专利名称：一种结核亚单位疫苗复合佐剂、以其构建的结核亚单位疫苗及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种结核亚单位疫苗复合佐剂、以其构建的结核亚单位疫苗及制备方法和应用。
背景技术：
预防性结核疫苗一卡介苗(Bacille Calmette Gu6rin,BCG)对成人的保护力不稳定，因此研制新型的结核疫苗迫在眉睫，尤其是成本低廉，安全性高、不受环境分枝杆菌影响的蛋白疫苗引起人们广泛关注。但是蛋白疫苗自身免疫原性较减毒疫苗弱，所以必须选择合适的佐剂以增强疫苗的免疫效果。70多年来，铝佐剂作为唯一一个注册佐剂在世界范围广泛应用。另外一种佐剂，MF59在一些国家作为预防流感和甲肝疫苗的佐剂，已经注册。但是，以上两种佐剂主要介导体液免疫，对于以细胞免疫为主的结核病却效果不佳。近几年来，随着佐剂技术的发展，一系列能诱导较强细胞免疫的佐剂应运而生。如Ag85B-TB10.4、Ag85B_ESAT_6和Mtb72F融合蛋白分别在一种阳离子多肽KLKL5KLK与寡脱氧核苷构成的佐剂(IC31)和由单磷酰脂质A和皂角苷QS-21构成的水-油乳浊液(AS02A)介导下，可诱导有效的免疫保护。一些新技术的应用，如纳米技术的进步，也推动了佐剂的发展，如以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)为载体的佐剂联合融合蛋白 TB10.4_Ag85B,能增强T细胞免疫反应。由阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(DDA)和trehalose6, 6-dibehenate (TDB)构成了一种新型的复合佐剂CAF01,并已经用于结核融合蛋白Ag85B-ESAT-6。动物实验显示保护效果较理想，已进入临床一期。从以上各个复合佐剂不难看出佐剂发展的一个趋势，即单个成分的佐剂可能将被几种成分的联合佐剂所取代，因单个佐剂的免疫效应有限，不同的佐剂之间又各有特点，所以合理搭配不同的佐剂，已成为研发新型佐剂的趋势。已证实MH在阳离子脂质体二甲基三十六烧基铵(dimo-thylidioctylammonium bromide, DDA)与海藻糖二霉菌酸脂(Trehalose 6, 6-dimycolate, TDM)复合佐剂的辅助下具有较强的免疫原性和较高的保护效率，但TDM售价比较昂贵，难以大量推广。近期研究表明佐剂增强T、B细胞应答，不是直接作用于其本身，而是通过固有免疫的某些成分介导来实现。模式识别受体(PRRs)是固有免疫中免疫受体的代表，由有限数量的胚系基因编码，进化上十分保守，不受体细胞突变的影响，对生物体的生存十分重要，因此PRRs是佐剂靶位的理想选择。Toll样受体(TLR)是识别病原体相关分子模式(PAMP)最为重要的PRRs之一，在人类中已经发现11中，各自识别PAMP中的不同成分和分子
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种以DDA为基础，加入TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395、TLR3配体PolyICLC组合制备的安全又能辅助诱导细胞免疫反应的蛋白质亚单位疫苗佐剂。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种结核亚单位疫苗复合佐剂，所述复合佐剂包含有阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA、TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395 和 TLR3 配体 PolylCLC。进一步的，上述的一种结核亚单位疫苗复合佐剂，所述复合佐剂中，阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA、TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和TLR3配体PolyICLC的重量比为 10:1:lo本发明的第二个目的是提供了上述一种结核亚单位疫苗复合佐剂的制备方法，包括以下步骤:
1)将阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA用PBS缓冲液配置为2.5mg/ml浓度，置于80°C水浴IOmin后冷却至室温，得到DDA组分溶液；
2)TLR3配体PolylCLC由Poly1:C、多聚左旋赖氨酸和羧甲基纤维素复合而成，配制比按重量计为4:3:10 ；
