专利名称：一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物及制备方法
技术领域：
本发明属于治疗肝纤维化的植物药组分组合物及其制备方法，特别涉及一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物及其制备方法。
背景技术：
我国是世界上慢性乙型病毒性肝炎等肝脏疾病的高发地区，长期以来慢性肝病对我国人民的健康造成重大危害。但是，目前肝纤维化治疗还是慢性肝病治疗中的一大难点。自上世纪80年代起，上海中医药大学成功创制抗肝纤维化国家中药新药“扶正化瘀胶囊”(国药准字20020073 )，该药由丹参、虫草菌丝、桃仁、绞股蓝、松花粉、五味子组成，功效为活血祛瘀、益精补虚。多年研究证实扶正化瘀胶囊可有效改善慢性乙型肝炎肝纤维化，肝组织纤维化分期的逆转率(较治疗前下降I期或I期以上)达52%，通过为期2年的临床观察，显示该药可降低肝硬化门脉高压患者的上消化道出血率。但是目前扶正化瘀胶囊的制剂比较落后，一次服药5颗胶囊，引起部分患者胃肠道反应，虽然已经开发的片剂可以减少胃部不适，但仍然有进一步提高治疗肝纤维化临床疗效的需求。《药理学》记载，桃仁中的苦杏仁苷经肠道消化酶分解后可产生大量的氢氰酸，出现氢氰酸中毒。虽然在临床上从未发生过患者因服用扶正化瘀复方出现中毒的事件，但是如何防止潜在的严重毒副作用非常必要。因此，进一步二次开发扶正化瘀中药复方，在现有逆转肝纤维化52%的基础上再提高疗效，减少毒副作用是仍然需要努力的方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物及其制备方法，可明显提高疗效，减少副作用，具有良好的临床应用前景。
本发明的一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物，原料由虫草菌丝、桃仁和绞股蓝组成。所述5组分原液的配伍剂量，按每公斤体重计分别为:虫草粗多糖180_350mg、虫草脂溶性组分0.06 0.82ml、绞股蓝皂苷2_68mg、绞股蓝多糖3_12mg、苦杏仁苷0.1 4mg。优选的按每公斤体重计分别为:虫草粗多糖230 250mg、虫草脂溶性组分0.1 0.2ml、绞股蓝皂苷10 30mg、绞股蓝多糖7 8mg和苦杏仁苷I 2mg。进一步优选的按每公斤体重计分别为:虫草粗多糖240mg、虫草脂溶性组分0.1ml、绞股蓝皂苷20mg、绞股蓝多糖 .3mg和苦杏仁苷lmg。本发明的一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物的制备方法，包括:(I)提取提取所述的5组分:虫草粗多糖、虫草脂溶性组分、苦杏仁苷、绞股蓝皂苷和绞股蓝多糖；①虫草脂溶性组分:取虫草菌丝体粉，以20%乙醇水溶液制粒后放入超临界萃取仪的萃取釜中，萃取条件:温度为45°C，压力为30MPa，时间为2h，流量为35kg/h，分离条件为:第一级分离压力为lOMPa，温度为50°C，第二级分离压力为6MPa，温度为40°C，收集分离解析出来的油状物，得到虫草脂溶性组分；②虫草粗多糖:将经超临界萃取后的虫草菌丝体渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小时，共2次，合并后，离心去渣，上清液浓缩，加乙醇至终浓度为75%，冰箱放置，析出多糖，过滤，洗净干燥；③苦杏仁苷:称取桃仁药材1kg，加入10倍量的50%乙醇，加热回流90min，过滤，滤液减压浓缩至料液比1:1，取预处理好的HZ-818树脂250ml，湿法装柱，用去离子水冲洗至无醇味，将桃仁提取浓缩液以lBV/h流速上柱后，先以2BV去离子水冲洗，速率为2BV/h，弃去水淋洗液，再以3BV50%乙醇洗脱苦杏仁苷，速率为2BV/h，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得浅黄色固体粉末，经测定，苦杏仁苷类组分的得率约为0.8%，其中苦杏仁苷含量约为63%;④绞股蓝皂苷:称取绞股蓝药材1kg，加入20倍量的60%乙醇，回流提取2h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏状，加30%乙醇至料液比1:3，超声溶解15min，离心，上清液过大孔吸附树脂，取预处理好的HZ-816树脂2L，湿法装柱，用去离子水冲洗至无醇味，将绞股蓝提取液以l/4BV/h流速上柱，以l/2BV/h流速用2BV水冲洗，弃去淋洗液，再在相同流速下，以2BV30%乙醇冲洗，弃去淋洗液，最后以3BV95%乙醇洗脱绞股蓝皂苷，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得淡黄色固体粉末，经测定，绞股蓝皂苷类组分的得率约为1%，其中绞股蓝总皂苷含量约为40%;⑤绞股蓝多糖:将④提取工艺中绞股蓝药渣自然晾干，称取药渣500g，以15倍量去离子水回流提取lh，过滤，滤液减压浓缩至料液比1:1，加95%的乙醇900ml，至含醇量约70%，醇沉过夜，过滤，滤饼用95%乙醇两次，烘干，粉碎，得黄色绞股蓝多糖粉末，经测定，绞股蓝皂多糖组分的得率约为4%，其中绞股蓝多糖含量约为15%。