专利名称：叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，属于医药领域。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)从发现至今已有四十余年。1963年，Blumberg等发现澳大利亚血友病患者血清中含有一种能与美国血友病患者血清起反应的抗原，称其为澳大利亚抗原(即乙型肝炎病毒表面抗原，Hepatitis B Virus SurfaceAntigen,HBsAg)。1970年Dane等在乙肝病人血清中发现了 42nm大小的HBV颗粒,其外膜成分中含有HBsAg，1986年国际病毒命名委员会正式将HBV归为嗜肝DNA病毒科。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个世界性的健康问题，呈世界性分布，它不仅可以导致急、慢性HBV感染与75% — 90%的原发性肝癌相关。全球慢性HBV感染约有3. 5亿人，我国属HBV感染的高流行区。据我国传染病报告和疾病监测统计，乙肝占急性肝炎病例的25%左右，与HBV感染有关的肝病死亡率约23/10万，其中肝癌死亡率约13/10万，乙肝对人类健康危害最为严重，是我国最重要的公共卫生问题之一。由一些数据估计，我国慢性无症状HBV携带者(AsC)超过1. 2亿，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000万人，先、现患率约为2770/10万，这些患者10% — 30%可发展为肝硬化，一部分可进一步发展为肝癌，累计现行的和既往的，我国已有一半以上人口经受HBV感染，所以慢性乙肝的治疗是亟待解决的问题。目前临床上用于治疗HBV感染的药物除干扰素(Interfeixm，IFN)外，还有少数天然药物及众多化学合成药物如核苷类似物阿糖腺苷(adenine arabinside, Ara_A)、拉米夫定(Iamivudine)、泛昔洛韦(famciclovir)、阿地福韦(adefovir)、恩他卡韦(ontacavir)等。这些药物已在实验室和临床应用中证实能显著抑制HBV DNA的复制或抑制HBsAg、HBeAg的表达与分泌。然而这些药物却存在一定的不足，干扰素的缺点主要表现在①价格昂贵；②注射制剂；③对 患者的选择有严格的限制性；④明显的不良反应，如发热、血小板减少、暂时性脱发等；⑤在失代偿性肝病患者中应用有一定的风险。核苷类药物的不足表现在①需要长期治疗耐药性病毒变异的发生率高；③停药后发生ALT反跳，甚至发生重症肝炎。上述的种种不足都使得临床应用受到了极大的限制。因此，寻找和开发无污染、低毒副作用、价格低廉、安全有效的抗HBV药物具有十分重要的理论、经济和社会意义。随着天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等研究的不断深入，人们发现，天然药物具有对人体低毒副作用，不易产生耐药性等显著特点。针对目前病毒性肝炎治疗中的困难，寻找与证实有效天然药物已经成为临床治疗病毒性肝炎的希望与重要手段。传统中草药品种繁多，已广泛应用于临床治疗慢性乙型肝炎并取得一定疗效，积累了丰富的临床经验，但中草药抗HBV的作用机理还有待于深入研究，所以筛选中草药抗HBV这方面的工作尚有很大的潜力；而且传统中草药不良反应少，价格低，日益受到国内外研究者的普遍重视，寻求有抗病毒作用的天然药物是当前研究的热点。目前国内外对天然药物生物活性与功能的研究已发展为研究与分析天然药物的活性部位、活性成分及至活性成分的结构或构型，以进一步明确药物的作用机理，真正实现“天然药物现代化”这一目标。如美国Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，发现其抑制HBsAg、HBeAg表达的具体有效成分为三种奈-氢醌化合物。日本学者Nin等研究证明治疗肝炎的传统药物甘草中起免疫调节作用的成分为一种糖类(甘草甜素)。
发明内容
本发明的目的是提供叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。本发明首先提供了一种叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。该叶下珠多糖组份将其命名为叶下珠多糖组份PUIP II。所述叶下珠多糖组份TOIP II由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为O. 11:0. 36:0. 08:0. 45。本发明还提供了所述叶下珠多糖组份TOIP II在制备保肝护肝保健品中的应用。本发明所述的叶下珠多糖组份TOIP II的提取分离方法，包括如下步骤
