专利名称：半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术：
纳米粒是一种新型药物递送系统，可包载化疗药物、基因药物等多种药物。纳米粒可改变药物的体内分布，具有靶向给药、缓释药物、降低药物毒副作用、增溶难溶性药物、提高药物稳定性、促进生物膜的转运和吸收、提高生物大分子药物生物利用度等优势(AdvDrug Deliv Rev 2008，60:1638-1649)，在生物大分子药物给药系统中应用尤为广泛。纳米粒的制备方法主要有共价交联法、离子交联法、复凝聚/沉淀法、乳化/溶剂扩散法、反胶束法、喷雾干燥法、热加工法、简单聚合法等。共价交联、反胶束法、乳化/溶剂扩散法等均需使用有机溶剂，易造成药物活性降低甚至失活。离子交联法通过荷相反电荷物质间的聚电解质作用自组装形成纳米粒，无需使用有机溶剂，反应条件温和，可最大限度保护生物大分子药物的活性(Int J Biol Macromol 2010,46:342-349)。天然阳离子聚合物壳聚糖无免疫原性、生物可降解、安全性好，分子结构上的活性氨基可连接不同功能基团，如季铵等质子化基团、PH敏感基团、巯基或特异性靶向配体等。壳聚糖衍生物N, N, N-三甲基壳聚 糖季胺盐(Trimethyl chitosan, TMC)在中性条件下荷正电，溶解性好，用于口服给药时，可打开肠道上皮细胞间紧密连接，促进亲水性大分子药物经细胞旁路转运和吸收；巯基化聚合物用于口服给药时，可紧密结合于黏膜，延长滞留时间，提高局部药物浓度，促进药物吸收，并发挥促渗作用。靶向给药系统的研究中，半乳糖祀向配体修饰的给药系统可通过与肝细胞去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor, ASGP-R)或巨卩遼细胞半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异性凝集素(macrophagegalactose/N-acetyl galactosamine-specific lectin, MGL)特异性结合，实现主动革巴向肝脏或巨噬细胞，发挥疾病治疗功效。聚乙烯亚胺接枝半乳糖修饰壳聚糖(GC-g-PEI)包载pDNA，对肝癌细胞株H印G2细胞的转染效率明显高于宫颈癌细胞株HeLa细胞(Gene Ther2007，14:1389-1398)。半乳糖修饰的低分子量壳聚糖包载反义寡聚核苷酸，结肠给药后可主动靶向炎症巨噬细胞发挥抗炎功效(Gut 2010,59:470-479)。但上述半乳糖修饰的纳米粒均未通过口服途径给药实现主动靶向治疗功效。上述给药系统亦缺乏有效途径可控调节药物和载体间的结合力，无法保证所载药物在生理环境中的稳定和在治疗靶点的快速释放。此外，现有文献中半乳糖修饰的载体均仅包载一种药物，进行单靶点治疗，易产生耐药性，尚无使用半乳糖修饰的给药载体同时包载多种药物，实现多靶点联合给药，协同发挥疾病治疗功效的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。本发明第一方面，提供半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。该纳米粒可通过离子交联法(ionic gelation)制备,包载生物大分子药物(蛋白质多肽药物或核酸药物)。其中:
所述的离子交联法为荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂通过聚电解质作用形成纳米粒，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物；所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、半乳糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖分子量为30-1000 kDa，季铵化度为15-60 mol% (根据1HNMR计算而得，方法参见Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)，半乳糖修饰物为乳糖醒酸，半乳糖修饰度为5-60 mol% (根据1H NMR计算而得，方法参见J Control Release2008，131:150-157)，巯基化修饰物为半胱氨酸盐酸盐，游离巯基修饰率为50-200 μ mol/g，二硫键修饰率为100-300 μ mol/g。在本发明的优选例中，所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐具有下式结构:
权利要求
1.一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于由荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和离子交联剂经离子交联作用生成，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物；其中，所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、半乳糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物；壳聚糖分子量为30-1，000 kDa ;所述季铵化度为15-60 mol% ;半乳糖修饰物为乳糖醛酸，所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐的半乳糖修饰度为5-60 mol% ;巯基化修饰物为半胱氨酸盐酸盐，所述的游离巯基修饰率为50-200μ mol/g, 二硫键修饰率为 100-300 μ mol/g0
2.根据权利要求1所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述离子交联剂选自三聚磷酸钠、透明质酸、Y-聚谷氨酸、丙烯酸树脂中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述的蛋白质多肽药物选自表皮生长因子受体单抗、HER-2单克隆抗体、TNF-α人鼠嵌合单克隆抗体、贝伐单抗、胰岛素、依诺肝素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、红细胞生长素、各种生长因子、白介素、集落刺激因子、抗原或抗体中的一种或几种；所述核酸药物选自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述的 DNA 为 pDNA ;所述的 RNA 为 siRNA、shRNA 或 microRNA。
5.根据权利要求1- 4之一所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的平均粒径为100-500 nm。
6.根据权利要求1- 4之一所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的Zeta电势为10-45 mV。
7.根据权利要求1- 4之一所述的半 乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒对蛋白质多肽药物或核酸药物的包封率为60-100%。
8.一种如权利要求1 - 7之一所述半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤为: (1)将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐、离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物溶于水； (2)将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物的混合溶液中，其中半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与一种或几种离子交联剂的质量比为1:1-20:1，一种或几种离子交联剂与蛋白质多肽药物或核酸药物的质量比为1:5-25:1 ； (3)室温静置，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂、蛋白质多肽药物或核酸药物经离子交联作用形成纳米粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐按如下步骤制备: (1)合成壳聚糖季铵盐，反应时间为45-180min,所得壳聚糖季铵盐以Cl_型阴离子交换树脂去除Γ，冷冻干燥；其中反应45、120和180 min所得壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为 15%、30% 和 60% ； (2)将壳聚糖季铵盐和乳糖醛酸分别溶于四甲基乙二胺/HCl缓冲液，乳糖醛酸和壳聚糖季铵盐的质量比为0.2:1-3:1，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节反应pH为3.0-5.0,室温反应24-72 h，超滤，冷冻干燥，得半乳糖修饰壳聚糖季铵盐； (3)将半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐溶于水，半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐的质量比为1:1-1:4，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基_3_(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至3.0-5.0,室温反应2-8 h，透析，冷冻干燥，得半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。
10.权利要求1- 7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备口服给药系统或者联合给药系统中的应用。
11.权利要求1- 7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备抗肿瘤给药系统中的应用。
12.权利要求1- 7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备同时包载多种药物，实现多靶 点联合治疗的给药系统中应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体为一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。本发明的纳米粒由荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和离子交联剂经离子交联作用生成，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物。其中半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐由壳聚糖的氨基依次经季铵化、半乳糖修饰和巯基化修饰而成。该纳米粒的制备过程简单、无需使用有机溶剂，可保护蛋白质多肽药物或核酸药物的活性。该纳米粒结构稳定，可主动靶向炎症巨噬细胞和肝癌细胞，有效提高口服药物的小肠吸收并改善核酸药物的转染效率，抗炎和抗肿瘤效果显著优于现有壳聚糖类纳米粒，可用于制备口服给药系统或者联合给药系统等。
文档编号A61K45/00GK103083223SQ20131002931
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者唐翠, 印春华, 韩路, 张婧 申请人:复旦大学