Ho-1和ho-1的诱导剂作为抑制prrs病毒感染的新型阻断剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种抑制PRRS病毒感染细胞的血红素加氧酶1(heme?oxygenase1，HO-1)及HO-1的诱导剂钴原卟啉(Cobalt?Protoporphyrin，CoPP)和高铁血红素(hemin)作为阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法。猪HO-1基因在高致病性PRRSV感染后显著上调表达，而在经典PRRSV感染后显著下调表达。PRRSV的易感细胞非洲绿猴肾细胞系的HO-1基因在高致病性PRRSV感染后也显著上调表达，而在经典PRRSV感染后也显著下调表达。利用CoPP和hemin诱导Marc-145和猪肺泡巨噬细胞(PAM)的HO-1表达。结果表明两者都显著诱导了HO-1的表达，抑制了PRRSV感染Marc-145和PAM细胞。
【专利说明】H0-1和HO-1的诱导剂作为抑制PRRS病毒感染的新型阻断剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及HO-1和HO-1的诱导剂作为抑制PRRS病毒感染的新型阻断剂。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗名为猪蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的对全球养猪业危害极大的猪重要传染病。由于PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征，临床上常与其它病原混合感染，目前对于该病的致病机制和免疫机理尚不清楚，所以至今仍无确实有效的防制措施。因此，急需开发新的抗PRRS病毒感染的药物，有效防治猪蓝耳病的发生。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术的不足，本发明提供一种抑制PRRS病毒感染细胞的HO-1及HO-1的诱导剂CoPP和hemin作为阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法。上述的各种阻断剂都对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRS疾病兽药。
[0004] 申请人:研究发现猪血红素加氧酶I (heme oxygenasel, H0-1)基因在高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染后显著上调表达，而在经典PRRSV(N-PRRSV)感染后显著下调表达。同时也发现，PRRSV的易感细胞非洲绿猴肾细胞系(Marc-145)的H0-1基因在HP-PRRSV感染后也显著上调表达，而在N-PRRSV感染后也显著下调表达。提示HP-PRRSV与N-PRRSV调控H0-1基因表达的方式不同。
[0005] 申请人:分别利用H0-1的激动剂钴原卟啉(CoPP)和高铁血红素(hemin)诱导Marc-145和猪肺泡巨噬细 胞(PAM)HO-1的表达。结果表明，CoPP和hemin都显著诱导了H0-1的表达，而且显著的抑制了 PRRSV主要包括经典毒株(代表毒株为Ch-1a和Ch-1R)和高致病性毒株(代表毒株为SD-16和JXA-1)感染Marc-145和PAM细胞。同时经发明人的试验研究，发现CoPP和hemin可以作为阻断PRRSV感染细胞的阻断剂，这在之前的研究中也一直未见应用。
[0006]证明H0-1的激动剂-钴原卟啉(CoPP)和和高铁血红素(hemin)诱导H0-1表达，进而抑制PRRSV感染细胞的具体方法为:
[0007]首先应用H0-1的激动剂-CoPP和hemin诱导Marc-145和PAM细胞的H0-1，结果表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的促进了细胞H0-1的表达。
[0008]紧接着发明人检测了其对PRRSV感染的影响。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白(N)的表达。通过TCID5tl检测了 PRRSV感染后细胞上清的病毒滴度，结果表明，随着CoPP和hemin浓度的升高，显著的降低了 PRRSV的病毒滴度。
[0009]进一步的，采用间接免疫荧光(IFA)和流式细胞术(FACS)检测了其对PRRSV感染的影响。结果和前面一致性的表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的复制，显著性的降低了 PRRSV阳性细胞的比例。
[0010]最后，通过特异性过表达H0-1，采用实时荧光定量PCR和Western blot, TCID50,IFA和FACS检测了 HO-1对PRRSV感染的影响。结果和CoPP和hemin处理一样，过表达HO-1抑制了 PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白(N)的表达、显著的降低了 PRRSV的病毒滴度，并显著降低了 PRRSV阳性细胞的比例。
[0011]综上所述，血红素加氧酶l(heme oxygenasel, HO-1)及血红素加氧酶I(HO-1)的诱导剂_钴原卟啉(Cobalt Protoporphyrin, CoPP)和高铁血红素(hemin),均对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。从而为PRRS的防治提供了一个全新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1CoPP呈浓度依赖性抑制PRRSV的N蛋白表达。
[0013]图2IFA法检测CoPP呈浓度依赖性显著降低PRRSV阳性细胞的比例。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图对本发明做详细说明。
[0015]实施例1 CoPP和hemin的配制
[0016]分别将CoPP和hemin (二者均购自美国Sigma公司)溶解于0.2mol/L的NaOH，用lmol/L的HCL调pH值至7.4，再用PBS倍比稀释，用0.2 μ m的滤膜过滤除菌，分装后用锡箔纸包裹，贮存于_80°C备用。
[0017]实施例2 CoPP和hemin处理PRRSV感染的细胞
[0018]Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPM1-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50 μ g/ml，庆大霉素50 μ g/ml，10 %胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37°C，5% CO2的加湿培养箱中培养成70%~80%汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1M0I的PRRSV，4°C吸附I小时(h)，37°C孵育lh，弃去未吸附的病毒液，用Iml PBS/孔洗涤一次。每孔分别加入2ml包含上述实施例1稀释好的不同浓度(O μΜ,20μ Μ、40 μ Μ、60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ)的CoPP的培养基，放入37°C ,5% CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染48h，分别收集细胞上清和细胞。
