白介素-1偶联物及其用途的制作方法

专利名称：白介素-1偶联物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒和至少一种抗原的组合物，其中所述抗原是与该VLP或病毒颗粒共价连接的白介素-1 (IL-1)蛋白、IL-1片段或肽或IL-1突变蛋白。本发明也提供一种制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备治疗包括类风湿性关节炎、骨关节炎等在内的多种人类疾病的疫苗。本发明的组合物由此诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。相关技术IL-1是由包括巨噬细胞、树突细胞、B细胞和T细胞在内的各种细胞型产生的一种强促炎细胞因子(Dinarello C.A.，1991.Blood77 (8) =1627-1652) 它由两个分子类型组成，IL-1 α和IL-1 β，它们只有有限的序列相同性，但是通过与I型IL-1受体(IL-1RI)结合发挥类似的生物活性(Dinarello C.A.等人，1997, Cytokine&Growth Factor Rev.8:253)。两种IL-1分子也都与第二种IL-1受体(IL-1RII)结合，该受体缺少细胞内信号域，被认为作为诱傅受体起调节作用(Dinarello C.A.等人，1997, Cytokine & Growth FactorRev.8:253)。另外，IL-1家族的第三个成员，IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)，与两种受体结合，而不发挥任何对抗活性。IL-1ra与IL-1RII和IL-1RI和IL-1RII的脱落形式一起抵消IL-1a和IL-1 β的活性，并且确保炎症反应的紧密调节。在许多人类疾病中观察到IL-1介导的炎症应答的异常调节，包括类风湿性关节炎、炎性肠病、肾病、骨质疏松症等。在每种这样的疾病中，IL-1的过量产生和/或IL-1ra的产生不足都会诱发疾病 发展(Arend W.P., 2002, Cytokine & Growth Factor Reviews 13:323-340)。重组形式的IL-1ra(阿那白滞素，Kineret )在减轻炎症和防止几种炎性疾病的组织损伤方面是有效的，但是该药物需要高系统浓度，具有短半衰期，因此需要频繁地(每天)施用高剂量(约IOOmg)，导致药物成本高和潜在的患者依从性问题(Kineret 处方信息，Amgen ;Granowitz E.V.等人1992, Cytokine4:353)。另外,一大部分患者产生抗Kineret 的抗体，该抗体潜在中和了药物的生物活性(Fleischmann R.M.,等人,2003,Arthritis Rheum46:2287)。因此，新的治疗技术集中于主动免疫策略，该策略诱导患者的免疫系统产生IL-1-中和抗体。Svenson和同事(2000, J.1mmunol.Methods236: 1-8)用与纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)化学交联的重组IL-1a免疫了小鼠，观察到中和IL-1 a的生物活性的抗体的诱导。这一策略依赖于通过自身抗原与外源抗原的物理连接而向自身反应性B细胞提供T细胞帮助。美国专利6，093，405描述了一种通过用含有化学或物理灭活的细胞因子本身的免疫原性组合物进行免疫，来降低循环细胞因子的水平的方法。在该方法中，通过物理或化学处理使天然细胞因子具有免疫原性，而本发明公开了一种通过将天然细胞因子以高度重复的方式展示在VLP表面上而使它们具有免疫原性的方法。此外，W02003/084979描述了含有长度为5-40个氨基酸的细胞因子衍生肽的免疫原性化合物在治疗与细胞因子过量产生有关的疾病中的用途。

发明内容
现在，我们惊奇地发现，本发明的分别包含至少一种IL-1分子的组合物和疫苗不仅能够诱导针对IL-1的免疫应答，特别是抗体应答，而且能够在体内中和IL-1的促炎活性。另外，我们还惊讶地发现，IL-1分子当根据本发明与VLP共价连接时，在小鼠类风湿性关节炎模型中能够防止炎症和关节炎的临床体征。而且，我们还发现本发明的组合物比重组IL-1受体拮抗剂Kineret (被批准用于治疗人类类风湿性关节炎)更好地保护小鼠不发展关节炎症状(实施例7)。此外，我们还惊奇地发现，本发明的组合物当注射到遗传敏感的小鼠体内时能够抑制动脉粥样硬化症状的发生(实施例4)，因此是一种有效的动脉粥样硬化治疗剂。此外，我们还证明了 IL-1a与动脉粥样硬化的发病机理有关。因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含:(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是优选选自IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽和IL-1突变蛋白的IL-1分子，其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的优选实施方案中，适合在本发明中使用的病毒样颗粒包括病毒(优选RNA噬菌体)的重组蛋白，优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种IL-1成熟片段，该片段优选地具有IL-1的生物活性。因此，本发明利用在病毒样颗粒上以高度重复的方式呈现自身抗原来刺激自身反应性B细胞。

在另一方面，本发明提供一种疫苗组合物。而且，本发明提供一种给人或动物、优选给哺乳动物施用该疫苗组合物的方法。本发明的疫苗组合物一般且优选地在不含至少一种佐剂的情况下能够诱导强免疫应答，特别是抗体应答。因此，在一个优选实施方案中，该疫苗组合物不含佐剂。避免使用佐剂可以减少不希望的炎性T细胞应答的可能的发生。在一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。在一个进一步优选的实施方案中，所述RNA噬菌体是选自Q P、fr、GA和AP205的RNA噬菌体。在一个进一步优选的实施方案中，分别在组合物和疫苗组合物中所含的所述RNA噬菌体的VLP在宿主中重组产生，并且所述RNA噬菌体的VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。减少(或者优选地消除)宿主RNA的量以避免不希望的T细胞应答以及其他不希望的副作用(如发热)是有利的。在一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述疾病选自:(a)血管疾病；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病；(C)慢性自身免疫炎性疾病；(d)骨和软骨变性性疾病；(e)变态反应疾病；和(f)神经疾病；在这些疾病中，IL-1蛋白介导其病症或对其病症有贡献，其中该方法包括给动物(优选给人)分别施用本发明的组合物或本发明的疫苗组合物。其中IL-1蛋白介导或贡献于其病症的疾病例如是动脉粥样硬化、家族性地中海热、类风湿性关节炎、骨关节炎和变态反应。
在另一方面，本发明提供包含本发明的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。再另一方面，本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包括:(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP ； (b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。具体地，本发明涉及以下各项:I 一种组合物，其包含:(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是IL-1分子，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。2.第I项的组合物，其中所述IL-1分子选自:(a) IL-1 蛋白；(b) IL-1 成熟片段；(c) IL-1 片段；(d) IL-1 肽；和(e) IL-1 突变蛋白。3.第2项的组合物，其中所述IL-1分子来源于人类。4.第1-3任一项的组合物，其中所述IL-1分子是IL-1 ^分子。5.第1-3任一项的组合物，其中所述IL-1分子是IL-1 a分子。6.第4项的组合物，其中所述IL-1 P分子选自:(a) IL-1 3 蛋白；(b) IL-1 @ 成熟片段；(c) IL-1 3 片段；(d) IL-1 P 肽；和(e) IL-1 ^ 突变蛋白。7.第5项的组合物，其中所述IL-1 a分子选自:(a) IL-1 a 蛋白；(b) IL-1 a 成熟片段；(c) IL-1 a 片段；(d) IL-1 a 肽；和(e) IL-1 a 突变蛋白。8.第1-4任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 P蛋白:(a)人 IL-1 3 (SEQ ID NO:49)；(b)SEQ ID NO:50 至 SEQ ID NO:62 中的任一种；和(c)与SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:62中的任一种序列至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。9.第1-4任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 ^成熟片段:(a)人 IL-1 P 117-269 (SEQ ID NO:64)；
(b)人 IL-1 P 116-269 (SEQ ID NO:165)；(c)小鼠 IL-1 ^ 119-269 (SEQ ID NO:164);和(d)与 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:165 和 SEQ ID NO:164 中的任一种序列具有至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。10.第1-4任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 ^肽:(a) SEQ ID NO:89 至 SEQ ID NO:116 中的任一种；和(b)与SEQ ID NO:89至SEQ ID NO:116中的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。11.第1-3或5中任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1a蛋白:(a)人 IL-1 a (SEQ ID NO:36)；(b)SEQ ID NO:37 至 SEQ ID NO:48 中的任一种；和(e)与SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:48中的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。12.第1-3或5中任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 a成熟片段:(a)人 IL-1 a 119-271 (SEQ ID NO:63)；(b)小鼠 IL-1 a 117-270 (SEQ ID NO:163);和(c)与SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:163的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。13.第1-3或5中任一项的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 a肽:(a) SEQ ID NO:67 至 SEQ ID NO:88 中的任一种；和(b)与SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:88中的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。14.第1-13任一项的组合物，其中所述VLP包含或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。15.第1-14任一项的组合物，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP。16.第14或15任一项的组合物，其中所述RNA噬菌体是选自Q P和AP205的RNA
噬菌体。17.第1-16任一项的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个共价键连接，其中优选地所述共价键是非肽键。18.第1-17任一项的组合物，其中所述第一附着位点包含或者优选地是氨基，优选赖氨酸的氨基。
19.第1-18任一项的组合物，其中所述第二附着位点包含或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。20.第1-17任一项的组合物，其中所述第一附着位点不是巯基。21.第1-17和20中任一项的组合物，其中所述VLP和所述至少一种抗原的所述连接不包含二硫键。22.第1-19任一项的组合物，其中只有一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键连接，产生单一且均匀类型的所述IL-1分子与所述核心颗粒的结合，其中与所述第一附着位点连接的所述只有一个第二附着位点是巯基，并且其中所述IL-1分子和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。23.第1-16任一项的组合物，其中所述抗原与AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。24.第1-22任一项的组合物，其进一步包括接头。25.第1-24任一项的组合物，其中所述IL-1分子是SEQ ID NO:64或其衍生的突
变蛋白。26.第1-24任一项的组合物，其中所述IL-1分子是SEQ ID NO:63或其衍生的突
变蛋白。27.一种疫苗，其包含第1-26中任一项的组合物或者由该组合物组成。28.第27项的疫苗 ，其中所述疫苗不含佐剂。29.一种免疫方法，包括给动物或人施用第27或28任一项的疫苗。30 —种药物组合物，其包含:(a)第1-23任一项的组合物或第27或28任一项的疫苗；和(b)可接受的药物载体。31.一种制备第1-26任一项的组合物或第27或28任一项的疫苗的方法，包括:(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP ；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原相连接，产生所述组合物或所述疫苗，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。32.第1-26任一项的组合物、第27或28任一项的疫苗或第30项的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病优选地选自动物、优选人类中的:(a)血管疾病；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病；(c)慢性自身免疫炎性疾病；(d)骨和软骨变性性疾病；(e)变态反应疾病；和(f)神经疾病。33.第32项的用途，其中所述疾病是血管疾病，其中所述血管疾病是动脉粥样硬化。
