专利名称：丙型肝炎病毒b细胞表位肽puhi37及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体地说，涉及丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37及其应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(!fepatitis C virus，HCV)为单股正链RNA病毒，隶属于黄病毒科。HCV基因组包括一个单一的长开放阅读框编码约由3000个氨基酸残基组成的聚合蛋白。聚合蛋白在细胞和病毒蛋白酶的作用下，裂解为三种主要结构蛋白和几种病毒复制必须的非结构蛋白。HCV基因组高度变异，高度变异的分离株之间仅有60%核苷酸序列是同源的。HCV目前可分为6个基因型及不同亚型，HCVlb和2a基因型在我国较为常见，其中以Ib型为主。某些地区有la、2b和3b型报道，6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。目前全球约有1.8亿人感染了 HCV，其中约80%的感染者会慢性化，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。在我国，HCV慢性感染者约为650万。针对HCV慢性感染，最主要的治疗方式为干扰素联合利巴韦林的标准化治疗，但针对基因I型和4型治疗效果较差,且因毒副作用明显，治疗费用较高，而使大量HCV感染者被迫放弃治疗。由HCV感染导致的肝移植在西方国家已成为肝移植手术的最主要原因，在我国亦是重要原因之一，而标准化治疗方案对阻断HCV感染导致的移植肝脏再感染疗效较差，迫切需要新的预防、治疗方案。目前，已鉴定出较多的针对HCV包膜蛋白的保护性B细胞表位，例如313-327、396-407,412-423和613-621等，这些表位相应的抗体针对HCV具有较好的中和活性。研究较多的一条保护性线性B细胞表位肽412-423 (QLINTNGSWHIN)，其相应的抗体，命名为HCVI,已完成临床二期实验，在黑猩猩动物模型中，250mg/kg HCVl能完全阻断HCV代表株H77 (Ia基因亚型)的感染。这表明在HCV感染导致的肝移植领域，该抗体在阻断移植肝脏HCV的再感染方面应用前景广阔，在HCV疫苗的研制方面，也有较为广阔的应用前景。一系列实验表明，保护性表位的鉴定，在HCV感染的预防和治疗领域，都具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37及其应用。为了实现本发明目的，本发明提供了一种丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37，其氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN。本发明是将已报道的中国人Ib基因亚型HCV分离株包膜蛋白序列进行序列比对，找出包膜蛋白全长的共识序列。应用重叠肽的方法，将HCV包膜蛋白全长(共识序列)，即从第192位氨基酸至第746位氨基酸(以丙型肝炎病毒H77为参考标准，AccessionN0.NC- 004102)，拆分为57条不同的多肽(不包括跨膜区)，其中序列192_35、384_413、444-523,544-613和624-717中，每条多肽长度为20个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸；序列404-453、514-553和604-633中，每条多肽长度为15个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸。通过人工合成法合成这些多肽，分别将这些多肽免疫Balb/c小鼠，以获取多克隆抗体(抗血清)，共免疫3次，每次间隔2周，50 μ g/次。将获得的多克隆抗体进行效价检测，方法包括间接ELISA(参考文献:Ndongo N, Berthillon P, Pradat P, Vieux C, Bordes I, BerbyF, Maynard M, Zoulim F，Trepo C, Petit MA.Hepatology2010; 52:1531-1542.)0 将血清按比例稀释为 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 和 1:128000 八个浓度，在1:128000稀释比例下，490nm处OD值> 0.25，且1:128000稀释浓度时多克隆抗体OD值与阴性对照孔OD值比值> 2，被判定为多克隆抗体效价合格。将获得的HCV多克隆抗体，进行HCV假病毒颗粒(HCV-pseudotyped particles, HCVpp)中和实验,方法包括包装具有荧光素酶报告基因的la、lb、2a、3a、4a、5和6共七种不同基因型/亚型的HCVpp(参考文献:Tong Y, Zhu Y, Xia X, Liu Y, Feng Y, Hua X, Chen Z, Ding H, Gao L, Wang Y, FeitelsonMA, Zhao P，Qi ZT.J Virol，2011; 85:2793-2802.)，然后将 57 种 HCV 多克隆抗体，分别按不同的稀释比例，与七种不同基因型/亚型的HCVpp分别混合，然后加入至预接种Huh7.5细胞的96孔板中，72小时后检测荧光素酶活性，并与对照孔进行比较，以确定不同多克隆抗体中和 HCVpp 的活性(参考文献:Tarr AW, Urbanowicz RA, Jayaraj D, Brown RJ, McKeatingJA, Irving WL, Ball JK.J Virol2012; 86:2739-2749.)，进而确定保护性 B 细胞表位肽。实验结果表明，序列534-548 (以丙型肝炎病毒H77为参考标准，AccessionN0.NC_004102)为保护性B细胞表位肽，相应的氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN，将其命名为PUHI37，其相应的多克隆抗体能中和Ib基因亚型HCVpp。