专利名称：抑制上皮性卵巢癌肿瘤生长的siRNA及其重组载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制上皮性卵巢癌特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。
背景技术：
上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer, EOC)是最常见的卵巢癌，约占80-90%，在妇科生殖器官恶性肿瘤中，虽然发病率位居第三，仅次于宫颈癌与子宫内膜癌，但死亡率高达70%，居首位。据统计，女性一生中发生卵巢癌的危险率约1.45%，死于卵巢癌的危险性为1%。由于卵巢解剖位置复杂，位于盆底深部，这给卵巢癌的早期诊断造成诸多困难。目前EOC的治疗以手术为主,辅以放化疗等。但由于转移前常无症状,多数EOC在确诊时已属于晚期，致使手术难度高、范围广，病灶往往不能全部清除，再加上放化疗作用局限，导致术后复发率高，预后极差。据近20年的统计资料，EOC的发病率逐年递增，但治疗效果一直未能改善，5年生存率徘徊于30-40%。EOC已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤，如何改善EOC的治疗效果是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。大量文献报道，分子靶向药物和化疗联合应用是目前提高恶性肿瘤患者生存率最有前景的治疗方法。2003年,Rangel等人利用SAGE数据库分析、基因克隆、Northern Blot、RACE技术等，在EOC组织中发现一个特异性转录本H0ST2(Rangel L.B., Sherman-Baust C.A., WernyjR.P., Schwartz D.R., Cho K.R.，Morin P.J..Characterization of novel human ovariancancer-specific transcripts (HOSTs) identified by serial analysis of geneexpression.0ncogene.2003，22 (46): 7225-7232.)。H0ST2 长度约 3000 个碱基，没有开放式可读框，不能编码蛋白质，属于长链非编码RNA (Long noncoding RNA，LncRNA)。长链非编码RNA (Long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度大于200个碱基的功能性RNA分子，占人类基因组4-9%，缺乏编码蛋白的能力，在多种层面上调控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。目前许多研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关(Lee，J.T..Epigenetic regulation by long noncoding RNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.)。目前有文献报道，LncRNA特异性表达可作为治疗肿瘤潜在靶点，如肝细胞性肝癌中
的 LncRNA-MVIHCYuanj S.X.，Yang, F.，Yangj Y.，Taoj Q.F.，Zhang, J.，Huang, G.，Wang, R.Y.，Yang, S.，Huoj X.S.，Zhang, L.，Wang F.，Sun S.H.，Zhou W.P..Long noncodingRNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinomapromotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinomapatients’poor recurrence-free survival after hepatectomy.Hepatology.2012.56(6):2231-2241.)。但目前尚无H0ST2的深入研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列，并构建含有抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列的重组载体，本发明的另一目的是提供该siRNA2和重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。本发明的第一方面，是寻找能抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列。本发明人通过大量前期工作发现:H0ST2与上皮性卵巢癌的增殖和迁移这两个肿瘤生长相关的生物学功能密切相关。首先，我们以卵巢良性肿瘤(Benign Ovarian Tumor, OBT)组织为对照组(43例，采集自201(Γ2012年上海市长海医院妇科收治的OBT患者手术标本)，以同期采集的确诊为EOC患者的术中标本为实验组(39例)，验证了 H0ST2在EOC组织中表达的特异性，符合上述2003年文献报道(图1)。然后，设计、合成并筛选H0ST2特异性的高效干扰序列SiRNAf 3，分别转染进0VCAR-3上皮性卵巢癌细胞中，结果发现siRNA2抑制H0ST2表达的干扰效果最明显(图2);本发明提供了一种抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列(siRNA2)，其序列如下:正义链5’ -GACUAAACAAG⑶CUUAA UUU-3’ (SEQ ID NO:4)反义链5’ -AUUAAGACCUUGUUUAGUCUU-3’ (SEQ ID NO:5)。本发明的第二方面，是构建含有抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列的重组载体，该重组载体采用真核表达载体pLK0.1puro ο构建方法如下:1、合成 H0ST2_sh2 片段；选择合适的酶切位点Age I和EcoR I，根据该siRNA2的序列，设计其shRNA2序列如下，构建到真核表达载体pLK0.1puro中。正义链5’ CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG3’ (SEQ ID NO:8)反义链5' AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG —ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A3’ (SEQ ID NO:9)2、退火得到H0ST2_sh2cDNA基因片段；3、用真核表达载体pLK0.1puro构建pLK0.l-H0ST2_sh2重组表达载体(图3和4)，经典分子生物学方法参见《分子克隆实验指南》，美国冷泉港出版社。进一步地，本发明还将pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒转染入0VCAR-3细胞并且利用G418加压筛选，建立0VCAR-3/H0ST2-sh2T真核表达细胞株。具体方法为:将以上重组载体转染入美国培养物保存中心(ATCC)建系的0VCAR-3上皮性卵巢癌细胞中，然后加G418 (氨基糖苷类抗生素)筛选两次，每次挑取单克隆大量扩增0VCAR-3细胞，最终得到较高纯度的0VCAR-3/H0ST2-sh2T。本发明的第三方面，提供了上述的siRNA2和重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。本发明将构建的重组载体转染EOC细胞，抑制EOC细胞的生长，以达到治疗EOC的目的。体外实验:通过脂质体转染的方式，将pLK0.1_sh2转入0VCAR-3细胞中，利用细胞划痕实验、Transwe11实验和CCK-8检测，发现细胞的迁移和增殖能力均明显下降(图5_7)。
