治疗和预防眼疾病的方法

治疗和预防眼疾病的方法
【专利摘要】本发明提供了可用于通过CCR3的抑制而治疗和预防新血管AMD的组合物和方法。所述组合物和方法可用于治疗和预防包括但不限于新血管AMD的疾病和障碍。
【专利说明】治疗和预防眼疾病的方法

【技术领域】
[0001] 本发明大体上涉及将能够抑制CCR3或VEGF的表达和/或活性的试剂和VEGF信 号抑制剂单独地或组合地用于治疗和/或预防眼疾病例如继发于干（萎缩性）黄斑变性的 血管新生性老年性黄斑变性等眼疾病的方法。

【背景技术】
[0002] 血管新生也被称为血管生成，是形成新的血管的过程。血管新生在正常发育期间 发生，并且还在组织受伤之后的伤口愈合中起重要作用。然而，血管新生也被认为是许多病 理学状态包括例如癌症、类风湿性关节炎、动脉硬化、银屑病和眼的疾病包括糖尿病性视网 膜病、糖尿病性黄斑水肿、和血管新生AMD的重要原因。在发达国家中，与血管渗漏和/或 血管新生相关的眼疾病是绝大多数视觉发病率和失明的原因 （Campochiaro (2004)Expert Opin. Bioi. Ther. 4:1395-402)。与眼部血管新生和血管渗透性增加相关的眼疾是视力减弱 和失明的主要原因。
[0003] 在发达国家中，老年性黄斑变性（AMD)是失明的主要原因。AMD有两种主要的临 床表现：萎缩性（干性AMD)和湿性AMD。萎缩性AMD的特征在于视网膜色素上皮（RPE)和 视神经视网膜的变性。萎缩性AMD的早期阶段与RPE细胞层下的玻璃疣的形成有关。早期 萎缩性AMD可以发展成为末期疾病，其中RPE完全变性并且在黄斑区域中形成明显分界的 RPE萎缩区域："地图样萎缩"。在此疾病形式中，RPE的变性导致黄斑的光感受器的继发性 死亡，并且在这些情况中导致严重的视力减弱。
[0004] 患有干性或地图样萎缩AMD的AMD患者中的约10-20%发生继发的脉络膜血管新 生（CNV)。此疾病形式被称为"湿AMD"且可以与一些最严重的视力减弱相联系。在湿AMD 中，新的脉络膜血管（新血管）在脉络膜中增殖或可以贯穿Bruch膜并增殖进入RPE和视 神经视网膜并在其下增殖（参见例如Campochiaro et al. (1999)Mol. Vis. 5:34)。在典型 的情况中，萎缩性AMD在湿形式发生之前就在眼中发生，然而，在罕见的偶然情况中，新血 管或湿形式可以在没有发生先前的萎缩性形式的情况下发生。在该疾病的两种形式中，均 由于感光细胞的死亡而发生视力减弱，但在湿性AMD中，在CNV期间形成的AMD流体渗漏和 偶然发生的来自渗漏血管的内部出血（血管渗透性增加）也导致视力减弱。
[0005] 对于AMD，已成功开发出新的治疗以解决湿AMD的一些方面，特别是由抑制血管内 皮生长因子（VEGF)或VEGF受体信号转导途径的各种分子导致的自CNV的渗漏血管出血减 少。
[0006] 趋化因子为涉及白细胞的运输和募集的一大类小蛋白质（综述参见Luster, New Eng. J. Med.，338, 436-445(1998))。它们由一大类细胞释放并且起吸引和活化包括嗜酸性 粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞的各种细胞类型的作用。根 据与趋化因子蛋白的氨基末端邻近的两个保守的半胱氨酸残基的间距分类，有两类主要的 趋化因子，即CXC_(a )和(Χ_(β)趋化因子。
[0007] 趋化因子与属于G-蛋白偶联的七种跨膜-域蛋白家族的特异性细胞表面受体结 合（综述参见Luster，1998)。除其他反应以外，趋化因子受体的活化导致细胞间钙增加、细 胞形状变化、细胞粘附分子的表达增加、脱粒和促进细胞迁移（趋化作用）。
[0008] 迄今为止，CC趋化因子受体的9个成员已被识别（CCR-1至9)。对于本发明特别 重要的是CC-趋化因子受体-3 (CCR-3)，其主要在嗜酸性粒细胞上表达，并且也在嗜碱性粒 细胞、肥大细胞和Th2细胞上表达（Luster，1998)。已知在CCR-3处起作用的趋化因子例如 RANTES、MCP-3和MCP-4募集和活化嗜酸性粒细胞。
[0009] 先前已显示人微血管内皮细胞表达CCR3 (Salcedo等，2001)且在CCR3受体处活 性的激动剂能够起血管内皮的趋化剂的作用。通过在鸡胚绒毛尿囊膜和主动脉环两者中的 血管内皮细胞上的此趋化作用，此过程能够促进血管的血管生成（Salcedo等，2001)。
[0010] 这些发现随后被扩展至AMD中的研究（Takeda等，2009)，其证明抗CCR3抗体、抗 CCR3激动剂抗体、或CCR3的药理学抑制剂的玻璃体内注射有效限制小鼠中激光诱导后的 CNV程度。在接受激光的在CCR3或特异性CCR3激动剂基因中具有纯合基因缺陷的小鼠中 确认了这些数据。其他数据还显示在CNV的激光诱导之后CCR3激动剂CCL11和CCL24被 诱导（Takeda 等，2009)。
[0011] 将这些研究扩展至在嗜酸性粒细胞或肥大细胞（与CCR3的表达关系最密切的细 胞）的产生方面有缺陷的小鼠中，证明这些小鼠保持响应激光光凝固术产生CNV的能力并 且在阻断此疾病中仍然对于玻璃体内的CCR3拮抗敏感。
