microRNA-552在预防和治疗酒精性肝病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了microRNA-552在制备预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。本发明中，采用microRNA-552在体外酒精肝模型中下调CYP2E1的表达，可以显著的改善酒精导致的肝脏损伤。
【专利说明】microRNA-552在预防和治疗酒精性肝病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及microRNA-552在制备预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002]酒精性肝病(Alcoholic liver diseases, ALD)指长期过量饮酒所致的一种肝脏疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝细胞癌等。嗜酒者中，约10%~20%可发展为酒精性肝病。酒精性肝病的发病机理比较复杂，近年的研究发现，细胞色素P450氧化还原酶(Cytochrome P450 oxidoreductase, CYP450)中的一个亚型 CYP2E1 在 ALD 的发病中起到关键的作用。CYP2E1的表达升高会加重酒精引起的肝脏损伤，诱发脂肪肝发生，在ALD相关的肝细胞癌中也起到关键的作用。因此，以CYP2E1为靶点，下调CYP2E1的表达对ALD相关疾病或肿瘤的预防和治疗具有重要的意义。
[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是细胞内源产生调苄基因表达的小分子非编码RNA，其调节的效应通常是抑制基因表达。MicroRNA (miRNA)调节机体内若干基因的表达，它们参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等几乎所有生命过程，在心血管疾病、神经系统疾病、造血系统疾病、糖尿病及各种肿瘤的病理过程中也发挥重要作用。研究表明，肝脏特异表达的miR-122可作为丙型肝炎的治疗靶点，目前针对miR-122的锁核酸嵌合体作为药物已处于临床试验阶段。已知miRNA的祀位点大多位于mRNA的3’ -非翻译区(3’ untranslatedregion, 3’ -UTR),功能性的单链(mature miRNA,成熟miRNA)被整合到RNA诱导沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex, RISC)中，与祀 mRNA 结合,通过 mRNA 剪切、mRNA 去腺苷或抑制翻译等方式在转录后水平抑制基因表达。这种调节方式依赖于miRNA种子区序列(2~7nt)与靶mRNA3’ -非翻译区序列的互补配对。
【发明内容】
[0004]CYP2E1在酒精肝相关的疾病中表达显著上调，CYP2E1的表达上调与酒精引起的肝细胞凋亡坏死，氧化损伤，炎症以及酒精引起的蛋白，DNA加合物生成密切相关。已经有多项重要临床报道与动物实验证明CYP2E1在酒精引起肝脏损伤中起到关键作用(参考文献1-5);也有多项临床，体外实验与动物实验证明下调CYP2E1的表达可以明显改善酒精引起肝脏相关的疾病(参考文献6-9)，因此，本发明中，选择酒精肝体外模型，使用酒精诱导CYP2E1的上调，筛选能明显下调CYP2E1表达的microRNA具有重要的应用价值和意义。
[0005]本发明人经过实验验证，发现了一种可以下调CYP2E1蛋白表达的HiiCT0RNA，该microRNA尤其可以下调被酒精诱导的CYP2E1的蛋白表达。
[0006]因此，本发明的目的是提供microRNA-552在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。 [0007]本发明中，所述microRNA-552能够下调CYP2E1的蛋白表达，特别是，能够下调被酒精诱导的CYP2E1的蛋白表达。[0008]本发明中，所述microRNA-552的核苷酸序列如下:5’-AACAGGUGACUGGUUAGACAA-3’ (SEQ ID NO:1)。本发明中，优选地，所述酒精性肝病包括，但不限于，脂肪肝、酒精性肝炎和肝细胞癌等。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗酒精性肝病的方法，包括向需要治疗的对象施用治疗有效量的microRNA-552。
[0010]本发明中，术语“有效量”可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。
[0011]本发明中，优选地，所述酒精性肝病包括，但不限于，脂肪肝、酒精性肝炎和肝细胞
