专利名称：利妥昔和中药的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物用途，具体地说，是关于利妥昔和中药的新用途。
背景技术：
淋巴瘤是原发于淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤。临床以无痛性，进行性淋巴结肿大为主要表现。本病可发生于任何年龄，但发病年龄高峰在3广40岁，其中非霍奇金淋巴瘤高峰略往前移。男女之比为:2 3:1。近年来，人-鼠嵌合性抗⑶20单克隆抗体利妥昔(Rituximab，Rituxan，美罗华)已成功应用于临床，通过抗体介导的针对细胞特异表面标记的免疫治疗，具有低毒，低骨髓抑制和较高特异性的特点，为B细胞淋巴瘤的治疗开辟了新途径。然而患者的治疗费用昂贵，部分患者在治疗早期或疾病复发时发生耐药。因此，研究利妥昔和其他药物联合应用的可行性对于提高疗效、降低费用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种含有利妥昔和苦参的组合药物在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物中的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种含有利妥昔和苦参的组合药物在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物中的用途，所述的组合药物由西药和中药药物组成，所述的西药是利妥昔，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参5-15份、玄参5-10份、丹皮10-20份。所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参8-12份、玄参6-9份、丹皮12-18 份。所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参10份、玄参7份、丹皮15份。所述的利妥昔和中药药物比例为1-100 μ g/ml:1_30μ g/ml。所述的利妥昔和中药药物比例为20 μ g/ml:20 μ g/ml。本发明优点在于:通过使用本发明的组合药物，发挥组合药物的协同作用，可以协同抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导B淋巴瘤细胞凋亡。药物组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用，降低副作用。使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。
图1显示流式细胞仪检测SU-DHL-4凋亡对照组的效果图。图2显示单用西药SU-DHL-4凋亡的效果图。图3显示单用中药药物SU-DH L-4凋亡的效果图。图4显示合用药物SU-DHL-4凋亡的效果图。图5显示流式细胞仪检测Daudi凋亡对照组的效果图。
图6显示单用西药Daudi凋亡的效果图。图7显示单用中药药物Daudi凋亡的效果图。图8显示合用药物Daudi凋亡的效果图。
具体实施例方式下面对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1 中药药物制备(一)
取中药苦参100g、玄参70g、丹皮150g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(2次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(2次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材5 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例2 中药药物制备(二)
取中药苦参100g、玄参70g、丹皮150g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(1次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(2次)。合并两次滤液，于水浴上浓 缩成相当于原生药材I μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例3 中药药物制备(三)
取中药苦参100g、玄参70g、丹皮150g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(2次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(3次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材10 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例4 中药药物制备(四)
取中药苦参100g、玄参70g、丹皮150g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例5 中药药物制备(五)
取中药苦参100g、玄参70g、丹皮150g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(2次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(2次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材30 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例6 中药药物制备(六)
取中药苦参50g、玄参100g、丹皮IOOg置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例7 中药药物制备(七)
取中药苦参150g、玄参50g、丹皮200g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例8 中药药物制备(八)
取中药苦参80g、玄参60g、丹皮180g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例9 中药药物制备(九)
取中药苦参120g、玄参60g、丹皮120g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例10 中药药物制备(十)