[0012] 所述研究强烈地暗示在限制激光诱导的CNV生成中CCR3的作用机制不是通过对 于体嗜酸性粒细胞或肥大细胞的作用。玻璃体内的抗CCR3治疗曾被用于控制这些模型中 的疾病这一事实也支持在眼中的更多局部的作用。研究还暗示抗CCR3治疗不限制巨噬细 胞或中性粒细胞募集进入激光诱导的CNV损伤（Takeda等，2009)。
[0013] 目前已有若干额外的独立的研究确认了 CNV AMD小鼠模型中的这些发现；特别 地，在激光有道德CNV AMD模型中口服给药YM-344031是有效的（Mizutani等，2011)。然 而，尽管抗VEGF治疗在此模型中是有效的，但当将CCR3拮抗剂给药至视网膜下的空间时， 这样的试剂似乎不能限制由共同给药基质胶诱导的血管生成（Li等，2010)。
[0014] 在其他研究中，使用抗CCR3抗体的CCR3中合作用不改变响应激光而在眼中生成 的VEGF的量，暗示CCR3和VEGF在控制CNV AMD中的作用可能是独立的。相似地，中和抗 VEGF mAb的玻璃体内注射对于内皮细胞上存在的CCR3的表达没有作用，进一步支持在啮 齿动物中在控制CNV中的此独立作用的假设（Takeda等，2009)。
[0015] 检查角膜病理性血管生成的研究也发现损伤/前列腺素 E2诱导的血管生成与 VEGF无关，但与嗜酸性粒细胞趋化因子有关，再次暗示在控制血管生成中嗜酸性粒细胞趋 化因子/CCR3轴可以为与VEGF无关的机制（Liclican等，2010)。
[0016] 通常认为抗VEGF治疗在人类和动物模型中均通过降低已进入视网膜的新形成的 脉络膜血管的血管渗透性而控制CNV，而不是直接作用于血管新生。研究也已暗示在人冠状 动脉内皮细胞的培养物中，体外培养物的渗透性可以通过CCR3(嗜酸性粒细胞趋化因子） 的激动剂而增加（Jamaluddin等，2009)，显示CCR3拮抗作用通常影响眼部血管的血管渗透 性的可能性。
[0017] Takeda等，2009的初始研究显示CCR3在人CNV视网膜中表达但不在仅有萎缩 性AMD的视网膜中表达，没有发展成为CNV疾病的临床证据。表达用脉络膜脉管系统的 标志物⑶31 (PECAM-1)共同定位，且对于CNV AMD中的血管的特异性通过在视网膜纤维 化和黑素瘤两者中均不存在染色而确认（Takeda等，2009)。在手术切除的人脉络膜新血 管AMD组织中，天然CCR3激动剂嗜酸性粒细胞趋化因子-1 (CCL11)、嗜酸性粒细胞趋化因 子-2 (CCL24)和嗜酸性粒细胞趋化因子-3 (CCL26)也均被发现在间质中表达并且与血管共 同定位（Takeda等，2009)。在与小鼠模型相似的模型中，迄今为止没有嗜酸性粒细胞或肥 大细胞与人AMD相关的证据，且实际上在人CNV AMD损伤中定位这些细胞的尝试仍未获得 任何显著的发现（Takeda等，2009)。此外，嗜酸性粒细胞趋化因子被确认为人AMD的可能 的血清生物标志物（Mo等，2010)，其中发现其与I型和II型AREDS患者和萎缩性AMD显著 地相关（P〈_〇. 02-p〈0. 005)，但有趣的是与CNV AMD无关，但相同研究中的尸体解剖人眼的 检验暗示与早期AMD、萎缩性AMD和CNVAMD的关系，最强的染色与CNV AMD中的血管新生内 皮相关。在获自早产患者的视网膜病变的玻璃体样品的比较中，相对于血管惰性的疾病，还 发现嗜酸性粒细胞趋化因子与血管活性疾病显著相关，暗示CCR3可能参与促进视网膜循 环中的血管生成（Sato等，2009)。
[0018] 因此，先前已证明AMD机械地发展自两个不同的且不相关的途径：血管生成和血 管渗透性。已显示AMD可以使用抗VEGF抑制剂治疗（W02007/064752)。已显示使用CCR3 拮抗剂的玻璃体内治疗可以影响CNV损伤的大小（Takeda等，2009)。
[0019] 出人意料地， 申请人:已发现，与由异位的视网膜VEGF生成诱导的或由高压氧处理 诱导的新视网膜血管不同，CCR3拮抗作用对于特异性地降低脉络膜新血管的血管渗透性和 血管生成具有作用，并因此可用于特异性地治疗/预防（包括减慢疾病和/或其症状的发 展）与血管新生AMD相关的脉络膜血管渗透性。
[0020] 申请人:还已发现，阻断疾病的血管生成途径和渗透性途径两者在体内产生功能响 应。因此，用抗VEGF抑制剂和CCR3抑制剂的组合治疗对于新血管AMD是有效的组合治疗 和/或预防，其中两种试剂均能独立地影响损伤生长和血管渗透性并产生额外的作用。
[0021] 仍需要治疗眼部血管新生障碍特别是血管新生AMD的新方法。本发明涉及这样的 方法。


【发明内容】

[0022] 本发明涉及通过CCR3的抑制例如CCR3蛋白的表达和/或活性的抑制治疗和/或 预防眼疾病和障碍的方法。在具体的实施方案中，能够通过本发明的方法治疗和/或预防 的眼疾病与血管新生和血管渗透性增加有关。具体而言，这样的疾病包括例如但不限于老 年性黄斑变性等。
[0023] 在一个实施方案中，此处中公开的方法包括：向需要治疗和/或预防眼疾病的对 象给药包含抑制CCR3的试剂例如抑制CCR3的表达和/或CCR3蛋白的活性的试剂的药物 组合物。并非意图将本发明限于疾病的任何具体的阶段（例如早期或晚期）。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供了通过阻断CCR3活化的相关的酶活性和所有的 下游效应器而抑制CCR3的方法。