本发明还提供所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37在制备抗HCV药物及HCV预防性疫苗中的应用。以PUHI37表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物(如Balb/c小鼠)，制备多克隆抗体。或者，以PUHI37表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备出识 别PUHI37表位肽抗原的人源化单克隆抗体。将以上制得的多克隆抗体或单克隆抗体单独或联合用于阻断Ib基因型慢性HCV感染者肝移植术中及术后HCV再感染。本发明进一步提供HCVlb基因亚型中和性抗体，其是以所述的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物(如Balb/c小鼠)，制备的多克隆抗体。前述的中和性抗体，将PUHI37表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联(其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测)(参考文献=DarwishIA, Alzoman NZ, Abuhejail RM, El-Samani TE.Chem Cent J2012; 6:125.), KLH 偶联表位月太抗原和佐剂按等体积混合，乳化后，采用皮下注射法分3次免疫Balb/c小鼠，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。具体地，将PUHI37表位肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联(其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测)，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后，分别于第I天、15天、29天以颈背部多点皮下注射法免疫8-12周龄的Balb/c小鼠，共免疫3次，第一次使用氟氏完全佐剂，后两次使用不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500 μ I乳化后抗原，抗原量为50 μ g，免疫完成后，血清中的抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测。收集血清中的抗体，即得。
本发明通过重叠肽的方法，找到丙型肝炎病毒包膜蛋白新的线性保护性B细胞表位肽，并获得了能够中和丙型肝炎病毒Ib基因亚型HCVpp的保护性抗体，这些抗体识别的表位肽即为保护性B细胞表位肽，其氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN，位置为534-548(以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession N0.NC_004102)。该保护性B细胞表位肽的确定，为HCV治疗性抗体的研发和HCV预防性疫苗的研发提供了新的解决方案。
图1为本发明实施例1中筛选HCV包膜蛋白保护性B细胞表位肽的流程示意图。图2为本发明实施例2中保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体效价检测结果。图3为本发明实施例3中保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体的Ib基因亚型HCVpp中和实验结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37的获得1.1多肽抗原及多克隆抗体的制备在NCBI数据库中查找已报道的中国人Ib基因亚型HCV分离株HCV全长蛋白质序列数据，将收集到的序列 进行比对，找出包膜蛋白全长(以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession N0.NC_004102，氨基酸残基位置为192-747)的共识序列。从第192为氨基酸残基开始，人工合成长度为20个氨基酸的多肽，相邻多肽重叠10个氨基酸(例如第一条序列为192-211，第二条则为202-221，以此类推)。序列404-453,514-553和604-633包括CD81 (HCV侵入细胞的受体之一)可能的结合位点，在此序列范围内的每条合成多肽长度为15个氨基酸，相邻多肽重叠10个氨基酸。包膜蛋白跨膜区序列不在合成多肽范围之内，共合成57条多肽。将每条多肽分别与载体蛋白KLH和BSA偶联(参考文献=DarwishIA, Alzoman NZ, Abuhejail RM, El-Samani TE.Chem Cent J 2012; 6:125.)，其中，BSA 偶联多肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测，KLH偶联多肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后分别于第I天、15天、29天以颈背部多点皮下注射的方法免疫Balb/c小鼠(8-12周龄)，共3次。第一次氟氏完全佐剂，后两次为不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500 μ I乳化后抗原，抗原量为50 μ g。免疫完成后，血清中抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测，结果显示46条多肽获得相应多克隆抗体(抗血清)，11条多肽未产生相应抗体。1.2HCVpp 的制备HCVpp 由 HCV 包膜蛋白 E1E2 表达质粒和 HIV gag/pol (pLPl)、HIV rev (pLP2)、编码荧光素酶的pLenti6质粒一起共转染293T细胞获得。HCV包膜蛋白E1E2表达质粒是将HCV包膜蛋白E1E2编码序列克隆至pCR3.1载体构建而成，转染293T细胞后，可以表达出HCV包膜蛋白E1E2。