34.第32项的用途，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，其中所述遗传性IL-1-依赖的炎性疾病是家族性地中海热(FMF)。35.第32项的用途，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，其中所述慢性自身免疫炎性疾病是全身发作青少年特发性关节炎或类风湿性关节炎。36.第32项的用途，其中所述疾病是骨和软骨变性性疾病，其中所述骨和软骨变性性疾病是痛风或骨关节炎。37.第32项的用途，其中所述疾病神经疾病，其中所述神经疾病是多发性硬化。


图1:mIL_l运119_269蛋白与Q 3衣壳蛋白的偶联在还原条件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝将该凝胶染色。在左边空白处给出了标记蛋白质的分子量，单位是kDa，右边空白处标明了蛋白质带的身份。泳道1:预染色的蛋白质标记物(New England Biolabs)。泳道2:衍生的Q3衣壳蛋白。泳道3:游离的还原的mIL-1 & 119_269蛋白。泳道4:QP -mlL-1 & 119_269偶联反应物。图2:mIL_l a 117_270蛋白与Q 3衣壳蛋白的偶联在还原条件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝将该凝胶染色。在左边空白处给出了标记蛋白质的分子量，单位是kDa，右边空白处标明了蛋白质带的身份。泳道1:预染色的蛋白质标记物(New England Biolabs)。泳道2:衍生的Q3衣壳蛋白。泳道3:游离的还原的mIL-1 a 117_270蛋白。泳道4:Q^-mIL-l a 117_270偶联反应物。·发明详沭除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。佐剂:本文使用的术语“佐剂”涉及免疫应答的非特异性刺激物或使宿主内产生贮库(depot)的物质，当与本发明的疫苗和药物组合物分别组合时，可以提供增强的免疫应答。优选的佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂，含铝佐剂，优选氢氧化铝，和修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂有矿物质凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔诚.血蓝蛋白、二硝基 )，和人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些佐剂也是本领域已知的。可以和本发明的组合物一起施用的其他佐剂包括但不限于，单磷酸类脂免疫调节剂、AdjuVaxlOOa, QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、]\^-59、011-174、011-197、011-294、和病毒颗粒佐剂技术。所述佐剂也可以包含上述物质的混合物。VLP通常被描述为佐剂。然而，在本申请上下文中使用的术语“佐剂”是指不是用于本发明组合物的VLP，而是涉及另外一种不同成分的佐剂。抗原:本文所用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递，则能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或者连接于Th细胞表位上，并且在佐剂中提供。一个抗原可能具有一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应的意思是，抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。表位:术语表位是指抗原(优选多肽)的连续或不连续的部分，其中所述部分可以被抗体或在MHC分子环境内被T细胞受体特异性地结合。对于抗体，特异性结合排除了非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。表位在对于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。特异性结合(抗体/抗原):在本申请中，如果抗体与抗原以IO6M-1或更高、优选IO7M-1或更高、更优选IO8M4或更高、最优选IO9M4或更高的结合亲和力(Ka)结合，则被定义为特异性结合。抗体的亲和力可以由本领域技术人员容易地测定(例如，通过Scatchard分析、ELISA或Biacore分析)。特异性结合(IL-1/IL-1受体):受体和受体配体之间的相互作用可以用本领域公知的生物物理方法来表征，所述方法包括，例如，ELISA或Biacore分析。当IL-1与IL-1受体的结合亲和力(Ka)至少为IO5M'优选至少IO6M'更优选至少IO7M'再更优选至少IO8M'最优选至少KAf1时，认为所述IL-1分子能够特异性结合所述IL-1受体；其中优选地所述IL-1受体是来自小鼠或人、最优选地来自人的IL-1受体。进一步优选地,所述IL-1受体包含序列SEQ ID NO:166至SEQ ID NO:169中的任一种或者更优选地由该序列组成，最优选地所述IL-1受体包含序列SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:167中的任一种或者更优选地由该序列组成。联接的(associated):本文所用的术语“联接的”或“联接”是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个分子连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。

第一附着位点:本文所用的短语“第一附着位点”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应性基团的一个优选的实施方案是氨基酸(优选赖氨酸)的氨基。第一附着位点一般位于VLP的表面上，优选位于VLP的外表面上。多个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键联接。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点自然存在于VLP中。或者，在一个优选的实施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。第二附着位点:本文使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于或者人工添加到IL-1分子上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。IL-1分子的第二附着位点优选地是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团，例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应性基团的一个优选的实施方案是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基。本文使用的术语“具有至少一个第二附着位点的IL-1分子”因此是指包含IL-1分子和至少一个第二附着位点的构建体。然而，特别是对于并非天然存在于IL-1分子内的第二附着位点，这种构建体一般且优选地进一步含有“接头”。在另一个实施方案中，第二附着位点与IL-1分子通过至少一个共价键，优选地通过至少一个肽链联接。在一个进一步的实施方案中，第二附着位点天然存在于IL-1分子内。在另外一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点被通过接头人工添加到IL-1分子上，其中所述接头包含半胱氨酸或由半胱氨酸组成。优选地，所述接头与IL-1分子通过肽键融合。外壳蛋白:本申请中的术语“外壳蛋白”和可交换使用的术语“衣壳蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质，优选病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚单位。IL-1分子:本文使用的术语“IL-1分子”或简写“IL-1”是指任何多肽，其氨基酸序列与选自 SEQ ID N0:36 至 SEQ ID N0:116、SEQ ID NO:130 至 SEQ ID NO:140 和 SEQ IDNO:163至SEQ ID NO:165的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。本文使用的术语“IL-1分子”优选地是指任何IL-1蛋白 、IL-1片段、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:130 至 SEQ ID NO:140 和 SEQ ID NO:163 至 SEQ ID NO:165 的任一种序列具有至少 80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生。本文使用的术语IL-1分子典型且优选地还指任何动物种的IL-1蛋白的直向同源物。IL-1分子优选地但不是必须地能够与IL-1受体结合并且进一步优选地具有生物活性。IL-1a分子:本文使用的术语“IL-1 a分子”或简写“IL_1 a ”是指IL_1 a蛋白、IL-1a片段、IL-1 a成熟片段、IL-1a肽或IL_1 a突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:36至48、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID N0:67至SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:163的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。IL-1a的一种特别优选的实施方案是人IL-1 a 119-271 (SEQ ID NO:63)。 iL-1e分子:本文使用的术语“iL-1e分子”或简写“iL-1P ”是指iL-1e蛋白、IL-1 P片段、IL-1 P成熟片段、IL-1 P肽或IL-1 P突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQID NO:66、SEQ ID NO:89 至 SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:130 至 SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:164和SEQ ID NO:165的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。IL-1P的一种特别优选的实施方案是人IL-1^ 117-269(SEQ ID NO:64)。IL-1蛋白:本文使用的术语“IL-1蛋白”是指一种天然存在的蛋白质，其中所述天然存在的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID N0:36至SEQ ID NO:62的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性；或者其中所述天然存在的蛋白质能够与IL-1受体结合，优选地具有生物活性。本文使用的术语“IL-1蛋白”优选地是指一种天然存在的蛋白质，其中所述天然存在的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:62的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生；并且其中所述天然存在的蛋白质能够与IL-1受体结合，优选地具有生物活性。典型且优选地，本文使用的术语“IL-1蛋白”是指至少一种天然存在的蛋白质，其中所述蛋白质能够与IL-1受体结合，并且具有生物活性，其中进一步地所述蛋白质包含一种多肽或由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO: 36至SEQ ID NO: 62的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。相应地，术语“IL-la蛋白”涉及包含一种多肽或者由该多肽组成的IL-1蛋白，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:36至SEQ IDNO:48的任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性，而术语“IL-1P蛋白”涉及包含一种多肽或者由该多肽组成的IL-1蛋白，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:49至SEQ ID NO:62的任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。IL-1片段:本文使用的术语“ IL-1片段”涉及含有IL-1蛋白的连续序列段的多肽，其中所述多肽的长度为至少50个、优选至少100个、最优选至少150个氨基酸。典型且优选地，所述IL-1片段的长度最多为300个、更优选最多250个、最优选最多200个氨基酸。典型且优选地，IL-1片段能够与IL-1受体结合，进一步优选地具有生物活性。相应地，术语“IL-la片段”和“IL-1 P片段”涉及如上定义的IL-1片段，其中所述IL-1蛋白分别是IL-1a蛋白或IL-1 P蛋白。IL-1成熟片段:本文使用的术语“IL-1成熟片段”涉及IL-1片段，其中所述IL-1片段是IL-1蛋白的天然存在的成熟产物。相应地，本文使用的术语“IL-1 a成熟片段”和“IL-1P成熟片段”涉及如上定义的IL-1成熟片段，其中所述IL-1蛋白分别是IL-1 a蛋白或IL-1 P蛋白。IL-1a成熟片段的优选实施方案是SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65和SEQ ID N0:163。IL-1 P 成熟片段的优选实施方案是 SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:130, SEQ ID NO:164 和 SEQ ID NO:165。优选的IL-1 a成熟片段包含选自下组的氨基酸序列或者优选地由所述氨基酸序列组成:(a)人 IL-1 a 119-271 (SEQ ID NO:63) ; (b)小鼠 IL-1 a 117-270 (SEQ ID NO:65)；(c)小鼠 IL-1 a 117-270 (SEQ ID NO:163);和(e)与 SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65 和 SEQID NO:163任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同