[0025] 在一些实施方案中，脉络膜新血管渗透性的预防和/或降低导致对与新血管AMD 相关的症状的预防和/或降低（即防止疾病的进展）。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防患有AMD或具有患AMD的风 险的对象中的AMD的方法，包括向对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试 剂的药物组合物，其中CCR3蛋白的抑制降低AMD的进展或使AMD的症状停止。
[0027] 在另一个实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防患有AMD或具有患AMD的风 险的对象的方法，包括向对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物 组合物，且另外与所述试剂组合给药抗VEGF抑制剂或VEGF信号抑制剂，其中CCR3蛋白的 抑制降低AMD的进展或使AMD的症状停止。
[0028] 在另一个实施方案中，本发明提供了预防患有干AMD或地图样萎缩AMD的对象中 的萎缩视网膜背景上的CNV损伤的发展的方法，包括向对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的 活性和/或表达的试剂的药物组合物，其中CCR3蛋白的抑制预防这样的损伤的发展，所述 试剂可以单独给药或与抗VEGF抑制剂组合给药。
[0029] 在另一个实施方案中，本发明提供了预防萎缩性和非血管性AMD转化/进展为新 血管AMD的方法，包括向对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物 组合物，其中对CCR3蛋白的抑制阻止了这样的向新血管AMD的转化，所述试剂可以单独给 药或与抗VEGF抑制剂组合给药。
[0030] 在一些实施方案中，抑制CCR3的试剂能够抑制CCR3的表达，例如抑制CCR3RNA的 翻译以产生CCR3蛋白。在可选的实施方案中，抑制CCR3的试剂能够抑制CCR3蛋白活性。 对于此处所公开的方法中的应用，涵盖任何试剂。在一些实施方案中，实际可以为小分子、 核酸、核酸类似物、蛋白、抗体、肽、适配体或其变体或片段。在一些实施方案中，试剂为核酸 试剂例如RNAi试剂，例如siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶或其变体。
[0031] 在一些实施方案中，抑制CCR3蛋白活性的试剂为小分子，例如但不限于CCR3 蛋白的小分子可逆抑制剂或不可逆抑制剂。在一些实施方案中，这样的小分子为基于 吗啉-乙酰胺的化合物。在一些实施方案中，CCR3的小分子抑制剂为例如但不限于 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-吗啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐（CCR3抑制剂'994)。参见美国专利第7, 157, 457号 和第 7, 531，651 号。
[0032] 在另一个实施方案中，这样的小分子为基于吗啉脲的化合物。在一些实施方案 中，（〇3的小分子抑制剂为例如但不限于^[[(25)-4-[(3,4-二氟苯基）甲基]-2-吗啉 基]-甲基]-3_[(甲基磺酰基）氨基]-苯乙酰胺或其药学上可接受的盐（CCR3抑制剂 '575)。参见美国专利第7, 101，882号。
[0033] 在一些实施方案中，当对象被给药包含CCR3的抑制剂的药物组合物时，所述方法 还可以包括向对象给药额外的治疗剂，例如但不限于包括AMD的眼疾病的治疗中使用的治 疗剂等。应理解，用于治疗眼部疾病的治疗剂的给药可以涉及某些手术的施用，例如但不 限于视网膜聚焦激光光凝固术、全视网膜光凝固术、玻璃体内给药的留类例如去炎松、玻璃 体内给药的包含氟轻松的甾类植入物、和玻璃体内给药的抗VEGF治疗剂例如帕唑帕尼、 Lucentis?、Avastin?、和 Afiibercept?。
[0034] 在一些实施方案中，如此处公开的用于新血管眼疾病或障碍的治疗和/或预防的 方法可施用于对象例如哺乳动物对象。在一些实施方案中，给药抑制CCR3蛋白的活性或表 达的试剂的对象为人类。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 图1显示用GW766994进行系统地治疗后通过荧光血管造影获得的C57B16小 鼠中的CNV组定量。上方的图显示每眼的平均CNV损伤大小及相应的95%置信限。下 方的图显示眼底检查图像的实例，在CNV的激光诱导后1周和2周时用CCR3拮抗剂 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-吗啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲酰胺（CCR3抑制剂'994) (2-30mg/kg QD 口服）和谱选择性激酶抑制剂帕唑帕尼 (5-[[4-[ (2, 3-二甲基-2h-吲唑-6-基）甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰 胺）（20mg/kg QD 口服）治疗小鼠后通过小鼠视网膜的直接荧光血管造影测定。