O叶下珠全草用蒸馏水洗净，干燥后粉碎，粉碎的叶下珠全草粉末，用石油醚在70 90°C下回流提取2 4次，每次I 3小时，弃去回流液，药渣继续用50 100%乙醇在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小时，弃去回流液，得到的药渣再用60 95 °C水浸提3次，每次I 3小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度2000 6000r/min，取清液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的90 100%乙醇，静置24h，离心，取醇沉物即为粗多糖。 2)除蛋白，采用Sevag法脱蛋白将步骤I)得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液体积为I 6 :1 3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿正丁醇体积比=1 4:1 4，搅拌，充分静置分层，弃去沉淀，重复I 10次后直至界面无白色沉淀。3)醇沉、洗涤在除蛋白后的多糖溶液中加入3 6倍体积的75 100%乙醇，静置12 36h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重复2 5次。4)透析、干燥取醇沉、洗涤后的多糖加入蒸馏水，充分复溶后用蒸馏水透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与蒸馏水体积比为1:10 30，4 8h换一次水，透析12 120h，透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠精总多糖，多糖含量在95%以上。5)多糖各组分分离纯化叶下珠精总多糖过DEAE-52阴离子交换树脂柱，用NaCl溶液梯度洗脱，NaCl溶液的浓度梯度分别为0、0. 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L。每种浓度NaCl溶液洗脱8小时，流速4mL/min，用管收集洗脱液，每IOmin收集一管，绘制洗脱曲线。所述洗脱曲线以收集的管序为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘制而成。苯酚一硫酸法跟踪检测，得到的洗脱曲线上依次出现四个洗脱峰，分别代表四个多糖组分，按照出峰的顺序分别记为I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV，收集第2主峰组分，浓缩，重蒸水透析，冷冻干燥得叶下珠多糖PULP II纯组分。本发明所述的叶下珠多糖TOIP II，为土黄色粉末，易吸潮，是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为579962. 6 ；PULP II单糖组成及其比例为鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc)为 O. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主链由 Rha>Ara 和 Glc组成。各单糖通过呋喃糖苷键连接，糖苷键以I — 6连接为主，同时还存在I — 4和I — 3连接方式。纯度在98%以上，符合生物活性试验要求，样品也可干燥后密封保存备用。本发明的优点是1、叶下珠多糖TOLP II目前未有报道具有抗乙肝病毒作用，本发明发现叶下珠多糖PULP II能作为抗乙肝病毒药物，此药物其最大优点是天然产物，与现有抗病毒药相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用；2、与直接使用中草药相比，叶下珠多糖I3ULP II作为具体化学组分的物质直接作为抗病毒的药效成分，用药量少，无其它非药用组分，因而能减少其它成分可能对肌体的伤害(副作用)，临床用药简单；3、叶下珠中草药原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。
图1为葡萄糖标准曲线。图2为多糖梯度洗脱曲线。图3为H印G2. 2. 2. 15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律。
具体实施方式
·下面结合实施例对本发明进行详细说明
实施例1叶下珠多糖的提取
I材料与方法1.1材料(略)
1.2实验方法
1.2.1叶下珠预处理
叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，50°C低温干燥后，粉碎，密封备用。其粉末为黄绿色。1. 2. 2叶下珠多糖的提取方法
石油醚80 1回流脱脂一95%乙醇80 1回流脱小分子糖一90 °C水回流提取3次，合并3次滤液4000r/min离心，浓缩至1/4体积一加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，蒸懼水复溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力搅拌30min,充分静置分层，重复7 8次操作即可除去游离蛋白质一除蛋白后的多糖溶液加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h —依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复三次一透析72h —冷冻干燥得叶下珠总多糖(PULP )。1. 2. 3叶下珠总多糖含量的测定1.2. 3.1葡萄糖标准液和样品供试液的制备
精密称取葡萄糖标准品(在105°C下干燥到重量不再发生变化)10mg，用蒸馏水溶解后，置于IOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成O. lmg/mL的葡萄糖标准液，备用。精密称取干燥至恒重的叶下珠多糖10mg，用蒸馏水溶解后，置于IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，摇勻，制成O. lmg/mL的样品供试液备用。1. 2. 3. 2吸收波长的确定
