A型流感病毒M基因有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明公开了三条对流感病毒M基因复制有抑制作用的siRNA；然后通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA载体质粒对流感病毒干扰的有效性。
【专利说明】A型流感病毒M基因有干扰作用的s i RNA序列的设计和干扰作用的鉴定
【技术领域】
[0001 ] 本专利涉及对A型流感病毒M基因有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之一。据历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美国每年有2万人死于流感，俄罗斯每年也有I万人死于流感，英国每年有5万人由流感发展成肺炎，其中约20%死亡。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大“杀手”。
[0003]目前对预防流感对人的侵害，目前有死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成等预防流感的各类疫苗，但是这些疫苗能够有效地保护约70~80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40%。由于大部分的死亡都是发生在高风险人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感的防治至少在今后50年内仍然是严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学研究的重大课题。
[0004]早在1990年,Napoli和Jorgensen等人在做转基因植物的实验中发现,给矮牵牛花注入外源性的色素基因，发现这不但没有使花色加深，反而使花色出现斑驳甚至完全无色。这意味着不但外源基因被灭活，连内源的同源基因也受到了抑制。他们把这一现象称为共抑制(co-suppress)。
[0005]1994年，Macino和Cogoni发现，将合成类胡萝卜素所需的基因导入粗糙红色链孢霉中，会导致30%的转化细胞中霉菌本身的基因失活，并将其称为基因的静息作用(quelling)[8]。
[0006]1995年,康奈尔大学的Guo和Kemphues在利用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par_l基因的表达时意外地发现,对照实验中给线虫注射正义RNA不但不增加该基因的表达，反而像反义RNA —样，也能阻断该基因的表达M。这与反义RNA技术的传统解释机制完全相违背，该小组一直无法解释这个现象。
[0007]直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Z.Fire和和马萨诸赛大学癌症中心的Craig C.Mello第一次尝试用双链RNA注射线虫[1°]，结果发现dsRNA能够高效特异地阻断相应基因的表达，抑制效率至少比单链RNA高10倍。他们更进一步指出Guo等发现的正义RNA对基因表达的抑制，以及过去利用反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由体外转录制备的RNA中污染的微量dsRNA引起的。后来Fire等首次提出一个新的概念——RNA干扰(RNA interference, RNAi),即由dsRNA介导的序列特异性的基因沉默(genesilencing)。
[0008]这种dsRNA导致的RNA干扰现象随后在果蝇、昆虫、真菌、植物拟南芥等生物和哺乳动物以及人类的多种细胞中也分别被发现。
[0009]起初普遍认为co-suppress、quelling和RNAi是不同机制的基因沉默现象,但随着研究的深入发现它们有共同的分子基础，都是转录后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)机制的不同表现形式,是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。
[0010]RNAi 一经发现，迅速成为生物学研究领域中最为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科学成就之一，2002年又将其列为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一 ；Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因RNA干扰的发现而获得了 2006年诺贝尔生理医学奖。随着广泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了初步的了解。
[0011]在一系列著名的实验中，Zamore和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21~23碱基长短的RNA片段，他们同时发现:与dsRNA同源的内源基因的mRNA，只在和dsRNA对应的部位被切割成为21-23核苷酸长的片断[11]。这掀开了揭露RNAi的机制的序幕。