[0036] 图2显示057816小鼠中平均0爪^组定量及相应的95%置信限，是在0爪^的激光诱 导后1周和2周时用CCR3抑制剂'994(8-30mg/kg QD和8mg/kg BID 口服）和谱选择性激 酶抑制剂帕唑帕尼（pazopanib，20mg/kg QD 口服）治疗小鼠后通过突光血管造影测定。
[0037] 图3显示JR5558小鼠中平均CNV组定量，是在用CCR3抑制剂'994进行系统地治 疗后通过荧光血管造影测定。上方的图显示每眼的平均总CNV损伤面积及相应的95%置信 限。中间的图显示每眼的CNV损伤总数及相应的95%置信限，下方的图显示用CCR3抑制 剂'994(2-30mg/kg QD)治疗小鼠后小鼠视网膜的直接荧光血管造影。在P14和P26之间 给药化合物12天。
[0038] 图4显示用8mg/kg CCR3抑制剂'994BID系统性治疗后通过荧光血管造影测定的 在JR5558mice小鼠中的CNV的组定量。上方的图显示每眼的平均CNV损伤总面积及相应 的95%置信限。中间的图显示每眼的CNV损伤总数及相应的95%置信限，下方的图显示用 CCR3抑制剂'994(8mg/kg BID)治疗小鼠后小鼠视网膜的直接荧光血管造影。在P14和P26 之间将化合物给药12天。
[0039] 图5显示用CCR3抑制剂'994 (8-30mg/kg QD)治疗小鼠之后JR5558的脉络膜（移 除视网膜）中血管CNV的组织化学检测，使用同工凝集素 Μ染色。在P14和P26之间给药 化合物12天。
[0040] 图6显示用CCR3抑制剂'994 (8-30mg/kg QD)治疗小鼠之后JR5558的脉络膜（移 除视网膜）中血管CNV的组织化学检测，使用同工凝集素 Μ染色。在P14和P26之间将化 合物给药12天。
[0041] 图7显示使用5ul l-10mg/ml CCR3抑制剂'994BID给药至双眼进行局部治疗，通 过荧光血管造影测定的JR5558小鼠中的CNV的组定量，并与系统性给药8mg/kg CCR3抑制 剂'994腹腔注射BID相比较。上方的图显示每眼的平均CNV损伤总面积及相应的95%置 信限。下方的图显示用CCR3抑制剂'994局部施用或系统性施用（8mg/kg腹腔注射BID) 治疗小鼠之后每视网膜的CNV损伤总数及相应的95%置信限。在P14和P26之间将化合物 给药12天。
[0042] 图8显示在用运载体、100ug抗-VEGFR2腹腔注射QD、30mg/kg CCR3抑制剂'994 腹腔注射QD、lOOug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg CCR3抑制剂'994腹腔注射QD和 50ug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg CCR3抑制剂'994腹腔注射QD的任一种系统性 给药之后通过荧光血管造影测定的JR5558小鼠中的CNV的组定量。上方的图显示每视网 膜的CNV损伤总面积及相应的95%置信限。下方的图显示每视网膜的CNV损伤总数及相 应的95%置信限。在P14和P26之间给药CCR3抑制剂'994,持续12天。自P14起给药 抗-VEGFR2,持续6天，且自P19起再给药5天。
[0043] 图9显示在用运载体、100ug抗-VEGFR2腹腔注射QD、30mg/kg CCR3抑制剂'994 腹腔注射QD、或lOOug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg GW766994腹腔注射QD任一种系 统性给药之后通过荧光血管造影测定的JR5558小鼠中单个CNV损伤的血管渗透性的组定 量。在P24和P26之间将CCR3抑制剂'994和抗-VEGR2以及各种组合给药2天。
[0044] 图10显示在通过激光光凝固术诱导CNV之后猕猴个体的右眼和左眼中IV级损 伤的分析，在激光前1天顺序地给药运载体，20mg/kg GW782415X ((S)-1-((4-(3, 4-二氯苄 基）吗啉-2-基）甲基）-3-((2-甲基-2H-四唑-5-基）甲基）脲）（以下称为"'415化 合物"）口服TID或3mg/kg TID 口服，持续16、24、或30天。
[0045] 图11显示猕猴全血中嗜酸性粒细胞趋化因子-1对嗜酸性粒细胞形状变化的浓 度响应曲线，1〇ηΜ和ΙΟΟηΜ '415化合物的预温育的作用示于附录1中。Schild分析确定 '415化合物对于猕猴全血中嗜酸性粒细胞趋化因子-1刺激的嗜酸性粒细胞形状变化的平 均PA2值为7. 8。
[0046] 图12显示将C57B16小鼠暴露于高压氧（氧诱导的视网膜病变模型）之后，视网 膜血管生成（血管新生）的组定量的作用和8mg/kg腹腔注射BID的作用。
[0047] 图13显示将C57B16小鼠暴露于高压氧（氧诱导的视网膜病变模型）之后，视网 膜血管生成（血管新生）的组定量的作用，以及l〇mg/ml局部给药和SU4312 (5ug每5天， 眼周）给药至一只眼BID的作用。

【具体实施方式】