(2)按配伍剂量,制成组分原液。所述组分原液应用于肠道的特定部位缓释的制剂，用量根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等调整，可以一次或多次施用。所述植物药组合物可制成固体制剂，如片剂或胶囊。所述植物药组合物可制成微胶囊。
经过多年的实验和临床研究，扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的作用机制和物质基础已经比较明确。研究发现虫草菌丝中的虫草多糖等组分、桃仁中的苦杏仁苷和丹参中的丹参酚酸A、B有显著抗肝纤维化作用。如虫草多糖能促进1、111型胶原降解，明显降低免疫性肝纤维化大鼠肝脏组织TGF- β I及其TBRI的含量；桃仁中的苦杏仁苷可显著抑制HSC的增殖与胶原基质成分的合成代谢，促进其分解代谢；丹参酚酸B有显著的抗四氯化碳(CCl4)以及二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝纤维化作用，抑制传代肝星状细胞(HSC)增殖及胶原生成，抑制TGF- β I在HSC胞内的信号转导，从而减少传代HSC分泌TGF-Bl的总量并抑制其活化。而丹参酚酸A可通过显著的抗脂质过氧化损伤作用抑制胶原合成。曾用扶正化瘀方治疗CCl4诱导的已成型的大鼠肝纤维化，发现扶正化瘀方中的各味药物主要有以下特点:1)桃仁是方中抗肝纤维化、促进肝内胶原纤维降解的主药；2)丹参对改善肝功能，促白蛋白合成及降低血清胆红素含量起主要作用；3)冬虫夏草菌丝是降低血清总胆红素含量的影响因子；4)绞股蓝是该方保护肝细胞、降低血清ALT活性的主药。
本发明挑选了扶正化瘀方中具有“扶正”功效的虫草，具有“活血化瘀”作用的桃仁以及具有“清热解毒”作用的绞股蓝等3味中药。从中提取并纯化了 5种有效组分:绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖(绞股蓝)，苦杏仁苷(桃仁)，虫草粗多糖、虫草菌丝体CO2超临界提取物(虫草菌丝体)。采用均匀设计的方法，对这5种提取组分进行筛选，并用NONMEN法进行分析，筛选出扶正化瘀方的有效组分群最优配伍剂量为:虫草粗多糖(240mg.1 Ο、虫草脂溶性组分(0.1ml.kg—1)、绞股蓝多糖(7.3mg.kg—1)、绞股蓝皂苷(20mg.kg—1)和苦杏仁苷(Img.kg-1)。有益.效果本发明植物药组分组合物原料由虫草菌丝、桃仁和绞股蓝组成。经动物实验具有抗肝纤维化和其他脏器的抗纤维化治疗作用，其作用与由虫草菌丝、丹参和绞股蓝组成的相同，疗效较原植物药复方有增效的趋势，有利于临床药代动力学和药理学的研究，具有良好的应用前景。
以下附图中A组为扶正化瘀原方浸膏组；C组为本发明；图1为正常组、模型组、A组和C组大鼠肝脏HE染色图(X 200);图2为正常组、模型组、A组和C组大鼠肝脏天狼猩红染色图(X 100)；图3为正常组、模型组、A组和C组大鼠肝脏胶原沉积面积变化；图4为正常组、模型组、A组和C组大鼠肝组织Hyp的含量变化；图5为正常组、模型组、A组和C组大鼠血清ALT活性；图6为正常组、模型组、A组和C组大鼠血清AST活性；图7为正常组、模型组、A组和C组大鼠血清Alb含量；图8为正常组、模型组、A组和C组大鼠血清TBiL含量。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1扶正化瘀复方有效组分复方的抗肝纤维化疗效:1.1 动物:Wistar雄性大鼠59只，SPF级，体重150±10g，中科院上海实验动物中心提供，许可证号:SCXK(沪):2007-0005。 所有大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF实验室，普通饮食，自由饮水。