的氨基酸序列。优选的IL-1 0成熟片段包含选自下组的氨基酸序列或者优选地由所述氨基酸序列组成:(a)人 IL-1 P 117-269 (SEQ ID NO:64) ； (b) A IL-1 ^ 116-269 (SEQ ID NO:165)；(c)小鼠 IL-1 P 119-269 (SEQ ID NO:66) ； (d)小鼠 IL-1 P 119-269 (SEQ ID NO:164);和(e)与 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:164 和 SEQ ID NO:165 任一种至少 80%、或优选至少90%、更优选至少95%、或最优选至少99%相同的氨基酸序列。IL-1肽:本文使用的术语“IL-1肽”涉及一种含有天然存在的蛋白质的连续序列段的多肽，其中所述蛋白质能够与IL-1受体结合，并且优选地具有生物活性，其中所述多肽的长度为4-49个，优选6至35个，最优选10至25个氨基酸。IL-1肽可以，但是一般不能够结合IL-1受体，典型地没有生物活性。相应地，本文使用的术语“IL-1 a肽”和“IL-1 ^肽”涉及如上定义的IL-1肽，其中所述天然存在的蛋白质分别是IL-1 a蛋白或IL-1 P蛋白。优选的 IL-1 肽是 SEQ ID NO:82 至 SEQ ID NO:116。
IL-1突变蛋白:本文使用的术语“IL-1突变蛋白”包含由IL-1分子、优选地由IL-1a或IL-1 P蛋白、IL-1a或IL_1 P片段、IL-1a或IL_1 P成熟片段或IL-1a或IL-1 P肽衍生的任何多肽，或者优选地由所述多肽组成，其中优选地所述多肽显示比衍生出它的IL-1分子降低的生物活性。相应地，IL-1 a突变蛋白和IL-1 P突变蛋白是以上定义的IL-1突变蛋白，其中所述多肽分别衍生自IL-1a分子或IL-1 P分子。在优选的IL-1突变蛋白中，所述生物活性低于衍生出它的IL-1分子的生物活性的80%，更优选低于60%，更优选低于40%，更优选低于20%。进一步优选的IL-1突变蛋白衍生自IL-1成熟片段，其中所述IL-1突变蛋白的生物活性低于衍生所述IL-1突变蛋白的IL-1成熟片段的生物活性的80%，更优选低于60%，更优选低于40%，更优选低于20%。非常优选的IL-1突变蛋白不显示生物活性。进一步优选地，但不是必须地，IL-1突变蛋白能够特异性结合IL-1受体。非常优选的是衍生自以下物质的IL-1突变蛋白:(i)IL-1蛋白，优选来自SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:62 ;或(ii)更优选IL-1成熟片段，优选来自 SEQ ID N0:63 至 SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:130 和 SEQ ID NO:163 至 SEQ ID NO:165中的任一种。在上下文中有用的IL-1突变蛋白已经在以下文献中描述:Kamogashira等人(1988)J.Biochem.104:837-840 ;Gehrke 等人(1990)The Journal of BiologicalChemistry265(11):5922-5925 ;Conca 等人(1991)The Journal of BiologicalChemistry266 (25): 16265-16268 ;Ju 等人(1991)PNAS88:2658-2662 ;Auron 等人(1992)Biochemistry31:6632-6638 ;Guinet 等人(1993)Eur.J.Biochem211:583-590 ；Camacho(1993)Biochemistry32:8749-8757 ；Baumann(1993)Journal ofRecepror Researchl3(1-4):245-262 ;Simon (1993)The Journal of BiologicalChemistry268(13):9771-9779 ;和 Simoncsits (1994) Cytokine6 (2):206_214，它们的公开内容在此引用作为参考。优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1蛋白、IL-1片段 、IL-1成熟片段或IL-1肽的氨基酸序列有I至10个、优选I至6个,更优选I至5个,更优选I至4个,更优选I至3个,更优选I至2个,最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸残基是一个连续序列段。进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1蛋白、IL-1片段、或IL-1成熟片段的氨基酸序列有I至10个、优选I至6个，更优选I至5个，更优选I至4个，更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与 SEQ ID N0:36 至 SEQ ID N0:48 或 SEQ ID N0:49 至 SEQ ID NO:62中任一种的氨基酸序列有I至10个、优选I至6个,更优选I至5个,更优选I至4个,更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基⑴从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自以下序列的氨基酸序列有I至10个、优选I至6个，更优选I至5个，更优选I至4个，更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同:(i)SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:163中的任一种，最优选 SEQ ID NO:63;或(ii)选自 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:164和SEQ ID NO: 165的任一种，最优选SEQ ID NO:64，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1突变蛋白是IL-1 a突变蛋白，其中所述IL_1 a突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:36至SEQID NO:48中任一种的氨基酸序列有I至6个,优选I至5个,更优选I至4个,更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基a)从所述多肽上删除，ai)插入所述多肽内，aii)更换为另外一种氨基酸残基，或者av) a)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1 a突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:163中任一种，最优选SEQ ID NO:63的氨基酸序列有I至6个，优选I至5个，更优选I至4个，更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。非常优选的IL-1a突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:63的氨基酸序列有I至10个、优选I至6个，更优选I至5个，更优选I至4个，更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。进一步优 选的IL-1突变蛋白是IL-1 P突变蛋白，其中所述IL-1 a突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:49至SEQID NO:62中任一种的氨基酸序列有I至6个,优选I至5个,更优选I至4个,更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1 P突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO:164和SEQ ID NO: 165，最优选SEQ ID NO:64的氨基酸序列有I至6个，优选I至5个，更优选I至4个，更优选I至3个，更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。非常优选的IL-1 ^突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID N0:64的氨基酸序列有I至10个,优选I至6个,优选I至5个,更优选I至4个,更优选I至3个,更优选I至2个，最优选正好I个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv) (i)至(iii)的任意组合。更优选的IL-1 P突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:140中任一种的氨基酸序列。IL-1的促动效应/生物活性:本文用于IL-1的术语“生物活性”或“生物活性的”是指IL-1分子在给动物全身施用后诱导IL-6产生的能力，优选地如实施例2E和实施例3E所述。IL-1分子的生物活性也指诱导胸腺细胞(Epps等人，Cytokine9 (3):149-156(1997))、DI0.G4.1T 辅助细胞(Orencole 和 Dinarello，Cytokinel(I):14-22(1989))增殖的能力，或诱导 MG64 或 HaCaT 细胞(Boraschi 等人，J.Tmmun01.155:4719-4725 (1995))或成纤维细胞(Dinarello 等人，Current Protocolsin Immunology6.2.1-6-2-7 (2000))产生IL-6的能力，或者诱导EL-4胸腺瘤细胞产生 IL-2 (Simon 等人，J.1mmunol.Methods84 (1-2):85-94 (1985))的能力，或者抑制人骨髓瘤细胞系A375生长的能力(Nakai等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.154:1189-1196(1988))。连接的:本文所用的术语“连接的”或“连接“是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，本文所用的术语“连接”不仅指至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个、优选一个异双功能交联剂连接。在其他优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个肽键连接，更优选只通过肽键连接。在一个非常优选的实施方案中，第一附着位点和第二附着位点只通过肽结合连接，优选通过直接基因融合或优选地通过氨基酸接头的基因融合连接。在一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点只通过肽结合，优选地通过基因融合，与所述第一附着位点的C末端连接。接头:本文所用的 “接头”将第二附着位点与IL-1分子联接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或者由第 二附着位点组成。优选地，本文所用的“接头”已经包含第二附着位点，典型且优选地-但不是必需地-为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。本文所用的“接头”也被称为“氨基酸接头”，特别是当本发明的接头含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语“接头”和“氨基酸接头”在本文中可以交换使用。然而，这并不意味着这种接头仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的接头是本发明的优选的实施方案。接头的氨基酸残基优选地由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物组成。本发明的接头的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也包括在本发明中。可用于本发明的其他接头有包含C1-C6烷基_、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选地包含C1-C6烷基-、环烷基_(C5，C6)、芳基-或杂芳基-部分和另外的氨基酸的接头也可以用作本发明的接头，并且包括在本发明的范围内。接头与IL-1分子优选地通过至少一个共价键、更优选地通过至少一个肽键联接。在通过基因融合连接的情况中，接头可以不存在，或者优选地是氨基酸接头，更优选地是仅仅由氨基酸残基组成的氨基酸接头。非常优选的用于基因融合的接头是柔性氨基酸接头。在通过基因融合连接的情况中，接头优选地由1-20个、更优选2-15个、更优选2-10个、更优选2-5个、最优选3个氨基酸组成。非常优选的用于基因融合的接头包含GSG(SEQ IDNO:189)或者优选地由GSG组成。有序且重复的抗原阵列:本文所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，或者其特征在于抗原相对于病毒样颗粒的空间排列具有典型且优选地高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是几何模式。本发明的某些实施方案，例如与RNA噬菌体的VLP偶联的抗原，是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优选的实例，而且其优选地具有严格重复的类晶体抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。包装的:本文所用的术语“包装的”是指聚阴离子大分子或免疫刺激物相对于VLP的状态。本文所用的术语“包装”包括结合，该结合可以是共价的，例如化学偶联，也可以是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。该术语也包括聚阴离子大分子的包封或部分包封。因此，聚阴离子大分子或免疫刺激物可以被VLP包封，而不需要存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子或免疫刺激物被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式包装。在所述免疫刺激物是核酸，优选地是DNA的情况中，术语包装的含意是所述核酸对于核酸酶水解而言是不可及的，优选地对于DNAse水解(例如DNAseI或Benzonase)是不可及的，其中优选地所述可及性如W02003/024481A2的实施例11-17所述测定。多肽:如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如:糖基化、 乙酰化、磷酸化等。重组VLP:本文使用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。本文使用的术语“重组产生的VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。因此，术语“重组VLP”和“重组产生的VLP”在本文中可以互换使用，具有相同的含义。病毒颗粒:本文使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具有额外的结构(例如被膜、尾等)。本文使用的病毒样颗粒(VLP)是指非复制性或非传染性的、优选非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者是指非复制性或非传染性的、优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒、优选病毒衣壳的结构。