3)将TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和步骤2)得到的TLR3配体PolyICLC以PBS缓冲液分别溶解至lmg/ml，再加入步骤I)得到的DDA组分溶液，制得结核亚单位疫苗复合佐剂。本发明的第三个目的是提供了上述一种结核亚单位疫苗复合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用。进一步的，上述的一种结核亚单位疫苗复合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用，所述应用是将结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX经PBS稀释至0.4mg/ml后加入权利要求I或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂，并充分乳化制备得到结核亚单位疫苗。本发明的第四个目的是提供了一种结核亚单位疫苗，所述结核亚单位疫苗是由结核杆菌融合细胞和如权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂混合构建的。进一步的，上述的一种结核亚单位疫苗，所述结核亚单位疫苗中的结核融合细胞为结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX。本发明的第五个目的是提供了一种结核亚单位疫苗的制备方法，是将结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX经PBS稀释至0.4mg/ml后加入权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂，并充分乳化得到的。本发明的第六个目的是提供了一种结核亚单位疫苗在结核病防治中的应用。本发明的有益效果为:本发明提供的结核亚单位疫苗复合佐剂，增强了结核分枝杆菌融合蛋白的免疫原性，有助于结核融合蛋白诱导Thl型抗结核免疫应答，其三个成分主要特性如下:
1.CpG-ODN:含有未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG)经内吞作用进入细胞，与细胞浆中的TLR9相互作用，刺激机体的免疫系统，激活多种免疫细胞，产生多种细胞因子，具有诱导激活固有免疫应答和适应性免疫应答的能力，作为佐剂能诱导强烈的Thl型免疫应答，增加细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活性，被用作疫苗佐剂和免疫治疗剂；
2.PolylCLC: PolyIC是一种合成的双链RNA，与TLR3特异结合，能够激活固有免疫应答，刺激适应性免疫应答向细胞免疫方向发展，PolyICLC由PolylC、聚左旋赖氨酸和羧甲基纤维素复合而成，具有促进细胞应答 的活性，在体内可延长佐剂效应；
3.DDA=DDA是一种阳离子脂质体，通过储存抗原延缓其释放，诱导持续的免疫反应，DDA亦可减少DNA及RNA的胞外降解，有利于核酸进入内含体区室，与其位于内含体区室的TLR结合，从而激活固有免疫。
图1为疫苗免疫小鼠抗体水平检测(以吸光度值计)。其中，A、B、C:抗原MH蛋白包被；D、E、F:抗原HspX蛋白包被，采用ELISA方法检测血清抗MH和HspX的IgGl、IgG2b、IgG2c抗体水平，抗原包被浓度分别为:MH 5 μ g/ml、HspX 5 μ g/mlο图2为疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞IFN- Y分泌水平(n=4)。其中，A:抗原MH刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞；B:抗原HspX刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞，ΜΗ+CpG+PolyICLC+DDA组分泌IFN-Y的小鼠脾淋巴细胞数最高，>〈0.05 ；MH+CpG+DDA组 及ΜΗ+PolyICLC+DDA组分泌IFN- Y的细胞数分别高于MH+CpG组及MH+PolyICLC, *P〈0.05 ；MH+CpG+PolyICLC 组分泌 IFN- Y 的细胞数高于 MH+CpG 组和ΜΗ+PolyICLC 组，〈0.05 ;与对照组 BCG 和 PBS 组比较，除 MH+CpG 组和 ΜΗ+PolyICLC 组外，其余各实验组均能分泌较高水平的IFN- Y，*P <0.05。图3为疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞IL-4分泌水平(n=4)。其中，C:抗原HspX刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞；D:抗原MH刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞。ΜΗ+CpG+PolyICLC+DDA组分泌IL-4的小鼠脾淋巴细胞数最高，>〈0.05 ；MH+CpG+DDA组及MH+PoIyICLC+DDA组分泌IL-4的细胞数分别高于MH+CpG组及MH+Po lyICLC, *P <0.05 ;与对照组 BCG 和 PBS 组比较，除 MH+CpG 组和 ΜΗ+PolyICLC 组外，其余各实验组均能分泌较高水平的IFN- Y，Ψ〈0.05。
具体实施例方式实施例1:
1.实验材料:
融合蛋白MH由兰州大学制备，制备方法详见专利申请《结核分枝杆菌融合蛋白Mtbl0.4-Hspl6.3的构建、表达和纯化方法及其应用》(申请号为CN201010613320.6，公开号为CN102154324A) ；CpG-ODN由上海生工合成；
聚肌胞(poly inosinic:polycyt idyl ic acid, Poly1: C)购自 Sigma-Aldrich 公司，商品号 CAS42424-50-0 ；