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[0012]本发明人在前期工作中发现microRNA-552 (miR-552)可以结合到CYP2E1基因的3’ UTR区域(图1C)。经研究发现，在培养的人肝癌细胞中，miR-552可剂量依赖地引起CYP2E1蛋白水平表达下降(图1B)。miR-552可引起CYP2ElmRNA 3’-非翻译区荧光素酶报告系统的荧光素酶活性降低，突变种子序列区后此作用逆转(图1C和1D)。上述结果说明，miR-552确实可以通过与CYP2E1的3’ -非翻译区的特定位点结合，从而起到显著下调CYP2E1蛋白表达的作用。
[0013]本发明人随后采用Fa2N4与!fep3B-l这两种肝脏细胞系，用酒精诱导CYP2E1的表达，建立酒精性肝 病的体外模型。在这一细胞模型中，给予microRNA-552，发现microRNA-552在两种细胞模型中，均可以显著下调被酒精诱导表达的CYP2E1的蛋白的表达量(图2)。
[0014]本发明人在前期工作中发现microRNA-552与CYP2E13’非翻译区的结合位点，使用基因定点突变技术，将3’非翻译区上的结合位点突变，然后将野生型与突变型的3’非翻译区分别插入萤光素酶载体(psiCHECK2)，将分别携带野生型与突变型的载体分别转入细胞中，加入microRNA-552模拟物，检测3’非翻译区microRNA结合位点突变对萤光素酶活性的影响，确认microRNA与目的基因3’非翻译区的结合位点,最终确定该microRNA-552是否是通过CYP2E1的3’ -非翻译区的特定位点结合，从而起到显著下调CYP2E1蛋白表达的作用。
[0015]本发明中所建立的酒精性肝病体外模型，是在科研领域比较常用的模型。
[0016]因此，本发明中，采用microRNA-552在体外酒精肝模型中下调CYP2E1的表达，可以显著的改善酒精导致的肝脏损伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面结合附图与实施例对本发明做进一步的详细说明，其仅仅是对本发明的描述而不是限定。
[0018]图1为显示microRNA-552通过结合于CYP2E1的3’非翻译区下调CYP2E1蛋白表达的图。其中:
[0019](A):PLC/PRF/5细胞中转染miR-552后检测CYP2E1表达的蛋白印迹图。GAPDH作为上样量对照。图中数字为miciORNA的名字，nc是指阴性对照。[0020](B):显示CYP2E1蛋白表达随miR-552浓度升高而依赖性下调的图。归一化CYP2E1蛋白表达水平:使用ImageQuant Solutions软件对CYP2E1与内参基因GAPDH的条带进行灰度检测，然后依据GAPDH的灰度值，以nc为1，对CYP2E1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化CYP2E1蛋白表达水平。*，ρ〈0.05 ;**，ρ〈0.01。
[0021](C):显示CYP2ElmRNA3’-UTR区与miR-552种子序列区部分互补配对的图。小写字母代表CYP2ElmRNA3’ -UTR区中miR-552可能的结合位点突变后的核苷酸序列。
[0022](D):显示荧光素酶报告基因实验显示miR-552抑制CYP2E13’ -UTR活性，而对miR-552可能的结合位点突变了的3’ -UTR不能发挥抑制作用。**，p〈0.01。
[0023]图2为显示microRNA-552在酒精性肝病体外模型中下调CYP2E1蛋白表达的图。其中:
[0024](A):Fa2N4细胞中先加入酒精诱导CYP2E1的表达，然后转染microRNA-552，检测CYP2E1表达的蛋白印迹图。β-actin作为上样量对照。nc是指阴性对照。
[0025](B):Hep3B-l细胞中先加入酒精诱导CYP2E1的表达，然后转染microRNA-552模拟物，检测CYP2E1表达的蛋白印迹图。β-actin作为上样量对照。nc是指阴性对照。
【具体实施方式】
[0026]在下文中，将通过示例性提出的实施例来更加详细地描述本发明，然而，本发明的范围并不限于实施例。 [0027]实施例中所使用的试剂、仪器:
[0028]人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞，Hep3B_l细胞:中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库；
[0029]人源Fa2N4细胞:购于LONZA
[0030]microRNA-552:上海吉玛制药技术有限公司
[0031]所用质粒(psiCHECK2)购自Promega ；
[0032]萤光素酶活性检测试剂盒:购于Promega ；
[0033]转染试剂:Iipofectamine2000 购于 Invitrogen ；
[0034]各种细胞培养液:购于Invitrogen ；
[0035]蛋白免疫印迹仪器:购于BioRad ；
[0036]基因定点突变试剂盒:购于Merck ；
[0037]CYP2E1蛋白印迹检测用抗体:购于Millipore ；
[0038]除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。