本文使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所含的基因组。本文使用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因组已经被物理或化学灭活的病毒颗粒。典型且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、曬菌体、优选RNA曬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360个和360个以上的病毒蛋白亚单位。典型且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成具有固有的重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述结构一般是球形或管状。例如，RNA噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面体对称的球形形式。本文使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白亚单位组成的大分子装配体，其类似于上述定义的衣壳形态，但是不同于典型的对称装配体，同时保持足够程度的顺序和重复性。病毒颗粒和病毒样颗粒的一个共同特征是其亚单位高度有序且重复的排列。RNA噬菌体的病毒样颗粒:本文使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段、或者优选地基本由其组成、或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的基因，一般也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义应当也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，这样也可产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。优选的来源于RNA噬菌体的VLP表现为二十面体对称，并且由180个亚单位(单体)组成。使RNA噬菌体的病毒样颗粒成为非复制性和/或非传染性的优选方法是通过物理、化学灭活，如紫外线照射、甲醛处理，一般且优选地是通过遗传操作。一种或一个:术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序等已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序、优选使用Bestfit来确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95%相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5%的同源性缺口。上述测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。本发明提供增强动物或人体中对IL-1的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；和(b )具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是优选选自IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽和IL-1突变蛋白的IL-1分子，其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，所述IL-1分子与核心颗粒连接，从而形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在本发明的优选实施方案中，至少20个,优选至少30个,更优选至少60个,更优选至少120个,进一步更优选至少180个IL-1分子与核心颗粒连接。可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本发明的VLP或病毒颗粒。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA或RNA病毒已经在W02004/009124的第25页第10-21行，第26页第11-28行，和第28页第4行到第31页第4行公开。这些公开的内容在此引入作为参考。病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中产生和纯化。获得的用于疫苗目的的病毒或病毒样颗粒优选地是非复制性或非传染性的，更优选地是非复制性且非传染性的。紫外线照射、化学处理，如甲醛或氯仿处理，是本领域公知的灭活病毒的常用方法。在一个优选实施方案中，核心颗粒是病毒颗粒，并且其中优选地所述病毒颗粒是噬菌体，其中进一步优选地所述噬菌体是RNA噬菌体，其中进一步优选地所述RNA噬菌体是选自Q P、fr、GA或AP205的RNA噬菌体。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是VLP。在一个进一步优选的实施方案中，VLP是重组VLP。几乎所有公知的病毒都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员能够容易地确定编码外壳蛋白的基因。通过在宿主中重组表达外壳蛋白制备VLP是本领域技术人员公知的常识。在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者由选自下组的病毒的重组蛋白、其突变体或片段组成:a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich 等人，Virus Res.50:141-182 (1998))或其表面蛋白(W092/11291) ；d)麻疹病毒(Warnes 等人，Genel60:173-178(1995)) ；e)辛德毕斯病毒；f)轮状病毒(US5, 071，651 和US5, 374, 426) ；g) 口蹄疫病毒(Twomey 等人，Vaccinel3:1603-1610，(1995)) ；h)诺沃克病# (Jiang,X.等人，Science250:1580-1583(1990) ；Matsui,S.M.等人，J.Clin.1nvest.87:1456-1461(1991)) ；i)甲病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(W096/30523) ；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白pi ；1)人乳头瘤病毒(W098/15631) ；m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和0)禽兽棚病毒。包含一种以上不同的重组蛋白的VLP在本申请中通常被称为嵌合VLP。在一个实施方案中，VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含或者由一种以上的重组蛋白、优选两种重组蛋白、最优选两种重组衣壳蛋白、其突变体或片段组成。本文使用的术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”被定义为一种多肽，其长度分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70%，优选至少80%，更优选至少90 %，更优选至少95 %，并且优选地保留形成VLP的能力。优选地，该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。进一步优选地，所述片段通过最多5、4、3或2个内部缺失、通过最多2个截短或通过恰好一个它们的组合获得。术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”还包括与以上定义的“重组蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”分别具有至少80 %，优选90 %，更优选95 %的氨基酸序列同一性并且优选能够装配为病毒样颗粒的多肽。术语“突变外壳蛋白”是指具有分别由野生型重组蛋白或外壳蛋白衍生的氨基酸序列的多肽，其中该衍生的氨基酸序列与野生型序列至少80%、优选至少85%、90%、95%、97%或99%相同，并且优选地保留装配为VLP的能力。在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备已经在W000/32227、W001/85208和W002/056905中公开，所有三篇文献在此都引用以作参考。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在W001/056905的第34-39页已经公开。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽中，来介导IL-1分子与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO:I的氨基酸1-144、或1-149、1-185组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQID NO:170)的肽。这个修饰将SEQ ID NO:1改变为SEQ ID NO:2。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO:2的第48和110位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1-149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进 一步包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含、或由与SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列组成。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段，或者基本由其组成，或者由其组成。优选地，该RNA噬菌体选自:
a)噬菌体QP ；b)噬菌体R17 ；c)噬菌体fr ；d)噬菌体GA ；e)噬菌体SP ；f)噬菌体MS2 ；g)噬菌体Mil ；h)噬菌体MXl ；i)噬菌体NL95 ；k)噬菌体f2 ；1)噬菌体PP7 ;和m)噬菌体AP205。在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的氨基酸序列:(a) SEQ ID N0:3;涉及Q^CP ； (b) SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的混合物(Q 3 Al 蛋白)；(c) SEQ ID NO:5 (R17 衣壳蛋白)；(d) SEQ ID N0:6(fr 衣壳蛋白)；(e) SEQ ID NO:7 (GA 衣壳蛋白)；(f) SEQ ID NO:8 (SP 衣壳蛋白);(g) SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 的混合物；(h) SEQ ID NO:10 (MS2 衣壳蛋白)；(i)SEQ ID NO:11 (Mil 衣壳蛋白)；(j) SEQ ID NO:12 (MXl 衣壳蛋白)；(k) SEQ IDNO:13(NL95 衣壳蛋白)“I) SEQ ID NO: 14 (f 2 衣壳蛋白)；(m) SEQ ID N0:15(PP7 衣壳蛋白)；和(n)SEQ ID NO:21(AP205 衣壳蛋白)。在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列，或者由该氨基酸序列组成。在一个非常优选的实施方案中，VLP包含RNA噬菌体的两种不同的外壳蛋白，或者由所述外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有CP (SEQ ID N0:3)和CP Q^ Al (SEQ IDNO:4)或 CP SP (SEQ ID NO:8)和 CP SP Al (SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含RNAB遼菌体QP、fr>AP205或GA的重组外壳蛋白、其突变体或片段，或者基本由其组成，或者由其组成。在一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体QP的VLP。QP的衣壳或病毒样颗粒显示为二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T = 3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，这些外壳蛋白通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(GolmohammadiR.等人，Structure4:543-5554(1996))，使QP衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Q3外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。Q3的衣壳或VLP显示对有机溶剂和变性剂有不同寻常的耐受性。我们惊奇地发现，高至30%的DMSO和乙腈浓度和高至IM的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Q ^的衣壳或VLP的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。根据本发明进一步优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒、特别是QP和fr的病毒样颗粒，已经在W002/056905中公开，其公开内容在此引用作为参考。特别地，W002/056905的实施例18给出了由Q P制备VLP颗粒的详细描述。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205VLP的能够装配的突变形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，这产生本发明的其他优选的实施方案。W02004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。W02004/007538在此引入作为参考。AP205VLP具有高度免疫原性，能够与本发明的IL-1分子连接，典型 且优选地产生以重复方式展示定向的IL-1分子的疫苗构建体。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的VLP包含病毒(优选RNA曬菌体)的突变外壳蛋白，或者由所述突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP包含病毒(优选RNA噬菌体)的突变外壳蛋白，或者由所述突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。至少一个赖氨酸残基的删除、置换或添加可以改变偶联程度，即病毒(优选RNA噬菌体)的VLP的每个亚单位上IL-1分子的量，特别是，用来匹配和适应疫苗的要求。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。本文使用的术语“抗原密度”是指VLP (优选RNA噬菌体)的VLP的每个亚单位上(优选每个外壳蛋白上)连接的IL-1分子的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP (优选RNA噬菌体的VLP)的所有亚单位上的平均数。外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的拓扑学，3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。优选地，至少一个第一附着位点是赖氨酸残基，指向或位于VLP的外部。其暴露的赖氨酸残基被精氨酸取代的QP突变体可以用于本发明。这样，在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含下列物质，基本上由下列物质组成，或由下列物质组成:突变QP外壳蛋白。优选的突变外壳蛋白包含选自以下序列的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成；a)QP-240(SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:3 的 Lysl3_Arg)，