[0048] 发明人已发现CCR3抑制剂可以被用于眼部疾病特别是与新血管AMD相关的血管 渗透性的治疗和/或预防，包括进展。
[0049] 发明人已发现CCR3抑制剂可以与抗VEGF治疗剂和VEGF信号抑制剂组合使用用 于眼部疾病特别是与AMD相关的血管渗透性的治疗和/或预防，包括进展。
[0050] 发明人还已发现CCR3抑制剂与抗VEGF抑制剂的组合可以特别地用于眼部疾病特 别是与AMD相关的脉络膜血管新生的治疗和/或预防，包括进展。由于CCR3抑制剂的相似 的作用在经历暴露于高压氧之后的血管新生（氧诱导的视网膜病变）的视网膜血管上不能 被证明，因此这些作用看起来是对脉络膜特异性的。
[0051] 发明人已发现CCR3抑制剂可以用于萎缩视网膜背景例如患有与干萎缩或地图样 萎缩相关的AMD的患者中的眼部疾病特别是脉络膜血管新生的治疗和/或预防，包括进展。
[0052] 发明人已发现CCR3抑制剂可以与抗VEGF治疗剂和VEGF信号抑制剂组合用于萎 缩视网膜背景例如患有与干萎缩或地图样萎缩相关的AMD的患者中的眼部疾病特别是脉 络膜血管新生的治疗和/或预防，包括进展。
[0053] 定义
[0054] 为了方便起见，此处收集整个申请（包括说明书、实施例、和所附的权利要求）中 使用的某些术语。除非另有定义，否则此处使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所 属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0055] 术语"疾病"或"障碍"此处可以互换地使用，指身体或一些器官的状态的任何 变化，打断或扰乱功能的执行和/或导致患病的人或与之接触者诸如不适、机能障碍、痛 苦或甚至死亡等症状。疾病或障碍也可以涉及犬癌热（distemper)、生病（ailing)、微 恙（ailment)、重疾（malady)、障碍（disorder)、疾恙（sickness)、病痛（illness)、病 (complaint)、或感染（affectation) 〇
[0056] 术语"脉络膜血管渗透性"或"可渗透的血管"通常被本领域技术人员称为"渗漏 血管"。所述术语在此处中互换地使用以指脉络膜脉管系统受损和血管渗透性增加。
[0057] 术语"试剂"指通常不存在于细胞中或不以给药的水平存在于细胞中的任何实体。 试剂可以选自包含以下的组：化学品；小分子；核酸序列；核酸类似物；蛋白；肽；适配体； 抗体；或其片段。核酸序列可以为RNA或DNA，并且可以为单链的或双链的，并且可以选地包 含以下的组：编码感兴趣的蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸类似物例如肽-核酸（PNA)、假互补 PNA(pc-PNA)、锁核酸（LNA)等。这样的核酸序列包括例如但不限于编码蛋白的核酸序列例 如起转录抑制因子、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、 微RNAi (mRNAi)、反义寡核苷酸等的那些。蛋白和/或肽或其片段可以为任何感兴趣的蛋 白，例如但不限于：突变蛋白；治疗性蛋白和截短蛋白，其中所述蛋白通常不存在于细胞中 或在细胞中以较低的水平表达。蛋白也可以选自包含以下的组：突变蛋白、基因工程蛋白、 肽、合成肽、重组体蛋白、嵌合蛋白、抗体、中型抗体、微型抗体、三链抗体、人源化蛋白、人源 化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段。可选地，由于将核酸序列引入细胞中及其导致在细 胞中产生CCR3的核酸和/或蛋白抑制剂的转录，所述试剂在细胞中可以为细胞内的。在一 些实施方案中，所述试剂为任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的非 蛋白质的实体。在某些实施方案中，所述试剂为具有化学部分的小分子。例如，包括未取代 的或取代的烷基、芳香的、或杂环基部分的化学部分，包括大环内酯、轻肌蛋白及其相关的 天然产物或类似物。可以已知试剂具有期望的活性和/或性质，或可以选自一类不同的化 合物。
[0058] 此处使用的术语"抑制"指CCR3蛋白或其变体或同源物的表达或活性被降低至足 以产生期望的作用的一定程度和/或一段时间，例如其中CCR3蛋白的抑制降低或停止血管 渗透性和/或脉络膜血管新生等的症状。活性的降低可以是由于影响CCR3的一个或多个 特征，包括降低其催化活性或通过抑制CCR3的辅因子或通过与CCR3结合，活性的程度使得 结果是治疗或预防眼部障碍。具体而言，CCR3的抑制可以使用用于CCR3抑制的分析测定， 例如但不限于通过使用如此处所公开的用于CCR3蛋白的生物学分析。
[0059] 术语"患者"、"对象"和"个体"在此处可以互换地使用，并且指被提供治疗（包括 预防性治疗）的动物，特别是人。此处使用的术语"对象"指人和非人动物。术语"非人动 物"和"非人哺乳动物"在此处可以互换地使用，包括脊椎动物例如哺乳动物例如非人灵长 类（特别是高级灵长类）、绵羊、狗、啮齿动物（例如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、奶 牛，和非哺乳动物例如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，对象为人。在另一个 实施方案中，对象为实验动物或作为疾病模型的动物替代物。