[0019]Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPM1-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50 μ g/ml，庆大霉素50 μ g/ml，10 %胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37°C，5% CO2的加湿培养箱中培养成70%~80%汇合度，弃去培养基。每孔接Λ 0.1Μ0Ι的PRRSV，4°C吸附lh，37°C孵育lh，弃去未吸附的病毒液，用Iml PBS/孔洗涤一次。每孔分别加入2ml包含上述实施例1稀释好的不同浓度(5 μ MUO μ Μ、50 μ Μ)的hemin的培养基，放入37°C，5% CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染36h，分别收集细胞上清和细胞。
[0020]实施例3 CoPP和hemin抑制PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白的表达
[0021]实时荧光定量PCR检测H0-1和PRRSV的N基因表达:胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4°C，500g，离心lOmin，弃去上清。每管加入Iml TRIzol (购自 Invitrogen 公司)，参照说明书抽提 RNA。用 PrimeScript RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒(购自TAKARA公司)将RNA反转录成cDNA。最后应用SYBRGREEN试剂盒(购自瑞士的Roche公司)和上述反转录的cDNA模版及设计好的HO-1和N基因的上下游引物，在 Applied Biosystems 的 StepOnePlus Real-Time PCR System 上进行实时荧光定量PCR检测。反应条件为:95°C IOmin进行变性；95°C 15sec，60°C lmin，反应40个循环；95°C 15sec,60°C lmin，95°C 15sec进行溶解曲线分析。检测结果见表1。表I结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的促进了细胞HO-1的表达，并呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表达。
[0022]表1.不同浓度CoPP处理对HO-1和PRRSV的N基因表达的影响
CoPP 浓度(PM)O 20 40 60 80 100
[0023]HO-1 基因的相对表达量0.75 3.946 7.335 8.315 14.506 13.017
PRRSV 的N基因的相对表达觉 I 0.957 0.533 0.132 0.034 0.018
[0024]Western blot检测PRRSV的N蛋白的表达:胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4°C，500g，离心lOmin，弃去上清。沉淀用200 μ LNP40裂解液冰上裂解30min ;12000g离心IOmin,除去细胞碎片,取上清,5 μ I裂解样品+45 μ L PBS, PierceBCA proteinAssay Kit测定总蛋白浓度，进行Western blot检测。每个泳道40 μ g总蛋白，在Bio-Lab电泳仪150V电压进行SDS-PAGE ;转膜后，将膜小心取出，封闭液4°C封闭过夜；弃封闭液，用洗脱液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗mouse monoclonal ant1-Nprotein antibody(购自 Jeno Biotech Inc), ant1- a -tublin antibody 室温孵育 Ih ;弃一抗，用PBST洗膜，5minX4次；加入二抗:HRP-Goat@Mouse IgG，室温孵育Ih ;弃二抗，用PBST洗膜，5minX4次；PBS洗膜，5minX4次；最后进行ECL发光显色。如图1的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖 性的抑制PRRSV的N蛋白表达。
[0025]也采用和CoPP —样的方法检测了 hemin对PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白的表达的影响。实时荧光定量PCR检测结果表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表达，尤其是50 μ M的hemin处理，与对照相比，极显著降低了 PRRSV的N基因的表达水平。Western blot检测结果同样也表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSVN蛋白的表达，尤其是50 μ M的hemin处理后，几乎观察不到PRRSV的N蛋白的表达。
[0026]实施例4 CoPP和hemin对PRRSV感染滴度的影响
[0027]将实施例2中收集的细胞培养上清，用含2% FBS的细胞培养基作10倍系列稀释KT1至10_8，接种在长满Marc-145细胞70%~80%汇合度的96孔培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.lml，37°C吸附Ih后每孔再加入0.1ml维持液，37°C、5% CO2培养箱中静置培养3-7d，每天观察细胞病变(CPE)。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID5tlt5表2的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的降低了 PRRSV的病毒滴度，O μ M的CoPP处理后，PRRSV的TCID5tl为的 3.16X 105/mL ;而 100 μ M 的 CoPP 处理后，PRRSV 的 TCID50 为的 1.37X 103/mLo
[0028]表2.不同浓度CoPP处理对PRRSV病毒滴度的影响
【权利要求】
1.一种抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂，选自具有如下特征之一的阻断剂: (a)血红素加氧酶I(HO-1)； (b)血红素加氧酶I(H0-1)的诱导剂，即钴原卟啉(CoPP)； (c)血红素加氧酶I(HO-1)的诱导剂，即高铁血红素(hemin)。
2.根据权利要求1所述的抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂，其特征在于:抑制PRRS病毒感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAM)。
3.根据权利要求1所述的抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂，其特征在于:所述血红素加氧酶I (H0-1)来源于猪或猴的HO-1。
4.如权利要求1所述的抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂，用于开发成防治PRRS疾病的 药物。
【文档编号】A61K38/41GK103463626SQ201310066567
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年3月3日 优先权日:2013年3月3日
【发明者】肖书奇, 周恩民 申请人:西北农林科技大学