b)Q ^ -243 (SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:3 的 AsnlO-Lys)，c) Q P-250 (SEQ ID NO:18, SEQID NO:3 的 Lys2-Arg) d) Q ^-251 (SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:3 的 Lysl6-Arg)；和 e)Q^-259 (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:3 的 Lys2-Arg、Lysl6_Arg)。上述 QP 突变外壳蛋白、突变QP外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化在W002/056905中有描述。特别参考上述申请的实施例18。

在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含QP的突变外壳蛋白、或其突变体或片段和相应的Al蛋白，或者基本由其组成，或者由其组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16、17、18、19或20的突变外壳蛋白和相应的Al蛋白，或者基本由其组成，或者由其组成。其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也显示自装配(Kastelein，RA.等人，Gene23:245-254 (1983)，Kozlovskaya, TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR287:452-455(1986)，Adhin, MR.等人，Virologyl70:238-242 (1989)，Priano, C.等人，J.Mol.Biol.249:283-297 (1995))。特别是已经公开了 GA (Ni，CZ，等人，Protein Sc1.5:2485-2493 (1996)，Tars，K 等人，J.Mol.Biol.271:759-773(1997))和 fr (Pushko P.等人，Prot.Eng.6:883-891 (1993)，Lil jas，L等人 J Mol.Biol.244:279-290, (1994))的生物学和生化性质。几种RNA卩遼菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi, R.等人，Structure4:543-554 (1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个反应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种抗原，优选I至4种，更优选I至3种，更优选1-2种，最优选正好I种抗原，其中所述至少一种抗原是IL-1分子，优选IL-1蛋白、IL-1片段、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，其中所述IL-1分子优选地含有一种多肽或更优选地由该多肽组成，所述多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID N0:36至 SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:130 至 SEQ ID NO:140 和 SEQ ID NO:163 至 SEQ ID NO:165中任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨I"生。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗原是来源于选自下组的生物的IL-1分子:(a)人；(b)灵长类动物；(C)啮齿类动物;⑷马;(e)羊；(f)猫;(g)牛;(h)猪；⑴兔；(j)狗；(k)小鼠；和(g)大鼠。最优选地，所述IL-1分子来源于人类，优选地包含一种多肽，或者更优选由该多肽组成，所述多肽与选自SEQ ID NO:36, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:
63、SEQ ID NO:64 的任一种序列、SEQ ID NO:67-110 的任一种序列、SEQ ID NO:130-140的任一种序列和SEQ ID NO:165具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子来源于大鼠或小鼠，优选小鼠，其中所述IL-1分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由该多肽组成，所述多肽所含的氨基酸序列与 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66 的任一种序列、SEQ ID NO:111-116 的任一种序列、SEQ ID NO: 163, SEQ IDNO: 164具有至少80 %、优选至少90 %、更优选至少95 %、更优选至少99 %、最优选100 %的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，IL-1分子是IL-1 a分子，优选IL_la蛋白、IL-1a片段、IL-1 a成熟片段、IL-1a肽或IL_1 a突变蛋白，其中所述IL_1 a分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:36 至 48、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67 至 88 和 SEQ ID NO:165 的任一种序列具有至少80%、优选·至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。IL-1a分子的特别优选的实施方案是人IL-1 a分子，优选人IL-1a蛋白、人IL-1a片段或人IL-1 a成熟片段，其中所述IL_1 a分子优选地包含一种多肽或者更优选由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:36, SEQ ID NO: 63和SEQ ID NO:163中的任一种、最优选与SEQ ID NO:63具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1 P分子，优选IL-1P蛋白、IL-1 P片段、IL-1 P成熟片段、IL-1 P肽或IL-1 P突变蛋白，其中所述IL-1 P分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ IDNO:49 至 62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:89 至 116、SEQ ID NO:130 至 SEQID NO:140, SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:165中的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。IL-1 P分子的特别优选的实施方案是人IL-1 P分子，优选人IL-1 P蛋白、人IL-1 P片段或人IL-1 P成熟片段，其中所述IL-1P分子优选地包含一种多肽，或者更优选由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:130 至 SEQ ID NO:140 和 SEQ IDNO:165中的任一种，最优选地与SEQ ID NO:64具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1蛋白、IL-1片段或优选IL-1成熟片段，其中所述IL-1蛋白、IL-1片段或IL-1成熟片段优选地能够与IL-1受体结合，更优选地另外也具有生物活性。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1蛋白，其中所述IL-1蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:36至SEQ ID NO:62中的任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99*%、最优选100%的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1蛋白是IL-1 a蛋白，其中所述IL_la蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:36至SEQ ID NO:48的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。最优选地，所述IL-1 a蛋白是人IL-1a蛋白，其中所述人IL-1a蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:36具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，所述所述IL-1蛋白是IL-1P蛋白，其中所述IL-1 P蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:62的任一种序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生。最优选地,所述IL-1 0蛋白是人IL-1 P蛋白，其中所述人IL-1 P蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:49具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，所述所述IL-1分子是IL-1片段，优选IL-1成熟片段，其中所述IL-1片段或所述IL-1成熟片段优选地来源于小鼠或人类，最优选地来源于人类。优选地，所述IL-1片段或所述IL-1成熟片段含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:130和SEQID NO:163至SEQ ID NO: 165中的任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨丨生。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1成熟片段是IL-1 a成熟片段，其中所述IL-1 a成熟片段优选地具有生物活性，并且其中进一步，所述IL-1 a成熟片段优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:63或SEQID NO:65任一种，最优选地与SEQ ID NO:63具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1成熟片段是IL-1 ^成熟片段，其中所述IL-1 3成熟片段优选地具有生物活性，并且其中进一步所述IL-1 3成熟片段优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:64, SEQID NO:66, SEQ ID NO:130中的任一种，最优选地与SEQ ID NO:64具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一性。