1.2主要试剂:二甲基亚硝胺(dimethy lnitrosamine, DMN),购自东京化成工业株式会社，批号:MAL05 ;柠檬酸，分析纯，批号:F20080916 ;无水乙酸钠，分析纯，批号:F20080714 ；朽1檬酸三钠(Tr1-sodium citrate),分析纯，批号:F20070110 ;对二甲基氨基苯甲醒(4-Dimethylamino benzaldehyde),批号:F20090516 ；氯氨-T (chloramines-T)，分析纯，批号:T20061130 ;无水乙醇，分析纯，批号:20090716 ;二甲苯，分析纯，批号20100123 ；甲醒(Formal dehyde solution),批号:20071019 ;异丙醇(Iso-propanol),分析纯，批号:T20070815 ;浓盐酸，分析纯，批号:Τ20090312，以上均购自中国医药集团上海化学试剂公司。中性树胶，批号:60090715，购自上海懿洋仪器有限公司。0.9%氯化钠注射液(Sodium Chloride Injection),批号:090903,购自安徽双鹤药业有限责任公司。戍巴比妥钠(Pentobarbital Sodium, Lot.N0.WS20090920,德国分装。轻脑氨酸(hydroxyproline,Hyp)标准品，分析纯，Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany 产品。高氯酸(Perchloricacid)，分析纯，批号:20070807购自上海桃浦化工厂。血清肝功能试剂盒，包括谷丙转氨酶(alanine aminotransamine, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、白蛋白(albumin, Alb)、总胆红素(total bilirubin, T.Bil),均购自南京建成生物工程研究所。1.3 药物:虫草粗多糖、虫草脂溶性组分、苦杏仁苷、绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖同第一部分。扶正化瘀复方的浸膏干粉由上海现代中医药股份有限公司提供，批号:100306，主要质控指标(HPLC测定):丹参素钠10.48mg/g ;腺苷2.5mg/g ;丹参酚酸B12.4mg/g ;水份:6.9%。应用时稀释为94.5mg/ml的溶液灌胃液。1.4主要仪器:FIM20制冰机，荷兰菲利浦公司产品。上菱生化专用冰箱，购自上海上菱公司。低温冰箱(-70°C )，Forma scientific 公司产品。台式离心机(microfuge lite), Beckman 公司产品。AA-200分析天平，倒置显微镜(37XB)美国Denver仪器公司产品。纯水系统(HPLC/UP) ,Labconco公司产品。CQX25-12超声波清洗器，上海必能超声有限公司产品。轮转切片机(RM2035)、HI1220 烤片机、HI1210 恒温水浴锅，LEICA ASP300 自动脱水机、LEICA EGl 160石腊包埋机，均购自德国Leica公司。一次成像照相机,Polariod公司产品。XW-80A型旋润混合器，江苏海门其林贝 尔仪器制造有限公司。ML-902定时恒温磁力搅拌器，上海浦江分析仪器厂生产。pH计((MOpIIvneleO, Beckmanwc 公司产品。1000 μ 1,200 μ 1,20 μ I 加样器，法国Gilson公司制造。M5多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司生产。Precellys24均质器，法国Bertin公司生产。2.1模型制备Wistar雄性大鼠59只，适应环境3天后，用随机数字表的方法随机分为正常组(10只)和造模组(49只)。造模组用0.5% DMN按2ml.kg—1体重腹腔注射，首次注射全剂量的2/3，每天I次，连续注射3d后休息4d，共3周，第4周的前3天分别注射0.5 % DMN全量、2/3量和1/2量。正常组大鼠予相同的时间和部位腹腔注射等量的氯化钠注射液。2.2 给药造模第4周，随机取3只大鼠处死观察肝脏病变情况，证实有肝纤维化改变后将剩余的46只大鼠用随机数字表的方法分为I个模型组(18只)和2个治疗组(A、C)，A为扶正化瘀原方浸膏组；C为本发明，每组14只。C治疗组组分水溶液按照表I配制剂量，以5ml -kg-1体重灌胃。其中虫草脂溶性组分由于不能很好溶于水中，且每IOOg大鼠体重需用量很小，所以用食用油稀释后按0.5ml.kg—1体重另外灌胃。A组给药扶正化瘀浸膏，给药剂量5ml.kg—1体重，正常组和模型组用等剂量的饮用水和食用油灌胃，每天I次共4周。
表I中药组分组灌胃组分提取物配伍剂量
权利要求
1.一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物，按每公斤体重计分别为:虫草粗多糖180-350mg、虫草脂溶性组分0.06 0.82ml、绞股蓝皂苷2_68mg、绞股蓝多糖3_12mg、苦杏仁苷0.1 4mg。