体内试验，建立EOC裸鼠模型后，待肿瘤生长至直径约5mm时，定期将上述质粒直接打入异种移植的瘤体内，最终发现肿瘤生长明显受限，甚至可以逆转缩小。裸鼠异种移植瘤模型的构建及相关实验技术和方法，申请人已发表相关文章(Hu T.，Liu S.,Breiter
D.R.，Wang F.，Tang Y.，Sun S..0ctamer4Small Interfering RNA Results in CancerStem Cell-Like Cell Apoptosis.Cancer Res.2008.68 (16):6533-6540.)。通过体内、体外实验结果证明:本发明的重组载体可以抑制EOC细胞中特异性高表达的H0ST2，从而抑制肿瘤生长。因此本发明提供的siRNA2和重组载体为临床治疗EOC提供了新的基因治疗药物。
图1:E0C患者和OBT患者术中标本组织中H0ST2的相对表达量。图2:H0ST2特异性干扰序列siRNAl_3最佳干扰效果筛选。图3:pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒及插入酶切位点示意图。图4:小发卡shRNA示意图。U6启动子知道下游小发卡shRNA的转录。序列包括21个siRNA2正义链碱基，“Loop”为酶切位点识别序列，21个siRNA反义链碱基。图5:转染pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒前后细胞划痕愈合情况，其中A为空白对照组；B为转染pLK0.l-H0ST2_sh2重组质粒的细胞。图6:转染pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒前后细胞迁移过膜的细胞个数统计。其中A为100倍电镜或光镜图；B为迁移过膜的细胞个数统计图。
图7:转染pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒前后细胞增殖曲线。图8:0VCAR-3细胞株和0VCAR-3/H0ST2_sh2T细胞株中H0ST2的相对表达量。图9:pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒注射与未注射组裸鼠异种瘤体大小比较。图10:pLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒注射与未注射组裸鼠的生存期比较。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1:构建pLK0.l-H0ST2-sh2真核表达载体1.1所需试剂限制性内切酶Age I和EcoR I及相应Buffer、T4连接酶及其缓冲液、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购于TaKaRa公司(大连宝生物工程有限公司)。真核表达载体选择常规RNAi载体pLK0.1puro (Plasmid8453)，源于全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene01.2设计、合成并筛选H0ST2的特异性siRNA。H0ST2cDNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。根据上述序列设计并合成特异性siRNAl-3 (均由上海Invitrogen公司完成):
权利要求
1.一种抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQ ID N0:4或5所示。
2.一种含有如权利要求1所述的抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体采用真核表达载体pLK0.1puro 构建。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，构建方法如下: A、合成H0ST2-sh2片段； 选择合适的酶切位点Age I和EcoR I，根据该siRNA2的序列，设计其shRNA2序列如下: 正义链 5’ CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG3’ (SEQ ID NO:8) 反义链 5’ AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG-ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A3，(SEQ ID N0:9)； B、退火得到H0ST2-sh2cDNA基因片段； C、用真核表达载体pLK0.1puro构建pLK0.l-H0ST2_sh2重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，构建pLK0.l-H0ST2-sh2重组表达载体后，将PLK0.l-H0ST2-sh2重组质粒转染入0VCAR-3细胞并且利用G418加压筛选，建立0VCAR-3/H0ST2-sh2T真核表达细胞株。
6.一种抑制上皮性卵巢癌H0ST2基因表达的干扰序列在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。
7.—种如权利要求2至5任一所述的重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，上皮性卵巢癌(EOC)是最常见的卵巢癌，在妇科生殖器官恶性肿瘤中，虽然发病率位居第三，仅次于宫颈癌与子宫内膜癌，但死亡率高达70%，居首位。本发明筛选到一种抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQ ID NO:4或5所示。本发明还构建了含有该干扰序列的重组载体。本发明的重组载体通过体内、体外实验结果证明，可以抑制EOC细胞中特异性高表达的HOST2，从而抑制肿瘤生长。本发明提供的siRNA和重组载体为临床治疗EOC提供了新的基因治疗药物。
文档编号A61P35/00GK103146703SQ20131006475
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者刘善荣, 惠宁, 高原, 刘淑鹏, 余喜亚, 胡晶晶 申请人:中国人民解放军第二军医大学