取葡萄糖标准液和样品溶液各I mL,分别加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹于IOOmL棕色容量瓶中加蒸馏水定容)，摇匀后，悬空垂直加入5mL浓硫酸，置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，在400 600 nm范围内全波长扫描，确定吸收波长。
1. 2. 3. 3葡萄糖标准曲线制作
精密吸取葡萄糖标准液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL于IOmL具塞刻度试管中，依次添加水使终体积为ImL,空白对照为ImL水,然后加入ImL 5%苯酹溶液摇勻,迅速加入5mL浓硫酸(悬空垂直加入)，置沸水浴中加热15min,然后置冷水浴中冷却，于490nm处测定吸光度。以吸光度为Y轴，葡萄糖质量为X轴，绘制标准曲线，并计算回归方程。1. 2. 3. 4糖含量的计算
精密吸取供试液lmL，按“1. 2. 3. 3”同法操作，于490nm处测定吸光度。按照公式计算糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%
C :由标准曲线查得的葡萄糖微克数 C0 :样品溶液的浓度(O.1 mg/mL)
V :测定时用的样品溶液体积(1. OmL)
1.2. 3. 5多糖的提取率
多糖的提取率=多糖的质量/原材料的质量X 100 %
2.结果与分析
2..1测定波长的确定 样品溶液和葡萄糖标准液的最大吸收峰波长都在490 nm左右处，所以选取490 nm作为多糖含量的测定波长。2. 2葡萄糖标准曲线
以吸光度为Y轴，葡萄糖微克数()为X轴，绘制标准曲线，如图1，可以看出在20 100 g范围内，葡萄糖量与吸光度有良好的线性关系。2. 3糖含量
测得样品液的吸光度A为O. 388，根据回归方程计算其相应葡萄糖的微克数为28. 27 g。根据公式得糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%
2.4多糖的提取率
多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%
3结论
本实验通过石油醚脱脂，再以95%的乙醇脱去低聚糖等小分子物质，然后以水提醇沉法从叶下珠中分离出多糖，并采用sevag法脱蛋白，苯酚一硫酸法测定其含量，其最大吸收波长为490nm，多糖提取率为1. 5%，糖含量为28. 27%。实施例2叶下珠多糖的分离纯化 I材料与方法1.1材料(略)
1.2.实验方法1.2.1 DEAE-52 柱分离1.2.1.1 DEAE-52填料预处理
DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h，期间4 5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱-酸-碱处理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到0H_型纤维素。湿法装柱(柱尺寸为500 X 50mm)，蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。1. 2.1. 2过DEAE-52层析柱分离纯化
称取640mg叶下珠总多糖溶于80mL重蒸水中(8 mg/mL),过O. 45 μ m滤膜后上样。依次用 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脱，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟踪检测，收集各主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖各组分。1. 2. 2.纯度鉴定
1.2. 2.1 SephadexG-200葡聚糖凝胶过滤法
SephadexG-200的预处理S印hadexG-200填料加适量蒸馏水浸泡24h，期间4 5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后超声脱气直到凝胶液中没有气泡出现为止。湿法装柱(柱尺寸为500 X 25mm)，用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后备用。SephadexG-200柱层析将上面收集的各组分配制成25mg/mL的样品液,上样2mL,用O. 05 mol/L的NaCl洗脱。自动部分收集器收集,每管5 mL,每30 min收集一管,苯酹-硫酸法跟踪检测。1. 2. 2 2 HPLC高效液相色谱法
将纯化后的各组分多糖配制成lmg/mL的样品液,过O. 45 μ m的滤膜后进样。色谱条件色谱柱PolySep_SEC4000 Part No: 00H-3144-K0 ColumnSize:300X7. 8mm ; 检测器示差检测器；柱温30°C;流动相双蒸水；流速0. 8 mL/min ;进样量20 μ L。2结果与分析