在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1肽，其中所述IL-1肽来源于小鼠、大鼠或人类，最优选地来源于人类。优选地，所述IL-1肽优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:67至SEQ ID NO:116中的任一种具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的序列同一丨I"生。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1突变蛋白，其中优选地所述IL-1突变蛋白包含降低的生物活性或更优选地没有生物活性，并且其中进一步所述IL-1突变蛋白能够结合IL-1受体。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1突变蛋白包含一种多肽或优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1成熟片段的氨基酸序列有I至3个，更优选1-2个，最优选正好I个氨基酸残基不同。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1突变蛋白是IL-1 P突变蛋白，优选人IL-1 P突变蛋白，最优选选自SEQ ID NO:131 至 SEQ ID NO:140 的人 IL-1 P 突变蛋白。本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包括:(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP ;(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1片段，优选IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在一个优选实施方案中，提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，即IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1片段、优选IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，是通过表达，优选地通过在细菌系统中，优选地在大肠杆菌中表达而实现的。为了有利于纯化过程，通常添加纯化标签，如His标签、Myc标签、Fe标签或HA标签。在另一方法中，特别可以化学合成具有不长于50个氨基酸的IL-1肽或IL-1突变蛋 白。在本发明的一个优选实施方案中，具有至少一个第一附着位点的VLP与具有至少一个第二附着位点的IL-1分子通过至少一个肽键连接。编码IL-1分子(优选IL-1成熟片段)的基因符合读框地连接到编码VLP外壳蛋白的基因的内部或优选连接到其N末端或C末端。也可以通过将IL-1的序列插入部分外壳蛋白序列已经缺失的突变外壳蛋白(其进一步称为截短突变体)中实现融合。截短突变体可以具有外壳蛋白的部分序列的N末端或C末端或者内部缺失。例如，对于特异性VLP HBcAg，氨基酸79-80被替换为外源表位。该融合蛋白优选保留了在表达后装配为VLP的能力，这可以通过电镜检查。可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列提供额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP亚单位序列时可能的去稳定效应，并且可减少外源表位的存在对装配的干扰。在另外一些实施方案中，至少一种IL-1分子,优选IL-1成熟片段,能够与大量其它病毒外壳蛋白融合，例如，与QP的Al蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska,T.M.,等人，Intervirology39:9-15 (1996))，或者插入CP延伸的位点72和73之间。作为另一个实例，IL-1可以插入frCP的氨基酸2和3之间，产生IL-1-frCP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot.Eng.6:883-891 (1993))。此外，IL-1也可以与RNA噬菌体MS-2的外壳蛋白的N末端突出￠-发夹融合(W092/13081)。此外，IL-1也可以与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合，优选与I型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白LI融合(Chackerian, B.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:2373-2378 (1999)，W000/23955)。将 BPV-1Ll 的氨基酸 130-136 置换为IL-1也是本发明的实施方案。将IL-1分子与病毒的外壳蛋白、其突变体或片段融合的实施方案已经在W02004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，在此引入作
为参考。US5, 698，424描述了一种能够形成衣壳的修饰的噬菌体MS_2外壳蛋白，其中通过向N端发夹区中插入半胱氨酸残基，以及通过将位于N端发夹区外部的每一个半胱氨酸残基置换为非半胱氨酸氨基酸残基，修饰了该外壳蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接连接到欲呈递的期望的分子种类如表位或抗原性蛋白质上。然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可导致衣壳通过形成二硫键而寡聚化。而且，衣壳和抗原性蛋白质之间通过二硫键的连接是不稳定的，特别是对于含有巯基部分的分子不稳定，而且，在血清中例如比硫醚连接的稳定性差(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)Irreversible Coupling of Immunoglobulin fragments toPreformed Vesicles.J.Biol.Chem.257:286-288)。因此，在本发明的另一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原即IL-1分子的联接或连接不包括二硫键。进一步优选的，所述至少一个第二附着位点包含，或优选地是巯基。而且，在本发明一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种IL-1分子的联接或连接不包括硫-硫键。进一步优选地，至少一个第二附着位点包含或者优选地是巯基。在另一个非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含巯基。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或者不包含半胱氨酸的巯基。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点包含氨基，并且所述第二附着位点包含巯基。在一个进一步优选的实施方案中，只有一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键连接，形成单一且均匀类型的所述IL-1分子与所述核心颗粒的结合，其中与所述第一附着位点连接的所 述只有一个第二附着位点是巯基，并且其中所述IL-1分子和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。在另一个优选实施方案中，IL-1分子，优选IL-1蛋白，更优选IL-1成熟片段，更优选包含氨基酸序列SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:66、最优选SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:
64、或者由上述序列组成的IL-1成熟片段，与RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N-或C-末端、优选与C-末端融合。含有RNA曬菌体AP205的外壳蛋白与抗原的融合蛋白的VLP在W02006/032674A1中总体公开，在此引用作为参考。在一个进一步优选的实施方案中，融合蛋白进一步包含接头，其中所述接头与AP205的外壳蛋白、其突变体或片段和IL-1分子融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子与AP205的所述外壳蛋白、其突变体或片段通过所述接头融合。已经发现，IL-1分子，特别是包含至少100个、最多300个氨基酸、典型且优选地大约140-160个氨基酸、最优选大约155个氨基酸的IL-1蛋白和IL-1片段，可以与噬菌体的外壳蛋白融合，优选地与AP205的外壳蛋白融合，同时保持该外壳蛋白自装配为VLP的能力。鉴于IL-1蛋白、IL-1片段和IL-1成熟片段的大尺寸，以及由于空间原因，构建了产生包含与IL-1分子融合的AP205外壳蛋白以及野生型外壳蛋白亚单位的嵌合VLP的表达系统。在该系统中，终止密码子的抑制产生了 AP205-1L-1外壳蛋白融合，而正确终止产生野生型AP205外壳蛋白。两种蛋白质在细胞中同时产生，并装配为嵌合VLP。这种系统的优点是可以展示大蛋白质，而不干扰VLP的装配。由于AP205-1L-1融合蛋白引入嵌合VLP中的水平依赖于阻抑水平，AP205-1L-1在已经包含过量表达抑制t-RNA的质粒的大肠杆菌细胞中表达。对于乳白阻抑，使用质粒PISM3001 (Smiley，B.K.，Minion, F.C.(1993)Enhanced readthrough of opal (UGA) stop codons and production of Mycoplasmapneumoniae Plepitopes in Escherichia col1.Genel34, 33-40),其编码识别乳白终止密码子的阻抑型t-RNA并引入Trp。应用质粒pISM579可以增加琥珀终止的阻抑，pISM579过量表达识别琥珀终止密码子并引入Trp的阻抑型t-RNA。质粒pISM579如下产生:用限制性内切核酸酶EcoRI从pISM3001上切下trpT176基因，并将其替换为含有琥珀t-RNA阻抑基因的来自质粒PMY579 (Michael Yarus惠赠)的EcoRI片段。该t-RNA阻抑基因是trpT175的突变体(Raftery LA.等人(1984) J.Bacteriol.158:849-859),与 trpT 在三个位点上不同:G33，A24和T35。在具有琥珀阻抑(supE或glnV)的大肠杆菌株如大肠杆菌JM109中表达AP205-白介素-1 a融合蛋白，除了在琥珀终止密码子处引入Trp的AP205-1L-1融合蛋白以外，还可以产生一定比例的在琥珀终止密码子处引入Gln而不是Trp的AP205-1L-1融合蛋白。在终止密码子处翻译的氨基酸身份因此可依赖于过量表达的阻抑型t-RNA和菌株表型的组合。如Miller JH等人((1983) J.Mol.Biol.164:59-71)所述和本领域中公知的，阻抑效率是依赖于环境的。特别是，位于终止密码子3’的密码子和位于终止密码子3’的第一个碱基特别重要。例如，后接嘌呤碱的终止密码子通常被很好地阻抑。因此，在一个优选的实施方案中，所述VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一个、优选一个第一多肽和至少一个、优选一个第二多肽，或优选地由上述多肽组成，其中所述第一多肽是重组衣壳蛋白、其突变体或片段；并且其中所述第二多肽是优选所述第一多肽的重组衣壳蛋白、其突变体或片段与IL-1分子的基因融合产物。在一个进一步优选的实施方案中，所述第一多肽是噬菌体AP205的重组衣壳蛋白或其突变体或片段。在一个进一步优选的实施方案中，所述第一多肽选自SEQ ID NO:2U SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23。在一个非常优选的实施方案中，所述第一多肽是SEQ ID NO:210包含抗原的噬菌体AP205的嵌合VLP在W02006/032674A1中总体公开，特别是在所述公开文本的第107段。在一个进一步优选的实施方案中 ， 所述第二多肽是优选所述第一多肽的重组衣壳蛋白、其突变体或片段与IL-1分子的基因融合产物，其中所述IL-1分子与所述重组衣壳蛋白、其突变体或片段的C-末端融合，优选地通过氨基酸接头融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子包含100-300个氨基酸、典型且优选地大约140-160个氨基酸、最优选地大约155个氨基酸，或者优选地由上述氨基酸组成。在一个非常优选的实施方案中，所述嵌合VLP中所述第一多肽与所述第二多肽的摩尔比为10: I至5: 1，优选8: I至6: 1，最优选大约 7: I。在本发明一个优选的实施方案中，所述组合物含有或者基本由具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒组成，该病毒样颗粒与具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原(即IL-1分子)通过至少一个共价键连接，优选地该共价键是非肽键。在本发明的一个优选的实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含，或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将IL-1分子与VLP连接。在优选的实施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位点(优选氨基，更优选赖氨酸残基的氨基)反应的官能团，和能够与IL-1分子固有的或人工添加的优选的第二附着位点(即巯基，优选半胱氨酸残基的巯基)反应的另一个官能团，任选地该另一个官能团也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS,Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 和其它例如可从 PierceChemical Company获得的、具有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的交联齐IJ。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在IL-1分子与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含接头。根据本发明的公开内容，通过连接优选包含适合作为第二附着位点的至少一个氨基酸的接头，实现向IL-1分子上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，接头通过至少一个共价键、优选通过至少一个、通常一个肽键与IL-1分子连接。优选地，接头包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，接头包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸接头是半胱氨酸残基。接头的选择取决于IL-1分子的性质，取决于其生化性质，如p1、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接头通常是有利的。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，接头由氨基酸组成，其中进一步优选地，接头由最多25个，优选最多20个，更优选最多15个氨基酸组成。在本发明的另 一优选实施方案中，氨基酸接头含有1-10个氨基酸。接头的优选实施方案选自:(a) CGG (SEQ ID NO:171) ;(b)N_ 端 Y I 接头，优选 CGDKTHTSPP (SEQ ID NO:172)；