本发明中所用7种不同基因型/亚型HCV包膜蛋白E1E2DNA编码序列来自于不同基因型HCV感染者，将这些DNA编码序列分别克隆至pCR3.1 (Invitrogen)载体，构建HCV包膜蛋白E1E2表达质粒，具体方法参考Lavillette D, Tarr AW, VoissetC，Donot P, Bartosch B,Bain C, Patel AH, Dubuisson J, Ball JK, Cosset FL.Hepatology2005;41:265-274.。HIV gag/pol (pLPl)、HIV rev (pLP2)、编码荧光素酶的 pLenti6 质粒购自invitrogen公司。HCVpp的制备过程包括:分别将7种不同基因型/亚型(基因la、lb、2a、3a、4a、5 和 6 型)的 HCV包膜蛋白 E1E2 表达质粒与 HIV gag/pol (pLPl)、HIV rev(pLP2)、编码荧光素酶的pLenti6质粒一起共转染293T细胞，转染后置于37°C细胞培养箱中，孵育48小时后收集含有HCVpp的细胞培养上清，即可获得7种不同基因型/亚型的HCVpp(参考文献:Tong Y, Zhu Y, Xia X, Liu Y, Feng Y, Hua X, Chen Z, Ding H, Gao L, Wang Y, FeitelsonMA, Zhao P, Qi ZT.J Virol，2011; 85:2793-2802.)。0.45 μ m 滤器过滤后，应用美国 PALL 公司IOOK超滤浓缩离心管浓缩20倍，即可用于HCVpp中和实验。1.3HCVpp中和实验和荧光素酶活检测将Huh7.5细胞预接种于含DMEM完全培养基的96孔板中，接种密度为IXlO4/孔。置于37°C细胞培养箱中孵育。第二天，将含HCVpp的上清(20 μ I/孔)和不同的多克隆抗体及阴性对照血清以不同的稀释比例混合(多克隆抗体及阴性对照血清稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800)，未加多克隆抗体及阴性血清的HCVpp上清亦作为对照，并加入终浓度为4 μ g/ml的聚凝胺(polybrene),总体积为100 μ I/孔(不足100 μ I用DMEM完全培养基补足至IOOy 1)，37°C孵育I小时，然后加至96孔板中，每个稀释浓度均做3个平行孔。37°C孵育5小时后，弃去细胞培养上清，更换为新鲜的完全DMEM培养基，37°C孵育72小时。用荧光素酶检测系统(Promega)检测，方法包括弃去细胞培养上清，PBS洗I遍，加入细胞裂解液20 μ I/孔，孵育10分钟后加入底物荧光素100 μ I/孔，放入至荧光发光检测仪读取数值。1.4中和性多克隆抗体和保护性B细胞表位肽的确定与未加多克隆抗体和阴性对照血清的对照孔相比，加入多克隆抗体后，荧光素酶活性值降低50%及以上 ，认为有中和活性。PUHI37相应抗体在1:50稀释比例时，能降低Ib基因亚型HCVpp感染细胞荧光素酶活性约50%，可以认定为该多克隆抗体为中和性多克隆抗体，其识别的表位肽，即PUHI37 (氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN)，为保护性B细胞表位肽。筛选HCV包膜蛋白保护性B细胞表位肽的流程示意图如图1所示。实施例2保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体制备及效价检测1.1保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体的制备将人工合成的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37表位肽分别与KLH和BSA偶联(参考文献:Darwish IA, Alzoman NZ, Abuhejail RM, El-Samani TE.Chem CentJ2012; 6:125.)，其中，BSA偶联表位肽用于免疫完成后Balb/c小鼠血清抗体滴度检测，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后分别于第I天、15天、29天以颈背部多点皮下注射的方法免疫Balb/c小鼠(8-12周龄)，共3次。第一次氟氏完全佐剂，后两次为不完全氟氏佐剂，每只小鼠每次500 μ I乳化后抗原,抗原量为50 μ go1.2保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体效价检测免疫完成后，血清抗体滴度采用间接ELISA方法进行检测。具体方法包括:将BSA偶联的相应表位肽抗原包被于96孔板中，用含10%山羊血清的IXPBS进行封闭，200 μ I/孔，37°C孵育I小时。用PBS洗3遍后，加入不同稀释比例的多克隆抗体(抗血清)，稀释比例分别为 I: 1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 和 1:128000，37。。孵育2小时。用PBST (含0.05%Tween20的1XPBS)洗4遍后，加入偶联辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体，37°C孵育I小时。PBST洗4遍后，加入底物室温孵育30分钟，2N HCL终止反应，测定490nm处的OD值。多克隆抗体的每个稀释浓度均做3个平行孔。分别以稀释比例和OD值为横纵坐标作图，如果线性关系良好且多克隆抗体在1:128000稀释浓度时OD值^ 0.25，且1:128000稀释浓度时多克隆抗体OD值与阴性对照孔OD值比值> 2，说明该多克隆抗体效价良好，可用于HCVpp中和实验。保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体效价检测结果如图2所示。实施例3B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体中和Ib基因亚型HCVpp感染Huh7.5细胞的检测将所获得的多克隆抗体进行HCVpp中和实验。方法包括将Huh7.5细胞预接种于含DMEM完全培养基的96孔板中，接种密度为IXlO4/孔。