2.1 DEAE-52柱层析分离结果
经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精多糖(PULP)，过DEAE - 52离子交换柱，依次用O、
0.U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，得如图2所示中洗脱曲线。由图2可以看出，TOLP经DEAE-52柱层析分离后，能够明显分离出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，记为I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量较大的组分PULP II做进一步分析。2. 2 SephadexG-200 柱和 HPLC 纯度鉴定 2. 2.1 SephadexG-200 柱结果
取叶下珠多糖组分I3ULP II过S印hadexG-200凝胶柱，NaCl洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，用吸光度值与洗脱管数作洗脱曲线，PULP II在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线是对称的单一峰，说明TOLP II组分是分子量相对均一的多糖组分。2. 2. 2 HPLC法纯度鉴定
利用HPLC法检测叶下珠多糖组分TOLP II的纯度时，结果显示，经DEAE-52纤维素柱分离纯化后的多糖组分PULP II，在高效液相图谱上峰型比较对称，且经过面积归一法计算其纯度达到95%以上，与S印hadex G-200凝胶色谱图结果相吻合，说明纯度比较高，可以用来做结构鉴定。3 结论
水提醇沉脱蛋白后的叶下珠多糖经过DEAE-52纤维素柱分离纯化后得到四个组分，分别记为I3ULP I ,PULP II HPIII和I3ULPIV。收集含量较大的组分I3ULP II，用S印hadexG-200凝胶柱层析法和高效液相色谱法(HPLC)两种方法进行纯度鉴定，证明其组分相对均一，可以进一步做结构分析。实施例3 PULP II的理化性质及结构分析1、理化性质
PULP II为土黄色粉末，易吸湿。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。Molish反应、苯酚-硫酸反应、硫酸-咔唑反应阳性，茚三酮反应、碘-碘化钾反应、斐林反应、三氯化铁反应和硫酸基反应为阴性。由理化性质，糖醛酸含量测定，元素分析、红外和紫外，HPLC综合分析表明PULP II中是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为579962. 6。2、PULP II的红外吸收图谱
红外图谱表明，PULP II 在 3100 3500 cm_1,2800 2900 cnT1，1400 1530 cnT1，1000 1100 cnT1处有明显的多糖的特征吸收峰。且PULP II在1010 1100 cnT1有两个强吸收峰，说明有呋喃型糖苷键存在。由单糖组成和部分酸水解结果分析，PULP II单糖组成及其比例为Rha:Ara: ManiGlc 为 O. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主链主要由 Rha, Ara 和 Glc 组成。综合高碘酸氧化和Smith降解结果分析，PULP II糖苷键以I — 6连接为主，同时还存在I — 4和I — 3连接方式。实施例4叶下珠多糖I3UIP II的体外抗氧化活性初步研究 I材料与方法
1.1材料与试剂(略)
1.2实验方法1.2.1多糖还原力的测定
实验参考Oyaizu方法，略做稍微改动。取I mL不同浓度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液于具塞试管中，然后分别加入2. 5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲溶液及1%铁氰化钾溶液，50 1水浴反应20 min后冰浴迅速冷却，加入2. 5 mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，离心(3000 r/min, 10 min)。取上清液 2· 5 mL，W2.5 mL 双蒸水和 O. 5 mL O. 1% FeCl3,摇匀，反应10 min后，测定700 nm处的吸光度。1.2..2多糖体外羟基自由基(· 0H)清除率的测定
在Fenton反应体系中，H2O2与Fe2 +混合产生· 0H。由于· OH反应活性强，存活时间很短，加入水杨酸，就能有效地捕捉到.0H，并生成在510 nm处有强吸收的有色物质。同时，若在此体系中加入与水杨酸有竞争作用的能够清除.OH的物质，则有色物质的生成量变少，吸光度变低，吸光度越低，证明该物质清除.OH的能力越强。在具塞试管中分别加入2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L的水杨酸乙醇溶液，不同浓度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，最后加入2 mL 8. 8mmol/L的H2O2溶液启动反应，室温下反应30 min，测定510 nm处的吸光度，以蒸馏水代替多糖溶液做空白对照。 自由基清除率计算公式P= (A0-Ai) /A0X 100%