[0012]根据生物体的不同，RNAi的诱导物可以是各种分子，包括长链dsRNA，质粒产生的shRNA或者内源性发夹样小RNA (hairpin microRNA，miRNA)。目前认为RNAi的主要过程[12]为:①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21_23nt的小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA), siRNA的结构特征是5’端单磷酸,3’端轻基，而且3’端有2~3-nt的碱基突出RNA诱导的沉默复合物(RNA_induced SilencingComplex, RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi特异性酶(如A go-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA ;③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5’端10-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质，表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与革G mRNA3’非编码区(untranslated region, UTR)通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。但也有研究表明，miRNA可以与siRNA —样通过介导mRNA的切断来抑制基因表达[13]。
[0013]在RNAi通路上，Dicer和RISC是两个最重要的蛋白复合体。了解这两个复合体的结构和功能对于理解RNAi的机制有着至关重要的作用。
[0014] Dicer酶是核糖核酸酶III (RNase III)家族的成员之一，约200kD，最早是在果蝇中发现的，能特异性地将dsRNA剪切为21~23nt5 ^磷酸化，3 ^端有2~3个核苷酸悬端的siRNA。Dicer酶含有4个结构区域，从N端到C端依次为:DEAD/H解螺旋区、PAZ区域、2个串联的 RNase III 区域(RNase IIIa 和 RNase IIIb)和双链 RNA 结合区(double-strandedRNA-binding domain, dsRBD)。大多数Dicer蛋白PAZ区域附近有一个100个左右氨基酸组成的未知功能的保守区域DUF283[15]。研究表明，PAZ结构域的功能是结合单链或双链siRNA或DNA，这种结合与核苷酸序列无关且亲和力较低。
[0015]RNAi是一种在进化上保守的机制，可以看作为基因组的“免疫系统”，它的作用主要体现在以下几个方面:①RNAi是一种抗病毒机制。许多病毒以RNA作为遗传物质，而且在生命周期的某一个环节会形成dsRNA,这种dsRNA就会被生物体的Dicer识别，切割成21-23nt的片断，启动RNAi过程进而阻断病毒蛋白质的表达。②RNAi通过抑制转座子和重复序列的移动来维护基因组的稳定性。③调节和维护正常的基因表达水平，如MicroRNAs能够调节蛋白的表达和决定发育时机的选择。
[0016]作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，广泛的应用于治疗和预防各类病毒性疾病。
【发明内容】
[0017]本发明提供三条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列。如序列表400〈1>，400〈2>，400〈3> 所示。
[0018]本发明所述的三条siRNA的载体表达物在动物水平的实验结果表明，RNAi能效抑制HlNl，H2N3, H9N2的病毒复制。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:鸡胚实验验证siRNA干扰H9N2流感病毒增殖作用验证
[0020]H9N2病毒毒力ED5tlIO8_°/0.Iml,将H9N2病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0021]实施例2:鸡胚实验验证重组质粒干扰HlNl流感病毒增殖作用验证
[0022]HlNl病毒毒力ED50108.。6/0.1ml，将HlNl病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0023]实施例3:鸡胚实验验证siRNA干扰H3N2流感病毒增殖作用验证
[0024]H3N2病毒毒力ED50108。°/0.1ml，将H3N2病毒稀释含有100个ED5tl病毒液，体积
0.1ml，注射到9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同时注射SiRNA载体质粒6微克，33°C培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。
[0025]实施例4:尿囊液病毒滴度检测
[0026](I)微量血凝板的每孔中滴加PH7.2PBS100uL, (2)吸取被检尿囊液样品100μ L，倍比稀释12孔，第12孔弃掉100 μ L。每孔中加入0.1 %红细胞悬液100 μ L。
[0027](2)设阴性对照和流感病毒阳性对照。
[0028](4)置微型振荡器上振荡Imin混匀。
[0029](5)放室温下(18~20°C )30min，观察结果。
[0030]经三次重复实验，序列表所述的三条序列〈400>1，〈400>2，<400>3对流感病毒复
制的抑制率如下:
[0031]
【权利要求】
1.一种对流感病毒M基因复制有干扰作用的SiRNA，其核苷酸序列如序列表400〈1>，.400<2>,400<3> 所示。
2.权利要求1、对所述的siRNA作为抑制流感病毒M基因沉默的靶向基因的应用。
【文档编号】A61K48/00GK103966213SQ201310048356
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年2月6日
【发明者】任政华, 霍晋 申请人:霍晋