[0060] 此处使用的术语"治疗"包括降低、缓解或预防（包括预防进展）与AMD相关的病 症、疾病或障碍的至少一种不利作用或症状。预防与AMD相关的病症、疾病或障碍的至少一 种不利作用或症状的进展包括但不限于预防具有发展脉络膜血管新生和/或随后的脉络 膜血管渗透性增加的对象中的萎缩视网膜背景上的CNV损伤的发展；和/或预防萎缩性和 非血管AMD转化成为新血管AMD。用于测量治疗的几集结果的方法包括但不限于通过光学 相干层析成像测量的视网膜下的水肿的减少或保持、视力减弱的减少或保持、或通过最佳 矫正视敏度评价的视力获得。血管渗透性增加和脉络膜血管新生也通过荧光眼底血管造影 测定。
[0061] 此处使用的术语"有效量"指降低、停止或预防至少一种疾病的症状或障碍例如 AMD的症状或障碍的药物组合物的治疗剂的量。例如，使用此处公开的方法的有效量应被认 为是足以降低或预防疾病或障碍的症状的量，例如AMD的完全或部分解决和/或保持（通 过0CT测量）或大于5个字母的最佳矫正视敏度的增加和/或保持（通过EDTRS视力表评 价）、或新血管的大小或血管渗透性降低（通过荧光眼底血管造影测定）。此处使用的有效 量还应包括足以预防或延迟黄斑水肿的发展、渗透性增强、CNV损伤的大小和相关的视力减 弱的量。此处使用的有效量还应包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病症状的 过程（例如但不限于减缓疾病的症状的进展）、或逆转疾病的症状的量。
[0062] 此处使用的术语预防或防止具有发展脉络膜血管新生和/或随后的脉络膜血管 渗透性增加的"风险的对象"中的CNV损伤的发展指例如患有干或地图样萎缩AMD的患者。 [0063] 此处使用的术语"给药"和"引入"互换地使用，指通过导致试剂在期望的位点至 少部分定位的方法或途经将如此处公开的抑制CCR3的试剂置于对象中。本发明的化合物 可以通过在对象中导致有效治疗的任何适合的途径给药。
[0064] 此处使用的冠词"一"指一个或指多于一个（即至少一个）冠词的语法上的主语。 以举例的方式，"一元素"指一个元素或多于一个元素。
[0065] 抑制CCR3的试剂
[0066] 在一些实施方案中，本发明涉及CCR3的抑制。在一些实施方案中，抑制为对编码 CCR3的核酸转录物的抑制，例如对信使RNA(mRNA)的抑制。在可选的实施方案中，CCR3的 抑制为对CCR3的基因产物例如CCR3的多肽或蛋白或其同工型的表达的抑制和/或活性的 抑制。此处使用的术语"基因产物"指由基因转录的RNA或由基因编码或由RNA翻译的多 肽。
[0067] 在一些实施方案中，通过试剂抑制CCR3。人们可以使用任何试剂，例如但不限于核 酸、核酸类似物、肽、噬菌体、噬粒、多肽、类肽物、核糖体、适配体、抗体、小的或大的有机或 无机分子，或其任意组合。在一些实施方案中，可用于本发明的方法中的试剂包括起CCR3 表达的抑制剂作用的试剂，例如编码CCR3的mRNA的抑制剂。
[0068] 可用于此处公开的方法中作为CCR3抑制剂的其他试剂可以为化学品、小分子、大 分子、或实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白实体。在某些实施方案中， 试剂为具有如此处公开的化学部分的小分子。
[0069] 小分子
[0070] 在一些实施方案中，抑制CCR3的试剂为小分子。在本发明的方法中可以使用CCR3 的不可逆抑制剂或可逆抑制剂。
[0071] 在人类中有效的CCR3抑制剂为本领域技术人员公知的，并且包括经历评价的 那些，例如经历临床前评价和临床评价，包括第二阶段临床测试。SmithKline Beecham 及其继任者GlaxoSmithKline已提交和公开了若干申请。CCR3的不可逆抑制剂已于TO 2002/26723A1、W003/082293、美国申请第 7, 101，882 号、第 7, 157, 457 号、第 7, 531，651 号 和第7, 560, 548号中公开，其全文具体地援引加入本文，并且其中公开了为CCR3抑制剂的 不同系列的吗啉-乙酰胺和吗啉脲化合物。
[0072] 在人类中有效的VEGF治疗剂为本领域技术人员公知的，并且包括经历评价的那 些，例如经历临床前评价和临床评价，包括第二阶段临床测试，和/或在售的那些，包括帕 唑帕尼、Lucentis?、Avastin?、和 Afiibercept?。
[0073] 化合物4-[[[[[[(28)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-吗啉基]甲基]-氨基]羰 基]-氨基]甲基]苯甲酰胺（CCR3抑制剂'994)或其药学上可接受的盐或溶剂合物为特 别有效的CCR3抑制剂，且可特别地用于此发明。
[0074] 化合物^[[(25)-4-[(3,4-二氟苯基）甲基]-2-吗啉基]-甲基]-3_[(甲基磺 酰基）氨基]-苯乙酰胺（CCR3抑制剂'575)或其药学上可接受的盐或溶剂合物为特别有 效的CCR3抑制剂，且可特别地用于此发明。