置于37°C细胞培养箱中孵育。第二天，将含HCVpp的上清(20 μ I/孔)和不同的多克隆抗体及阴性对照血清以不同的稀释比例混合(多克隆抗体及阴性对照血清稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800),未加抗体及阴性血清的HCVpp上清亦作为对照，并加入终浓度为4 μ g/ml的聚凝胺(polybrene)，总体积为100 μ I/孔(不足100 μ I用DMEM完全培养基补至100μ 1)，37°C孵育I小时，加至96孔板中，每个稀释浓度均做3个平行孔。37°C孵育5小时后，弃去细胞培养上清，更换为新鲜的完全DMEM培养基，37°C孵育72小时。用荧光素酶检测系统(Promega)检测，方法包括弃去细胞培养上清，PBS洗I遍，加入细胞裂解液20 μ I/孔，孵育10分钟后加入底物荧光素100 μ I/孔，放入至荧光发光检测仪读取数值。将检测结果进行统计分析，与未加多克隆抗体和阴性对照血清的对照孔相比，加入多克隆抗体后荧光素酶活性值降低50%及以上，认为具有中和活性。从而进一步验证该抗体对某一种或几种基因型/亚型的HCVpp是否具有中和活性。保护性B细胞表位肽534-548 (PUHI37)相应抗体的Ib基因亚型HCVpp中和实验结果如图3所不。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献Ndongo N, Berthillon P, Pradat P, Vieux C，Bordes I, Berby Fj Maynard M，etal.Association of Anti_ElE2Antibodies with Spontaneous Recovery or SustainedViral Response to Therapy in Patients Infected with Hepatitis C Virus.Hepatology 2010;52:1531-1542.
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Tarr AWj Urbanowicz RA, Jayaraj Dj Brown RJ，McKeating JAj Irving WLj BallJK.Naturally occurring antibodies that recognize linear epitopes in the aminoterminus of the hepatitis C virus E2protein confer noninterfering,additiveneutralization.J Virol 2012;86:2739-2749.
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权利要求
1.丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37，其特征在于，其氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN。
2.权利要求1所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37在制备抗HCV药物中的应用。
3.权利要求1所述丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37在制备HCV预防性疫苗中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以PUHI37表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备多克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以PUHI37表位肽作为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，采用杂交瘤技术和DNA重组技术，制备出识别PUHI37表位肽抗原的人源化单克隆抗体。
6.HCVlb亚型中和性抗体，其是以权利要求1所述的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37为免疫原，辅以佐剂免疫实验动物，制备的多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的中和性抗体，其特征在于，将PUHI37表位肽与载体蛋白KLH偶联，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化后，采用皮下注射法分3次免疫Balb/c小鼠，免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。
8.根据权利要求7所述的中和性抗体，其特征在于，将PUHI37表位肽与载体蛋白KLH偶联，KLH偶联表位肽抗原和佐剂按等体积混合，乳化完全后，分别于第I天、15天、29天以颈背部多点皮下注射法免疫8-12周龄的Balb/c小鼠,共免疫3次,第一次使用氟氏完全佐齐U，后两次使用不 完全氟氏佐剂，每只小鼠每次注射500 μ I乳化后抗原，抗原量为50 μ g，免疫完成后，收集血清中的抗体,即得。
全文摘要
本发明提供了一种新型的丙型肝炎病毒B细胞表位肽PUHI37，采用重叠肽的方法，找到丙型肝炎病毒包膜蛋白新的线性保护性B细胞表位肽，并获得了能够中和丙型肝炎病毒1b基因亚型HCVpp的保护性抗体，这些抗体识别的表位肽，其氨基酸组成为TDVLLLNNTRPPQGN，位置为534-548(以丙型肝炎病毒H77为参考标准，Accession No.NC_004102)。该保护性B细胞表位肽的确定，为HCV治疗性抗体的研发和HCV预防性疫苗的研发提供了新的解决方案。
文档编号A61P31/14GK103145807SQ20131006217
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者魏来, 刘如玉 申请人:北京大学人民医院