ID NO:173) ; (d) Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头，优选 GCGGGG (SEQ ID NO:174) ； (f) (G) kC (G) n，其中 n = 0-12，k = 0-5 (SEQ ID NO:175) ;(g) N-端甘氨酸-丝氨酸接头，优选(GGGGS)n，n = 1-3(SEQ ID NO: 176)，具有另外一个半胱氨酸；(h) (G) kC (G)m(S)l (GGGGS) n，其中 n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, I = 0-2 (SEQID NO:177) ；(i)GGC(SEQ ID NO:178) ； (k) GGC-NH2 (SEQ ID NO:179) ;(1)C 端 Y I 接头，优选 DKTHTSPPCG(SEQ ID NO:180) ; (m)C_端 Y 3 接头，优选PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO:181) ;(n) C-端甘氨酸接头，优选GGGGCG (SEQ ID NO:182) ； (o) (G) nC (G) k，其中 n = 0-12，k=0-5 (SEQ ID NO:183) ; (p) C-端甘氨酸-丝氨酸接头，优选(SGGGG) n，n = 1-3 (SEQ ID NO:184)，具有另外一个半胱氨酸；(q) (G) m (S) I (GGGGS) n (G)oC (G) k，其中 n = 0-3, k = 0-5, m=0-10，I = 0-2，o = 0-8 (SEQ ID NO:185)。在一个进一步优选的实施方案中，接头添加到IL-1分子的N末端。在本发明的另一个优选实施方案中，接连体添加到IL-1分子的C末端。本发明优选的接头是进一步含有半胱氨酸残基作为第二附着位点的甘氨酸接头(G)n，如N-末端甘氨酸接头(GCGGGG，SEQ ID NO:174)和C-末端甘氨酸接头(GGGGCG，SEQ ID NO:182)。进一步优选的实施方案是C-末端甘氨酸-赖氨酸接头(GGKKGC，SEQ IDNO:186)和N-末端甘氨酸-赖氨酸接头(CGKKGG，SEQ ID NO: 187)，位于肽的C-末端的GGCG (SEQ ID NO:188)和 GGC (SEQ ID NO: 179，" NH2"代表酰胺化)接头，或位于其 N-末端的CGG(SEQ ID NO:171)。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在的空间位阻。根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接IL-1分子与VLP，使得本发明的抗原以定向方式与VLP偶联。连接IL-1分子和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联IL-1分子和VLP的方法。IL-1分子也可以首先通过例如与SATA、SATP或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在脱保护之后，IL-1分子可以和VLP如下所述偶联。在分离过量的硫醇化试剂之后，IL-1分子与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的IL-1分子能够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEOJ4,BS3 (Pierce)或含有对VLP的胺基或羧基有反应性的官能团的其它已知同型双功能交联齐U，将IL-1分子与VLP连接。在本发明的其他实施方案中，组合物包含或者基本由通过化学相互作用与IL-1分子连接的病毒样颗粒组成，其中这些相互作用的至少一种不是共价键。VLP与IL-1分子的连接可以通过将VLP生物素化并且将IL-1分子表达为链霉抗生物素-融合蛋白而实现。一个或几个抗原分子，即IL-1分子，可以附着到优选RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的一个亚单位上，优选通过RNA噬菌体外壳蛋白VLP的暴露的赖氨酸残基附着，如果空间上允许的话。RNA噬菌体的VLP(特别是QP外壳蛋白VLP)的特定特征因此是每个亚单位能够偶联几个抗原。这允许产生密集的抗原阵列。在本发明的非常优选的实施方案中，IL-1分子通过添加到IL-1分子N末端或C末端上的半胱氨酸或IL-1 分子内的天然半胱氨酸残基与RNA噬菌体的VLP的外壳蛋白(特别是QP的外壳蛋白)的赖氨酸残基连接。如上所述，4个赖氨酸残基暴露于QP外壳蛋白的VLP的表面。典型地,这些残基通过与交联剂分子反应而衍生化。当不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联时，在衍生化步骤后，已与交联剂反应的赖氨酸残基就留下来，交联剂分子附着到e-氨基上。这就使对VLP的溶解性和稳定性可能不利的一种或几种正电荷消失。通过例如在下文所述的
外壳蛋白突变体中那样用精氨酸取代某些赖氨酸残基，我们避免了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基并不能与优选的交联剂反应。此外，用精氨酸取代赖氨酸残基会产生更确定的抗原阵列，因为只有较少的位点可与抗原反应。因此，在下列的QP外壳蛋白突变体中，用精氨酸取代暴露的赖氨酸残基: -240(Lysl3-Arg ；SEQ ID NO: 16), Q ^-250 (Lys2-Arg, Lysl3-Arg, SEQ ID NO:18), -259(Lys2-Arg, Lysl6-Arg ；SEQ ID NO:20)，和 Q P-251 (Lysl6_Arg ;SEQ ID NO:19)。
在一个进一步的实施方案中，我们公开了具有另外一个赖氨酸残基的QP突变外壳蛋白Q ^-243 (AsnlO-Lys ；SEQ ID NO:17)，它适合获得较高密度的抗原阵列。在本发明的一个优选实施方案中，RNA噬菌体的VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的聚阴离子大分子。在一个进一步优选的实施方案中，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在另一个优选实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的免疫刺激物。在进一步优选的实施方案中，所述免疫刺激物是核酸，优选DNA,最优选含非甲基化CpG的寡核苷酸。基本不含宿主RNA、优选宿主核酸:本文所用的术语“基本不含宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、优选宿主核酸的量，该量典型且优选地为每mg VLP不到30 V- g,优选不到20 V- g,更优选不到10 V- g,甚至更优选不到8 y g,甚至更优选不到6 y g,甚至更优选不到4 y g，最优选不到2 y g。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主。测定RNA(优选核酸)的量的常规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA (优选核酸)的量的典型且优选的方法在W02006/037787A2的实施例17中描述。对于含有QP以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA(优选核酸)的量典型且优选地使用相同、相似或类似的 条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。确定的量的数值应当典型且优选地被理解为包括指定数值±10%、优选±5%偏差的数值。聚阴离子大分子:本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。聚阴离子大分子的分子量应当为至少2000道尔顿，更优选至少3000道尔顿，甚至更优选至少5000道尔顿。本文所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优选地不包括Toll-样受体配体，甚至更优选地不包括免疫刺激物，如Toll-样受体配体、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更优选地，本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。甚至更优选地，术语“聚阴离子大分子”不包括免疫刺激物。本文所用的术语“免疫刺激物”是指能够诱导和/或增强特别针对本发明中包括的抗原的免疫应答的分子。宿主RNA、优选宿主核酸:本文使用的术语“宿主RNA、优选宿主核酸”或术语“具有二级结构的宿主RNA、优选宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA或优选核酸。然而，RNA、优选核酸在典型且优选地通过本发明的方法减少或去除RNA、优选核酸的量的过程中可能经受化学和/或物理学改变，例如，RNA、优选核酸的大小可能被缩短，或者其二级结构可能改变。但是，甚至这种得到的RNA或核酸仍然被认为是宿主RNA，或宿主核酸。2004年10月5日同一申请人提交的美国临时申请中公开了确定VLP包含的RNA的量以及减少VLP包含的RNA的量的方法，因此整个申请引入本文作为参考。减少或消除宿主RNA、优选宿主核酸的量，最小化或者减少了不希望的T细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答，和其他不希望的副作用，如发热，而同时保持特异性针对IL-1的强抗体应答。在一个优选实施方案中，本发明提供一种制备本发明的组合物和本发明的RNA-噬菌体的VLP的方法，其中所述VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸，该方法包括以下步骤:a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA-噬菌体的所述外壳蛋白、其变体或片段；c)纯化所述外壳蛋白、其变体或片段；d)将所述纯化的所述RNA-噬菌体的外壳蛋白、其变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(e)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种本发明的抗原与步骤d)获得的所述VLP。在一个进一步优选的实施方案中，重装配所述纯化的外壳蛋白、其变体或片段的步骤在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。在一个方面，本发明提供一种包含本发明的组合物的疫苗。在一个优选实施方案中，在疫苗组合物中与VLP连接的IL-1分子可以是来源于动物，优选来源于哺乳动物或人类。在优选实施方案中，本发明的IL-1来源于人、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、猪或马。在一个优选实施方案中，该疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或允许在宿主中产生储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物结合时能够产生更强的免疫应答。在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如此。而且，不含佐剂使得不希望的炎性T细胞应答的发生减至最少，炎性T细胞应答是针对自身抗原接种中的一个安全性问题。因此，优选地给患者施用本发明的疫苗而不需在施用该疫苗之前、同时或之后给同一患者施用至少一种佐剂。本发明进一步公开了一种免疫方法，包括给动物或人施用本发明的疫苗。所述动物优选地是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、狗、大鼠、小鼠，特别是人。疫苗可以用本领域所知的各种方法给动物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为本发明的疫苗是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发明的疫苗可以诱导可与IL-1结合的抗体，从而降低了它的浓度和/或干扰它的生理学或病理学功能。在一个方面，本发明提供一种包含本发明教导的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。当给个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资料中提供，包括 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol, A, ed, Mack Publishing Co,(1990))。本发明教导了一种制备本发明的组合物的方法，该方法包括以下步骤:(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP ； (b)提供具有至少一个第二附着位点的IL-1分子；和
(c)将所述VLP和所述IL-1分子组合，产生组合物，其中所述IL-1分子和所述VLP通过所述第一附着位点和第二附着位点连接。在一个进一步优选的实施方案中，提供具有至少一个第一附着位点的VLP的步骤包括以下另外的步骤:(a) 将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(C)将所述纯化的所述RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。本发明提供一种使用本发明的组合物治疗和/或减轻其中IL-1发挥重要病理作用的动物或人类的疾病或病症的方法。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病优选地选自:(a)血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF) ；(c)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；
(d)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(e)变态反应病，优选接触过敏、I型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(f)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病是血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是本发明的IL-1a分子，优选IL-1 a成熟片段，最优选SEQ ID NO:63或其突变蛋白。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病选自:(a)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF) ；(b)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(c)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(d)变态反应病，优选接触过敏、I型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(e)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1 P分子，优选IL-1 P成熟片段，最优选SEQ ID NO:64或其突变蛋白。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是血管疾病，优选动脉粥样硬化。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是骨和软骨变性性疾病，优选骨关节炎。本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是神经疾病，优选多发性硬化。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地选自:(a)血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF) ；(c)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(d)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；