[0075] 可用于此处公开的方法中的其它CCR3抑制剂描述于已公开的专利和申请TO 2002/26723A1、W003/082293、美国专利第 7, 101，882 号、第 7, 157, 457 号、第 7, 531，651 号 和第7, 560, 548号中，并且可以使用此处公开的CCR3抑制分析发现。
[0076] 上述段落中列举的所有申请都援引加入本文。相信这些文献中公开的任何或所有 化合物都可用于AMD的预防或治疗。如实施例中列举的此处描述的模型可被本领域技术人 员使用以确定何种所公开的化合物或CCR3的其他抑制剂例如抗体或RNAi可有效地治疗和 预防此处主张的眼部疾病或障碍。
[0077] 实施例
[0078] 此处所示的实施例涉及通过CCR3抑制用于眼部新血管障碍等的预防和/或治疗 的方法和组合物。在整个此申请中引用了多个公开。全部这些公开和这些公开中引用的那 些参考文献的公开全文援引加入本文，以更完全地描述本发明所述的【技术领域】的状态。以 下实施例并非意图将权利要求的范围限于本发明，而是意图例举某些实施方案。本领域技 术人员想到的示例的方法的任何变体都意图落入本发明的范围内。
[0079] 在一些实施方案中，可以在此处公开的动物模型中评价抑制CCR3的试剂在降低 激光诱导的CNV中的作用。
[0080] 在一些实施方案中，可以在此处公开的动物模型中评价抑制CCR3的试剂，例如猕 猴中的激光诱导的脉络膜新血管AMD研究。
[0081] 在一些实施方案中，可以在动物模型中评价单独的抑制CCR3的试剂或其与抗 VEGF抑制剂的组合，例如在CNV AMD的JR5558猕猴模型中限制CNV的发展。
[0082] 实施例1
[0083] 方法
[0084] C57/BL6小鼠中激光诱导的CNV
[0085] 将成年的12周龄雌性C57BL/6小鼠用于产生激光诱导的CNV模型。通过腹膜内 盐酸氯胺酮（25mg/kg)和赛拉嗪（10mg/kg)将小鼠麻醉，并通过局部托批卡胺（1% )使其 瞳孔扩张。在直视下使用二极管激光器^80nm ;210mW功率、100ms持续时间、100m光斑直 径）进行激光光凝固术，使用手持盖玻片作为接触镜并定位至双眼中的视网膜的后极的2 点、10点和6点钟位置。这些激光设置持续地产生视网膜下的气泡，其与Bruch膜的激光 诱导的破裂和CNV的成功诱导密切相关。仅将其中形成气泡的损伤包括入分析中。在诱导 CNV后1周和2周时使用Kowa Genesis小动物眼底照相机进行突光素血管造影。通过数 字图像分析早期（荧光素注射后90秒）期间每损伤的强荧光的平均面积来对CNV损伤的 大小进行定量。通过局部托吡卡胺1%使瞳孔扩张，通过腹膜内注射给药〇. 2ml荧光素钠 (2% )。如果眼有能够影响激光能量输送或血管造影的显著的白内障或角膜病变，则将其排 除在外。
[0086] TR5558CNV 和分析
[0087] JR5558小鼠自发产生CNV (在萎缩背景中），在出生后约12天时CNV损伤第一次出 现。由P14开始，用不同量的大鼠抗小鼠 VEGF受体（VEGFR)-2阻断抗体（MAB4431 ;R&D系 统）或纯化的大鼠未免疫同型匹配对照IgG2a抗体（R&D系统）腹膜内处理JR5558小鼠， 在11天内总计10次给药，并于P25进行最后一次给药之24小时后通过荧光素血管造影术 (FA)分析CNV进展。对于用CCR3抑制剂'994处理的小鼠，自P14开始，通过腹膜内或通过 滴眼剂对其给药不同浓度的所述药物，持续总计12天，并且在P26时最后一次给药之24小 时后，通过FA分析CNV进展。为了研究抗-VEGFR2抗体和CCR3抑制剂'994的组合作用， 自P14起，用各物质单独地或组合地腹膜内处理小鼠，在11天内总计10次给药，于P25进 行最后一次给药的24小时后通过FA分析CNV进展。进行多个实验来研究VEGF-A和CCR3 拮抗剂对现有CNV损伤所致的血管渗透性的影响，所用的JR5558小鼠在发生CNV损伤后仅 给药两天，并且是用不同量的VEGFR-2抗体或CCR3抑制剂'994或其组合在P24和P25时 处理。在P26进行荧光素血管造影术（FA)。
[0088] 荧光素血管诰影术（FA)和图像分析
[0089] 使用2.5(%托批卡胺0^118(311&]^〇1]113，1?〇(31168七61'，附）使小鼠的瞳孔扩张并通过腹 膜内注射给药0. 2ml于水中稀释的突光素钠（Bausch&Lomb) oKowa Genesis-Df眼底照相机 (Kowa, Tokyo, Japan)用于获得染料运输的早期（突光素注射后90秒）和晚期（7分钟）时 的荧光素血管造影图。在早期时，CNV组织的脉管系统明显地由血管内的荧光素染料界定。 在晚期时，明显有高荧光斑点形式的血管外荧光素。为了定量CNV面积，使用早期FA图像 经Image J程序确定各眼中各个高荧光CNV的大小。用Image J从晚期（荧光素注射后7 分钟）FA图像的高荧光面积减去早期（荧光素注射后90秒）FA图像的高荧光面积，来确定 各CNV的渗透性。
[0090] CNV损伤的视网腊全封固染色