A0 :空白吸光度，A1:样品吸光度1.2. 3抗脂质过氧化能力
吸取 O. 4 mL 卵黄悬液[V (卵黄):V (PBS) =1:25], I mL 不同浓度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，O. 4 mL 25 mmol/L的FeSO4，于具塞试管中，加入O.1 mol/LpH7. 45的PBS溶液至总体积为4. O mL，37°C水浴恒温振荡15 min。取出后加入1. O mL 20%的TCA，静置10min后，离心(3500 r/min, 10 min)。吸取4. O mL上清液,加入2. O mL O. 8%的硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴15 min，冷却后，以PBS做参比，测定532 nm处的吸光值。样品对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示样品的抗氧化活性的能力，SP 抑制率 I= (A0-A)/A0X 100%
Atl-对照管的吸光度；A-样品的吸光度 2结果与分析
2.1 PULP II的还原力
实验结果表明各浓度下的PULP II多糖溶液都具有一定的还原能力，并且在I 5mg/mL的浓度范围内，其还原力随浓度的增高而增强。2. 2 PULP II体外羟基自由基清除率
实验结果表明各浓度下的PULP II多糖溶液对体外羟基自由基都有一定的清除能力，并且在I 5mg/mL的浓度范围内，其清除率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULP II的清除率为35. 5%。2.3 PULP II抗脂质过氧化能力
实验结果表明各浓度下的PULP II多糖溶液对LPO均具有一定的抑制作用，并且在I 5mg/mL的浓度范围内存在量效关系，其抑制率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULP II的抑制率为10. 7%。3 结论
叶下珠多糖PULP II具有一定的还原力、清除体外羟基自由基能力和抗脂质过氧化能力，并且随着多糖浓度的增大而增强。在5mg/mL时，PULP II的还原力为O. 538，对体外羟基自由的清除率达到35. 5%，对LPO的抑制率分别为10. 7%。这说明叶下珠多糖具有一定的抗氧化活性并且其抗氧化活性主要表现在清除体外羟基自由基上。
实施例5叶下珠多糖I3UIP II体外抗乙肝病毒研究本试验采用目前应用最广泛的体外抗乙肝病毒药物筛选模型IfepG2. 2. 2. 15细胞模型，从、叶下珠提取分离得到PUIP II与H印G2. 2. 2. 15细胞作用，取其细胞上清液，分别测定其乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度变化，来判断该药物是否有效，并采用MTT法测定各部分的细胞毒性。综合这二个指标，对叶下珠多糖PUIP II进行体外抗乙肝药效学试验，并选用临床上已证实的具有抗乙肝病毒作用的阿昔洛韦(ACV)作为阳性对照药物，以评价各部位抗乙肝病毒的效果，以此筛选有效部位或有效成分。I材料与方法
1.1材料与试剂(略) 1.2实验方法1.2.1细胞的复苏
基本步骤调配37°C 40°C的温水；从液氮罐中取出H印G2. 2. 2. 15细胞冻存管，立即投入37°C 40°C的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解，融解过程在l_2min内完成；将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800r-1000r/min离心5min，弃上清液；给细胞沉淀加入完全培养液，轻轻吹吸打匀，将细胞悬液移入培养瓶，加足培养液进行培养，置于37°C，5%C02细胞培养箱培养。1. 2. 2细胞的传代培养
H印G2. 2. 2. 15细胞置于5%C02，37°C培养。培养基为DMEM，添加10%的胎牛血清，3%L-谷氨酰胺1%，G418 200ug/mL，青霉素100u/mL，链霉素100u/mL。2. 2. 15细胞长满培养瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用O. 25%胰酶37°C消化3_10min，加培养液吹打，I 3或1:4传代，8天长满，采用细胞记数板记数，配制成IO5个/mL接种细胞培养板，96孔板每孔
O.1mL ；24孔板每孔lmL，5%C02，37°C培养24小时进行实验。1. 2. 3细胞计数方法
一般用血细胞计数板， 按白细胞计数法进行计数。取待稀释的细胞悬液ImL加生理盐水做5倍稀释，用IOX 10的倍数进行计数，中央为红细胞计数用，四角大格为白细胞计数用，计数时仅统计完整的细胞，若聚成一团的细胞按一个细胞进行计数，在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线不计下线，计左线不计右线，计数误差不超过±5%，计数后需计算每mL悬液中的细胞数，由于计数板中的每一方格的面积为O.1cm2,高为O. Olcm,体积为O. 0001cm3。每mL细胞数按式I计算
每 mL 细胞数=(n/4) X10000X5(I)