[0039]实施例1酒精肝体外模型的建立
[0040]体外酒精肝模型可以在短时间(24-48小时)内建立，具有成本低、适合快速筛选治疗药物的优势。在模型的建立中，常使用一定浓度的酒精长期(48-72小时)处理肝脏细胞系，从而建立体外酒精肝模型(参考文献6、10)。本发明人选择了 Fa2N4与Hep3B_l两种细胞。Fa2N4是制药工业中常用来筛选药物对细胞色素P450酶表达影响的细胞系统，对外源的药物与化合物有很好的敏感性(参考文献11-13)。Hep3B-l则是研究中最常用的肝脏肿瘤细胞系。
[0041]在贴壁培养的上述细胞系中分别加入50mM酒精，处理48小时，检测CYP2E1的蛋白表达水平发现，CYP2E1的表达水平有显著的升高(图2)。
[0042]实施例2microRNA-552 (miR-552)的制备与使用
[0043]前期工作中发现microRNA-552可以结合在CYP2E1的3’非翻译区，委托上海吉玛制药技术有限公司按上文核苷酸序列，采用化学合成的方法合成纯化microRNA-552，并在人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞中转染miR-552，用蛋白印迹实验检测细胞内CYP2E1的蛋白表达变化，如图1所示，miR-552可剂量依赖地引起CYP2E1蛋白水平表达下降(图1A和图1B)。萤光素酶报告基因实验则显示miR-552确实通过结合于CYP2E1的3’非翻译区起作用(图1C和图1D)。
[0044]实施例3在人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞中检测miR-552对CYP2E1蛋白表达水平的抑制作用
[0045]人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞在37摄氏度，5% 二氧化碳的环境下，贴壁培养于RMPI1640培养基中，同时添加10%的胎牛血清以及适当浓度的青链霉素溶液。
[0046]在人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞中分别转染25ηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、200nM的miR-552，用蛋白印迹实验检测细胞内CYP2E1的蛋白表达变化。如图1A和IB所示，miR-552可剂量依赖地引起CYP2E1蛋白水平表达下降。
[0047]实施例4CYP2E1-3’非翻译区-萤光素酶报告系统载体以及突变体的建立与使用
[0048]本发明人使用了来自于Promega的psiCHECK2萤光素酶载体，使用特异的克隆引物PCR后获得CYP2E1基因的3’非翻译区序列(详见表1)，然后在psiCHECK2的多克隆区域插入CYP2E1基因的3’非翻译区序列，得到插入了 CYP2E1-3’非翻译区的psiCHECK2载体，将此载体与microRNA-552同时转入PLC/PRF/5细胞中，观察microRNA-552对萤光素酶活性的影响，发现microRNA-552可以显著下调细胞中萤光素酶活性(图1D)。
[0049]使用定点基因突变技术，将CYP2E1-3’非翻译区与microRNA-552结合的区域突变(图1C)，得到CYP2E1-3’非翻译区突变序列，将此序列插入psiCHECK2载体，然后将得到的载体与microRNA-552同时转入PLC/PRF/5细胞中，观察microRNA-552对萤光素酶活性的影响，发现miciORNA-552不能下调细胞中的萤光素酶活性(图1D)。
[0050]上述实验结果说明microRNA-552确实是通过结合在CYP2E1-3’非翻译区上，从而产生下调CYP2E1蛋白的作用。
[0051][表1]核酸序列
[0052]
【权利要求】
1.microRNA-552在制备用于预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述microRNA-552能够下调CYP2E1的蛋白表达。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述miciORNA-552能够下调被酒精诱导的CYP2E1的蛋白表达。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述microRNA-552的核苷酸序列如SEQID NO:1所述。
5.根据权利要求1 所述的用途，其中，所述酒精性肝病包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝细胞癌。
6.一种预防和/或治疗酒精性肝病的方法，包括向需要治疗的对象施用治疗有效量的microRNA-552ο
【文档编号】A61P35/00GK104001186SQ201310060524
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】苗玲玲, 任进, 戚新明, 王以政, 冯晨晨, 宫丽昆, 栾洋 申请人:中国科学院上海药物研究所