二甲基三十六烷基铵(DDA)购自Sigma-Aldrich公司，商品号CAS3700-67-2 ；
卡介苗(BCG，丹麦 株)，由兰州生物制品研究所馈赠；
PBS由兰州大学以常规制备方法制备。2.实验动物:C57BL/6小鼠。3.实验动物分组(共八组):
A.PBS (200 μ I.次.只)；
B.BCG (5X IO6CFU/只)；
C.MH (20 μ g.次.只)+ CpG (50 μ g.次.只)；
D.MH (20 μ g.次.只)+CpG (50 μ g.次.只)+DDA (250 μ g.次.只)；E.MH (20 μ g.次.只)+PolylCLC (50 μ g.次.只)；
F.MH (20 μ g.次.只)+PolyICLC (50 μ g.次.只)+DDA (250 μ g.次.只)；
G.MH (20 μ g.次.只)+CpG (25 μ g.次.只)+PolyICLC (25 μ g.次.只)；
H.MH (20 μ g.次.只)+CpG (25 μ g.次.只)+PolyICLC (25 μ g.次.只)+DDA(250 μ g.次.只)。4.制备疫苗:
亚单位疫苗的配制:DDA用PBS配制成2.5 mg/ml，80°C水浴lOmin，冷却至室温；PolyICLC由Poly1: C、多聚左旋赖氨酸和羧甲基纤维素复合而成，配制比为4:3:10 ;用PBS将CpG-0DN2395、PolyICLC分别溶解至lmg/ml，融合蛋白MH用PBS稀释至0.4 mg/ml ;各组疫苗充分乳化，最终疫苗溶液呈均一乳油状。5.免疫动物:
BCG (5X106 CFU)组于第I周腹股沟皮下免疫I次，亚单位疫苗各组分别于第1、4、7周腹股沟皮下免疫(200/只)。6.免疫指标测定:
最后一次免疫后6周(第13周)，8组各取4只采血检测体液免疫指标，动物处死无菌分离脾脏淋巴细胞检测细胞免疫指标。(I)体液免疫检测:取血清用ELISA法检测血清抗体表达水平。用HspX和MH蛋白(5 μ g/ml)包被 96 孔板(100 μ I / well) 4 °C过夜。用 PBST 溶液 300 μ I / well 洗板5次。从1:100开始至1:12800。加入对倍稀释的血清样品，37°C放置I h。洗板后，加入200 μ I / well 的 1:15000, 1:10000、1: 5000 稀释的兔抗鼠 lgGl、IgG2a、IgG2c，37°C放置I h。洗板后，加入100μ I / well TMB显色液，室温避光反应15min显色后，加入50 μ I /well终止液(2mol/L的H2S04)终止反应；在450 nm检测A值。如图1所示，结果表明:分别经MH及HspX抗原刺激后，MH+CpG +PoIyICLC+DDA组分泌IgG最高。与对照组BCG和PBS组比较，各亚单位疫苗组均增强了 IgG (P〈0.05)。说明本发明的佐剂DDA+CpG+PolylCLC可辅助结核抗原引起较强的体液免疫反应。(2)免疫小鼠脾脏分泌IFN- Y及IL-4的淋巴细胞数:应用ELISP0T方法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原分泌IFN-Y的水平。小鼠最后一次免疫五周后无菌分离脾脏，应用ELISP0T技术检测脾细胞受到HspX蛋白，MH蛋白刺激后IFN-Y及IL-4的表达:ELISP0T板预先用IFN-Y或IL-4抗体包被过夜，无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，经淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。加终浓度5X IO6AiL淋巴细胞入96孔ELISP0T板中，分别给予HSPX蛋白、MH蛋白(5 μ g/ml)刺激。共同孵育48小时后，按ELISP0T操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。图2结果表明:分别经MH及HspX抗原刺激后，ΜΗ+CpG+PolyICLC+DDA组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN- Y的水平在8组中最高，与其他各组相比均有统计学差异(P〈0.05);同时，MH+CpG+DDA 组分泌 IFN- Y 的细胞数高于 MH+CpG 组(Ρ〈0.05)，MH+PoIyICLC+DDA 组分泌 IFN-Y 的细胞数高于 MH+PolyICLC(P〈0.05); ΜΗ+CpG+PolyICLC 组分泌 IFN-Y 的细胞数高于MH+CpG组和ΜΗ+PolyICLC组(P〈0.05);与对照组BCG和PBS组比较，除MH+CpG组和MH+PoIyICLC组外，其余各实验组均能分泌较高水平的IFN- y (P<0.05)。图3结果表明: 分别经HspX及MH抗原刺激后，ΜΗ+CpG+PolyICLC+DDA组小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4的水平在8组中最高，与其他各组相比均有统计学差异(P〈0.05);同时，MH+CpG+DDA 组分泌 IL-4 的细胞数高于 MH+CpG 组(P〈0.05)，MH+PoIyICLC+DDA 组分泌IL-4的细胞数高于ΜΗ+PolyICLC (P<0.05);与对照组BCG和PBS组比较，除MH+CpG组和MH+PoIyICLC组外，其余各实验组均能分泌较高水平的IL_4 (P<0.05)。