件]
专利文件 I: JP-A-2011-121966 专利文件2: WO 99/58152 专利文件 3: WO 2010/154405 [非专利文件]
非专利文件 1: Biomaterials 29 (24-25): 3477-96，2008
非专利文件 2: Gene Therapy 6:271-281，1999
非专利文件 3: Molecular Therapy 13(4):786-794, 2006。
[0011]发明概述 本发明待解决的问题
鉴于使用阳离子脂质的核酸传递载体将外源物质引入细胞内的特性，要求它们从小摄取量表现出大效果，即增加每个单位引入细胞内的脂质膜结构的表达水平，并提高细胞内表达效率。本发明的一个目的是提供当用作核酸递送载体时能够实现高细胞内表达效率的阳离子脂质。
[0012]解决问题的方式
鉴于上述问题，本发明人已经进行了深入研究并发现，专利文件2的化合物甚至在二硫键裂解之后保持具有两个脂质部分的结构，并且作为结果，所述脂质膜结构在细胞内不会瓦解，并且封装化合物诸如核酸等没有被有效地释放到胞浆内。此外，当专利文件2的化合物用于核酸引入时，核酸被释放到细胞内，同时与胺部分相互作用，这可能阻止转录因子接近并结合至核酸。
[0013]而且，当使用专利文件2和3的化合物时，产生的残基在细胞内裂解二硫键之后被分为胺部分(这是极性基团)和脂质部分(这是非极性基团)，从而失去其表面活性。尽管这种表面活性的消失对于诱导细胞内脂质膜结构的瓦解是有利的，但是它不允许期望内体膜的去稳定化和与其相关的内体逃逸促进效果。
[0014]注意到此类新技术问题，已经进行了进一步研究。作为结果，已经发现，这些问题可以通过以耐受细胞内裂解的稳定结合方式结合胺部分和脂质部分并经由二硫键结合获得的表面活性剂的两个分子，而不是经由二硫键结合胺部分和脂质部分来解决，从而导致完成本发明。
[0015]因此,本发明涵盖以下内容。
[0016][I]式⑴代表的化合物
【权利要求】
1.式⑴代表的化合物
2.根据权利要求1的化合物，其中Xa和Xb各自独立地是X1。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基或具有12 - 22个碳原子的脂肪族烃基。
4.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其中R3a和R3各自独立地是脂溶性维生素残基。
5.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其中R3a和R3b各自独立地是具有12- 22个碳原子的脂肪族烃基。
6.包含根据权利要求1-5中任一项的化合物作为膜构成脂质的脂质膜结构。
7.用于引入核酸的试剂，其包含根据权利要求1-5中任一项的化合物或根据权利要求6的脂质膜结构。
8.将核酸引入细胞内的方法，其包括使封装所述核酸的根据权利要求6的脂质膜结构与细胞接触。
9.将核酸引入细胞内的方法，其包括将封装所述核酸的根据权利要求6的脂质膜结构给药于活生物体，从 而使得其被递送至靶细胞。
【文档编号】A61K48/00GK103930398SQ201280056417
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月18日
【发明者】丹下耕太, 新井将也, 久保和弘, 秋田英万, 原岛秀吉, 畠山浩人, 石破谅平, 鹈川真实, 田中浩挥 申请人:日油株式会社, 国立大学法人北海道大学