[0091] FA后24小时时摘除眼球，并在4°C下用4%多聚甲醛（PFA)在PBS中的溶液固定3 小时。将移除了视网膜或未移除视网膜的眼杯解剖，在室温下在含0.3% Triton X-100和 5% FBS的PBS缓冲液（封闭缓冲液）中封闭1小时，并在4°C下用在封闭缓冲液中1:200 稀释的0.5%突光素异硫氰酸酯$11'〇-同工凝集素134(￥6(31:〇1'，13111'1;[叩31116,04)温育整 夜。洗涤5次之后，用含DAPI的介质将样本封固，并使用落射荧光显微镜观察。
[0092] 猕猴中的激光诱导的脒络腊新血管AMD研究
[0093] 如表A中所示对猕猴给药运载体或CCR3拮抗剂工具化合物' 415化合物，持续29 天，在激光光凝固术之1天后出现激光。在激光后14、21和28天时进行荧光血管造影术分 析。
[0094]

【权利要求】
1. 治疗和/或预防对象中与血管新生相关的眼部障碍或疾病的方法，所述方法包括： 识别患有与血管新生相关的眼部疾病或障碍或具有发展与血管新生相关的眼部疾病 或障碍的风险的对象，和 向有需要的对象给药包含用于抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述眼部疾病或障碍为新血管AMD。
3. 治疗和/或预防对象中与脉络膜血管渗透性增加相关的眼部障碍或疾病的方法，所 述方法包括： 识别患有与脉络膜血管渗透性增加相关的新血管AMD或障碍或具有发展与脉络膜血 管渗透性增加相关的新血管AMD或障碍的风险的对象，和 向需要其的对象给药包含用于抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述眼部疾病或障碍为干性AMD或地图样萎缩AMD。
5. 治疗和/或预防患有AMD的对象或具有患AMD的风险的对象中的AMD的方法，包括 向所述对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物。
6. 如权利要求5所述的方法，其中CCR3蛋白的抑制降低AMD的症状或使AMD的症状停 止。
7. 治疗和/或预防患有AMD的对象或具有患AMD的风险的对象中的AMD的方法，包括 向所述对象给药包含能够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物，其中CCR3 蛋白的抑制降低AMD的症状或使AMD的症状停止，此外，所述试剂与抗-VEGF抑制剂组合给 药。
8. 预防具有发展脉络膜血管新生和/或随后的脉络膜血管渗透性增加的风险的对象 中的萎缩视网膜背景上的CNV损伤的发展的方法，包括向所述对象给药包含能够抑制CCR3 蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物，其中所述CCR3蛋白的抑制预防这样的损伤的 发展，所述试剂可以单独给药或与抗-VEGF抑制剂组合给药。
9. 预防萎缩性AMD和非血管AMD转化成为新血管AMD的方法，包括向对象给药包含能 够抑制CCR3蛋白的活性和/或表达的试剂的药物组合物，其中所述CCR3蛋白的抑制防止 这样的向新血管AMD的转化，所述试剂可以单独给药或与抗-VEGF抑制剂组合给药。
10. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述试剂为 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-吗啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
11. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述试剂为N- [ [ (2S) -4- [ (3, 4-二氟 苯基）甲基]-2-吗啉基]-甲基]-3-[(甲基磺酰基）氨基]-苯乙酰胺，或其药学上可接 受的盐。
12. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述对象为哺乳动物。
13. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述对象为人类。
14. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，另外包括向对象给药额外的治疗剂。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述额外的治疗剂为选自帕唑帕尼、 Lucentis?、Avastin?、和 Aflibercept? 的抗-VEGF 抑制剂。
16. 如权利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，另外包括在给药包含能够抑制CCR3的试 剂的药物组合物之后通过测量所述对象的视敏度来监控治疗。
17. 能够抑制CCR3的表达和/或活性的试剂在制备用于治疗和/或预防眼部新血管障 碍的药物中的用途。
18. 能够抑制CCR3蛋白的表达和/或活性的试剂在制备用于治疗和/或预防AMD的药 物中的用途。
【文档编号】A61K31/395GK104203231SQ201280068923
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年12月1日
【发明者】P.亚当森, D.希马, Y.S.E.恩格 申请人:葛兰素集团有限公司