2.根据权利要求1所述的一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物，其特征在于:按每公斤体重计，所述分别为虫草粗多糖230 250mg、虫草脂溶性组分0.1 0.2ml、绞股蓝阜苷10 30mg、绞股蓝多糖7 8mg和苦杏仁苷I 2mg。
3.根据权利要求1所述的一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物，其特征在于:按每公斤体重计，所述分别为虫草粗多糖240mg、虫草脂溶性组分0.1ml、绞股蓝皂苷20mg、绞股蓝多糖7.3mg和苦杏仁苷lmg。
4.一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物的制备方法，包括: (1)提取所述5组分:提取提取所述的5组分:虫草粗多糖、虫草脂溶性组分、苦杏仁苷、绞股蓝皂苷和绞股蓝多糖； ①虫草脂溶性组分:取虫草菌丝体粉，以20%乙醇水溶液制粒后放入超临界萃取仪的萃取釜中，萃取条件:温度为45°C，压力为30MPa，时间为2h，流量为35kg/h，分离条件为:第一级分离压力为lOMPa，温度为50°C，第二级分离压力为6MPa，温度为40°C，收集分离解析出来的油状物，得到虫草脂溶性组分； ②虫草粗多糖:将经超临界萃取后的虫草菌丝体渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小时，共2次，合并后，离心去渣，上清液浓缩，加乙醇至终浓度为75%，冰箱放置，析出多糖，过滤，洗净干燥； ③苦杏仁苷:称取桃仁药材1kg，加入10倍量的50%乙醇，加热回流90min，过滤，滤液减压浓缩至料液比1:1，取 预处理好的HZ-818树脂250ml，湿法装柱，用去离子水冲洗至无醇味，将桃仁提取浓缩液以lBV/h流速上柱后，先以2BV去离子水冲洗，速率为2BV/h，弃去水淋洗液，再以3BV50%乙醇洗脱苦杏仁苷，速率为2BV/h，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得浅黄色固体粉末，经测定，苦杏仁苷类组分的得率约为0.8%，其中苦杏仁苷含量约为63%; ④绞股蓝皂苷:称取绞股蓝药材1kg，加入20倍量的60%乙醇，回流提取2h，过滤，滤液减压浓缩至浸膏状，加30%乙醇至料液比1:3，超声溶解15min，离心，上清液过大孔吸附树脂，取预处理好的HZ-816树脂2L，湿法装柱，用去离子水冲洗至无醇味，将绞股蓝提取液以l/4BV/h流速上柱，以l/2BV/h流速用2BV水冲洗，弃去淋洗液，再在相同流速下，以2BV30%乙醇冲洗，弃去淋洗液，最后以3BV95%乙醇洗脱绞股蓝皂苷，收集95%乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得淡黄色固体粉末，经测定，绞股蓝皂苷类组分的得率约为1%，其中绞股蓝总皂苷含量为40% ； ⑤绞股蓝多糖:将④提取工艺中绞股蓝药渣自然晾干，称取药渣500g，以15倍量去离子水回流提取lh，过滤，滤液减压浓缩至料液比1:1，力卩95%的乙醇900ml，至含醇量约70%，醇沉过夜，过滤，滤饼用95%乙醇两次，烘干，粉碎，得黄色绞股蓝多糖粉末，经测定，绞股蓝皂多糖组分的得率为4%，其中绞股蓝多糖含量为15% ； (2)按配伍剂量,制成组分原液。
5.根据权利要求1所述5组分植物药组合物，其特征在于:制成应用于肠道的特定部位的制剂，用量根据患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度调整，一次或多次施用。
6.根据权利要求5所述的5组分植物药组合物，其特征在于:所述制剂为片剂或胶囊。
7.根据权利要 求6所述的5组分植物药组合物，其特征在于:所述胶囊制成微胶囊。
全文摘要
本发明涉及一种治疗肝纤维化的5组分植物药组合物及制备方法，按每公斤体重计分别为:虫草粗多糖180-350mg、虫草脂溶性组分0.06～0.82ml、绞股蓝皂苷2-68mg、绞股蓝多糖3-12mg、苦杏仁苷0.1～4mg。制备包括(1)提取所述的5组分:虫草粗多糖、虫草脂溶性组分、苦杏仁苷、绞股蓝皂苷和绞股蓝多糖；(2)按配伍剂量，制成组分原液和各种临床所用制剂。本发明作用与由虫草菌丝、丹参和绞股蓝组成的5组分植物药相同,可明显提高疗效，减少副作用，具有良好的临床应用前景。
文档编号A61K36/424GK103191173SQ20131011166
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者徐列明, 冯怡, 胡坪, 李医明, 沈岚, 刘崇敏, 李光伟, 涂驭斌, 潘一峰 申请人:上海现代中医药股份有限公司