取中药苦参150g、玄参100g、丹皮200g置煎煮容器内，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，过滤(3次)。药渣加入450 g水继续煎煮，煮沸20 min，过滤(4次)。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材20 μ g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4°C冰箱备用。实施例11`
药效实验
(一)试剂
利妥昔，苦参、玄参、丹皮，
(二)细胞培养
本研究应用了以下两种细胞株:采用⑶20阳性B淋巴瘤细胞系SU-DHL-4和Daudi细胞，细胞在5%C02-95%空气，饱和湿度以及37°C的条件下，培养于RPM1-1640培养液中(Gibco/BRL)，并加入10%胎牛血清。在每次实验中，细胞接种密度为3X IO5/ml。细胞的存活率采用台盼兰拒染实验检测。细胞形态学观察采用瑞氏染色法。(三)MTT实验
在96孔板中，用利妥昔终浓度选用0、1、20、50、75和100 μ g/ml，中药药物(苦参、玄参和丹皮)组终浓度选用O、1、5、10、20和30 μ g/ml处理细胞。O剂量组用1640培养液代替。72小时后，向每孔中加入0.1 mg MTT，在37°C下孵育4小时后，在分光光度计570nm处测量标本吸光度值。(四)流式细胞仪检测annexin-V和线粒体跨膜电位:
细胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit (BD)进行分析。在检测线粒体跨膜电位中，细胞用PBS洗后，在37°C下与10 μ g/ml Rhl23孵育30分钟，然后再用50μ g/ml PI染色。荧光强度用流式细胞仪进行测量。(五)免疫印迹分析:
用 200 ml Laemmli 裂解缓冲液(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8，2mM EDTA, 10% glycerol,2% SDS and 5% mercaptoethanol)裂解 5xl06 细胞。蛋白裂解物(20 μ g)用于 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在溶于TBS/0.05% Tween 20的5%脱脂牛奶中封闭，之后与一抗在室温孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育I小时。免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。(六)核蛋白分离:
每IX IO7细胞与裂解缓冲液(10 mM HEPES, IOmMKCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,pH 7.9)洗后，重悬于提取缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.9，420 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.2mM EDTA and 25%甘油)中，冰上孵育20分钟。12000Xg离心10分钟后，上清即为核蛋白。(七)统计分析:
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P值小于0.05则认为具有统计学差异。所有的统计采用SAS8.2软件。(A)结果:
采用SU-DHL-4，Daudi细胞进行培养，通过分析观察利妥昔、中药药物组单独及联合应用对细胞生长增殖的影响。利妥昔(20 μ g/ml)联合中药药物(20 μ g/ml)应用48小时可显著抑制SU-DHL-4，Daudi细胞的增殖。用流式细胞仪检测单用及合用药后细胞的凋亡(Annexin V和PI双染法)。SU-DHL-4 (细胞株I)经利妥昔(20 μ g/ml )、中药药物(20 μ g/ml)及利妥昔(20 μ g/ml)联合中药药物(20 μ g/ml)处理的48小时后，Annexin V阳性细胞分别为:对照组3.4% (见图1);利妥昔组17.3% (见图2);中药药物组7.3% (见图3);利妥昔与中药药物合用组50.7% (见图4)。在Daudi (细胞株2):对照组3.0% (见图5);利妥昔组4.2% (见图6);中药药物组6.4% (见图7);利妥昔与中药药物合用组39.7% (见图8)。
同时我们应用Berenbaum建立的等效应线图法分析利妥昔与中药药物的联合应用是协同、相加或拮抗。
权利要求
1.一种含有利妥昔和苦参的组合药物在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物中的用途，所述的组合药物由西药和中药药物组成，其特征在于，所述的西药是利妥昔，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参5-15份、玄参5-10份、丹皮10-20份。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参8-12份、玄参6-9份、丹皮12-18份。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成:苦参10份、玄参7份、丹皮15份。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的利妥昔和中药药物比例为1-100 μ g/ml: 1-30 μ g/ml0
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的利妥昔和中药药物比例为20μ g/ml :20μ g/ml。
全文摘要
本发明涉及一种含有利妥昔和苦参的组合药物在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物中的用途，所述的组合药物由西药和中药药物组成，所述的西药是利妥昔，所述的中药药物是由下列重量份的原料药制成苦参5-15份、玄参5-10份、丹皮10-20份。本发明优点在于通过使用本发明的组合药物，发挥组合药物的协同作用，可以协同抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导B淋巴瘤细胞凋亡。药物组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用，降低副作用。使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。
文档编号A61K36/808GK103191426SQ201310124219
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者夏飞 申请人:太仓市胜舟生物技术有限公司