证明本发明的CpG+PolylCLC+DDA佐剂增强了结核分枝杆菌融合蛋白的细胞免疫反应；CpG和PolyICLC具有佐剂协同作用；DDA有助于CpG和/或PolyICLC诱导特异性细胞免疫应答。(3)免疫小鼠脾脏分泌IFN- Y及IL-4淋巴细胞数的比较:Thl细胞免疫反应是结核病的主要保护性免疫机制，其产生的IFN-Y的水平与结核保护性免疫反应相关，而IL-4主要由Th2产生，可诱导体液免疫应答。结果表明:分别在抗原MH或HspX的刺激下，CpG, PolylCLC、DDA两两组合或三者组合作为佐剂的疫苗组分泌IFN-Y的淋巴细胞数均显著高于分泌IL-4的淋巴细胞。证明CpG, PolylCLC、DDA构建的复合佐剂有助于结核融合蛋白MH诱导Thl型抗结核免疫应答。如表I所示为分泌IFN- Y及IL-4淋巴细胞数的比较。
表I
权利要求
1.一种结核亚单位疫苗复合佐剂，其特征在于，所述复合佐剂包含有阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA、TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和TLR3配体PolylCLC。
2.根据权利要求1所述的一种结核亚单位疫苗复合佐剂，其特征在于，所述复合佐剂中，阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA、TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和TLR3配体PolyICLC的重量比为10:1:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种结核亚单位疫苗复合佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA用PBS缓冲液配置为2.5mg/ml浓度，置于80°C水浴IOmin后冷却至室温，得到DDA组分溶液； 2)TLR3配体PolyICLC由Poly1: C、多聚左旋赖氨酸和羧甲基纤维素复合而成，配制比按重量计为4:3:10 ； 3)将TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和步骤2)得到的TLR3配体PolyICLC以PBS缓冲液分别溶解至lmg/ml，再加入步骤I)得到的DDA组分溶液，制得结核亚单位疫苗复合佐剂。
4.根据权利要求1或2所述的一种结核亚单位疫苗复合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的结核亚单位疫苗复合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述应用是将结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX经PBS稀释至0.4mg/ml后加入权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂，并充分乳化制备得到结核亚单位疫苗。
6.一种结核亚单位疫苗，其特征在于，所述结核亚单位疫苗是由结核杆菌融合细胞和如权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂混合构建的。
7.根据权利要求4所述的一种结核亚单位疫苗，其特征在于，所述结核亚单位疫苗中的结核融合细胞为结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX。
8.—种结核亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，是将结核杆菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX经PBS稀释至0.4mg/ml后加入权利要求1或2所述的结核亚单位疫苗复合佐剂，并充分乳化得到的。
9.根据权利要求7所述的一种结核亚单位疫苗在结核病防治中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种结核亚单位疫苗复合佐剂，所述复合佐剂包含有阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵DDA、TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸2395和TLR3配体PolyICLC，并提供了以其制备的结核亚单位疫苗及制备方法和应用。本发明的有益效果为本发明提供的结核亚单位疫苗复合佐剂，增强了结核分枝杆菌融合蛋白的免疫原性，有助于结核融合蛋白诱导Th1型抗结核免疫应答。
文档编号A61P31/06GK103203018SQ201310101948
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者李青, 祝秉东, 刘宝元, 牛红霞, 苏娟, 唐克峰 申请人:兰州大学