式中n为四大格细胞总数1.2. 4 MTT比色法测细胞存活率
H印G2. 2. 2. 15细胞培养于96孔培养板，每孔80 μ I培养液；加入20 μ IMTT,继续培养3-4h ;吸去100 μ I培养液，加入等量O. 04-0. lmol/L盐酸异丙醇溶液，室温下约IOmin (或将平板置于微型震荡器震荡)，使结晶物溶解；在酶标仪上测定光吸收，测定波长为570nm。1.2.5 MTT法测药物毒性
将!fepG2. 2. 2. 15细胞按IO5个/mL接种于96孔培养板中，0.1 mL/孔，次日用培养液将待测药物分别配成几种不同的浓度，加入细胞孔，每孔浓度加3孔，0.1mL/孔，并设无药细胞对照及阳性对照药。加药后培养4天，弃上清用MTT染色，每孔加lmg/mL的MTT无血清培养液0. lmL，孵育4小时，弃上清，加入0. 04mol/L盐酸异丙醇0.1mL溶解后，用570nm波长比色测定OD值，实验重复3次。1. 2. 6 测 HBsAg、HBeAg 分泌规律
将H印G2. 2. 2. 15细胞105/mL接种于24孔细胞培养板，每孔1. OmL,共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250 μ 1，培养液补足原量至第13天，培养上清于-20°C冻存，最后集中按试剂盒说明书，用ELISA法测定HBsAg、HBeAgo1. 2. 7药物对HBV抑制试验
将H印G2. 2. 2. 15细胞按105/mL接种于24孔板，每孔1. OmL,次日弃培养液，以待测药物的!fepG2. 2. 2. 15细胞的半数毒性浓度为起始浓度用培养液进行倍比稀释，另设无药对照及阳性对照药，培养于37°C、5%C02培养箱中。每4天收取上清，并换加原浓度药液继续培养，将收集的上清_20°C冻存，于第12天收集完，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，实验重复3次。
1. 2. 8 ELISA 法测 HBsAg、HBeAg
(I)将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18 25°C )。(2)浓缩洗涤液配制前充分摇匀如有晶体应充分融解，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1: 19稀释后使用。(3)将微孔板条固定于支架，按序编号。(4)每孔加入待测标本50 μ 1，设阴、阳对照各2孔，每孔加入阴、阳对照各50 μ 1，
并设空白对照一孔；
(5)每孔加入酶标记抗体50μI (除空白对照外)、充分混匀后封板，置于37°C环境中孵育 30min ；
(6)手工洗板；弃去孔内液体，洗涤液贮满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干；
(7)每孔加显色剂A液、B液各50μ 1，充分混匀，封板，置37°C环境中孵育15min ；
(8)每孔加入终止液50μ 1，混匀；
(9)用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白空校零。然后读取各孔OD值。(阴性对照OD值低于O. 05作为O. 05计算，高于O. 05按实际OD值计算。)
1.3数据分析1.3.1 MTT法测药物毒性后可得
权利要求
1.一种叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，其特征在于所述叶下珠多糖组份为叶下珠多糖组份PUIP II。
2.根据权利要求1所述的叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，其特征在于所述叶下珠多糖组份PUIP II由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为O. 11:0. 36:0. 08:0. 45。
3.一种叶下珠多糖组份PUIP II在制备保肝护肝保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种叶下珠多糖组份在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，属于医药领域。所述叶下珠多糖组份为叶下珠多糖组份PUIPⅡ，由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，且鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.11:0.36:0.08:0.45。由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。体外生物活性实验表明，所述叶下珠多糖组份PUIPⅡ具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用；体内活性实验表明，PUIPⅡ在鸭体内对DHBVDNA有明显抑制作用，且反弹较小，可用于制备抗乙肝病毒的药物和保肝护肝保健品。
文档编号A61P31/20GK103040857SQ20131000635
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者李清禄, 李凌峰, 李宇翔, 张丽丽, 谢勇平, 蔡向阳, 黄志坚 申请人:福建农林大学