(e)变态反应病，优选接触过敏、I型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(f)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地是血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1a分子，优选IL-1 a成熟片段，最优选SEQ ID NO:63或其突变蛋白。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地选自:(a)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF) ；(b)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(c)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(d)变态反应病，优选接触过敏、I型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(e)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1 3分子，优选IL-1 ^成熟片段，最优选SEQ ID NO:64或其突变蛋白。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1 P分子，优选IL-1 P成熟片段，最优选SEQ ID NO:64或其突变蛋白。本发明进一 步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是血管疾病，优选动脉粥样硬化。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎。本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病疾病是骨和软骨变性性疾病，优选骨关节炎。本文引用的所有参考文献都全文引入作为参考。
实施例实施例1鼠ILl a 117_270和IL-1 @ 119_269的克隆、表达和纯化使用寡核苷酸ILl a 1(5’ -ATATATGCTAGCCCCTTACACCTA CCAGAGTGAITTG-3’ ；SEQ ID NO:24)和 ILl a 2 (5，-ATATATCTC GAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATA GAG-3’ ；SEQID NO:25)，通过PCR从TNFa-活化的鼠巨噬细胞cDNA文库中扩增编码鼠IL-1a的氨基酸117-270的核苷酸序列。使用相同的cDNA文库，用寡核苷酸ILlP 1(5’ -ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGC ACTACAGG-3’ ；SEQ ID NO:26)和 ILl P 2 (5，-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3’;SEQ ID NO:27)扩增编码鼠 IL-1 ^ 前体的氨基酸 119-269的核苷酸序列。两条DNA片段用NheI和XhoI消化，并且克隆到表达载体pModECl (SEQ IDNO:29)内。载体pModECl (SEQ ID NO:29)是 pET22b (+) (Novagen Inc.)的衍生物，分两步构建。第一步，将pET22b(+)的NdeI和XhoI位点之间的原始序列替换为退火的oligos引物 MCS-1F(5，-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3，；SEQ ID NO:30)和引物 MCS-1R(5，-TCGAATGCGGCCG CCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3，；SEQ ID NO:31)(在15mM TrisHCl pH 8缓冲液中退火)，由此改变pET22b (+)的多克隆位点。得到的质粒被命名为pModOO，在其多克隆位点中具有NdeI，BamH1、Nhe1、Xho1、PmeI和NotI限制酶切位点。退火 oligos 对 Bamhis6-EK-Nhe-F(5’ -GATCCACACCACCACCACCACCACGG TTCTGGTGA CGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3’ ；SEQ ID NO:32)和 Bamhis6_EKNhe-R(5’ -TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCG TCGTCACCAGAACCGTGGT GGTGGTGGTGGTGTG-3’ ；SEQ ID NO:33)和退火 oligo 对 IF-C-甘氨酸-接头(5，-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3，；SEQ ID NO:34)和 oligolR-C-甘氨酸-接头(5，-GGCCGCGTTTAAACTTATTAACCGCAACCACCACCACCACCC-3’；SEQ ID NO:35) —起连接到 BamH1-NotI 消化的 pModOO 质粒内，获得pModECl，其编码N-末端六组氨酸标签，肠激酶酶切位点和含有一个半胱氨酸残基的C-末端甘氨酸接头。上述片段向pModECl内的克隆分别产生质粒pModECl-HiS-EKiILla117Mt^PpModECl-His-EK-mlLl ^ 119_269。这些质粒分别编码由N-末端His-标签、肠激酶酶切位点、成熟鼠IL-1 a或IL-1 P和含C-末端半胱氨酸的接头(GGGGGCG，SEQ ID NO:28)组成的融合蛋白。对于表达，含有质粒的大肠杆菌BL21细胞在37°C生长至600nm处的OD为1.0，然后加入ImM浓度的异丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导。细菌在37°C下生长4小时，离心收获，重悬浮在80ml裂解缓冲液(IOmM Na2HPO4, 30mM NaCl, pH7.0)中。然后超声处理破碎细胞，在室温下与64 u 12M MgCl2和10 ill Benzonase孵育30分钟消化细胞DNA和RNA。离心除去细胞碎片(SS34转头，20000rpm，4°C，60min)，将澄清的裂解液加到Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen, Hilden, Germany)上。用洗漆缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mMImidazol, pH8.0)充分洗涤后，用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 200mMImidazol,pH8.0)洗脱蛋白质。纯化的蛋白质用PBS pH7.2透析，在液氮中骤冻，并且贮存在-80°C直到进一步使用。实施例2A.小鼠IL-1 P 119-269与QP病毒样颗粒的偶联在PBS pH7.2中含有1.3mg/ml实施例1获得的纯化的鼠IL-1 ^ 119_269蛋白(SEQID NO:66)的溶液在室温下与等摩尔量的TCEP孵育60分钟，以还原C-末端半胱氨酸残基。然后6ml2mg/ml QP衣壳蛋白在PBS pH7.2中的溶液在室温下与131 SMPH溶液(65mM，在DMSO中)反应60分钟。反应溶液在4°C下用3升20mM HEPES，150mM NaClpH7.2透析24小时，其中更换三次透析液。75 U I衍生化并透析的Q P溶液与117 yl H2O和308 Ul纯化并预还原的小鼠几-10119_269蛋白混合，并且在15°C下孵育过夜，用于化学交联。使用分子量截断值为300，OOODa的纤维素酯膜，通过相对于PBS正切流动过滤除去未偶联的蛋白质。偶联的产物在还原条件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。图1中显示考马斯染色的凝胶。可·见几条相对于QP衣壳单体分子量升高的带，清楚地证明了小鼠IL-1P119.蛋白与QP衣壳的成功交联。B.使用与Q3衣壳偶联的小鼠IL-1 ^ 119_269蛋白(Q^-mIL-1 ^ 119_269)免疫小鼠对5 只 balb/c 雌性小鼠用 Q ^ -mlL-1 ^ 119_269 (SEQ ID No:66)进行免疫。将 50 ii g总蛋白质用PBS稀释到200 u 1，并在第0天、第21天皮下注射(100 u I在腹部两侧)。在第0天、第21天和第35天,对小鼠眶后取血,使用小鼠IL-1 & 119_269特异性的ELISA分析血清。C.ELISA使用浓度为I U g/ml的小鼠IL-1 ^ 119_269蛋白包被ELISA板。封闭该板，然后与第0天、第21天、第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm处产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价。抗小鼠IL-1 ^ 119_269的平均效价是第21天1: 22262，第35天I: 309276。这表明使用与小鼠IL-1P119_269蛋白偶联的QP免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1 & 119_269的高效价抗体。D.1L-1 P的体外中和然后测试Q P -mlL-1 ^ 119_269 (SEQ ID No:66)免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1 ^蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为I U g/ml的重组mIL-1受体1-hFc融合蛋白包被ELISA板，并与免疫小鼠的血清的连续稀释液共孵育，所述小鼠已用与QP衣壳偶联的小鼠IL-1 P 119_269免疫或者用与0 3衣壳偶联的小鼠IL-1 a 117_2ro与100ng/ml的小鼠IL-1 P 119_269免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-1 P抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素蛋白来检测IL-1 ^ 119_269与固定化的mIL-1受体1-hFc融合蛋白的结合。所有的针对鼠IL-1 ^ 119_269免疫的小鼠的血清在浓度为> 0.4%时完全抑制小鼠IL-1 ^ 119_269与其受体的结合，而针对小鼠IL-1 a 117_270免疫的小鼠的血清甚至在最高使用浓度(3.3% )时都没有显示任何抑制效果。这些数据表明用偶联到QP衣壳上的小鼠IL-1 0119_269免疫能够产生能够特异性地中和小鼠IL-1 ^ 119_269与其受体相互作用的抗体。E.1L-1 @的体内中和然后研究了通过用QP-mIL-1P119_269 S疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天用QP -mlL-1 P 119_269对4只balb/c雌性小鼠免疫两次，同时单独用Q3衣壳对4只小鼠免疫。在第21天对所有小鼠静脉注射I U g游离IL-1 P 119_269。作为注射的IL-1 ^ 119_269的炎症活性的读数，在注射3小时后分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。QP免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加1.01±0.61ng/ml，而用Q^-mIL-1 P 119_269免疫的小鼠则显示出平均增加只有0.11 + 0.30ng/ml (p = 0.004)。作为对照，在第28天对所有小鼠注射I U gmIL-1 a。注射3小时后，仅用QP载体免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加40.24±8.06ng/ml，而用QP -mIL-1 ^ 119_269免疫的小鼠则显示出增加57.98±29.92ng/ml (p = 0.30)。这些数据表明用Q3 -mIL-1 ^ 119_269免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1a的促炎症反应活性。 F.Q^ -mlL-1 ^ 119_269对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试QP -mIL-1 ^ 119_269免疫的有效性。这个模型反映出人类类风湿性关节炎的免疫学和组织学的大部分方面，因而常规地用来测试抗炎剂的有效性。对DBA/1雄性小鼠通过皮下单独注射50 ug -mlL-1 ^ 119_269 (n = 8)或者QP (n = 8)来免疫三次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200ii g牛II型胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200ii g牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢给予范围从0-3的临床评分。连续3周按照以下定义给予每个肢临床评分:0正常，I轻度红斑和/或趾/爪肿胀，2红斑和扩展到全爪/关节的肿胀，3严重的肿胀，爪/关节变形，僵硬。计算单个小鼠的累积临床评分，作为所有四肢的临床评分总和，得到每只小鼠可能的最大累积评分为12。第二次胶原注射2周后，免疫的小鼠显示出4.44的平均累积临床评分，而 -mIL-1 P 119_269免疫小鼠显示出仅为1.06的平均累积临床评分。而且,QP免疫的小鼠的
后肢踝关节厚度平均增长18%,而已经用QP -mIL-1 ^ 119_269免疫的小鼠平均增长仅为1%。在第二次胶原注射I周后，测量血清IL-6水平，作为炎症反应的另外的读数。免疫的小鼠的平均IL-6血清浓度为1.92±0.36，而Q @ -mlL-1 ^ 119_269免疫小鼠的平均IL-6血清浓度仅为0.79±0.16 (p = 0.01)。综合考虑，这些数据显示QP -mIL-1 ^ 119_269免疫强有力地保护CIA模型小鼠 不出现炎症和关节炎的临床体征。实施例3
A.小鼠IL-1 a 117_270与Q0病毒样颗粒的偶联在PBS pH7.2中含有1.8mg/ml实施例1获得的纯化的鼠IL-1 a 117_270蛋白(SEQID NO:65)的溶液在室温下与等摩尔量的TCEP孵育60分钟，以还原C-末端半胱氨酸残基。然后6ml2mg/ml 衣壳蛋白在PBS pH7.2中的溶液在室温下与131 u I SMPH溶液(65mM，在DMSO中)反应60分钟。反应溶液在4°C下用3升20mM HEPES，150mM NaClpH7.2透析24小时，其中更换三次透析液。75 U I衍生化并透析的Q P溶液与192 u I H2O和233 Ul纯化并预还原的小鼠IL-1 a 117_27(|蛋白混合，并且在15°C下孵育过夜，用于化学交联。使用分子量截断值为300，OOODa的纤维素酯膜，通过相对于PBS正切流动过滤除去未偶联的蛋白质。偶联的产物在还原条件下的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。图2中显示考马斯染色的凝胶。可见几条相对于QP衣壳单体分子量升高的带，清楚地证明了小鼠IL-1 a 117_270蛋白与QP衣壳的成功交联。B.使用与 Q3 衣壳偶联的小鼠 IL-1 a 117_270 蛋白(Q3a 117_27。)免疫小鼠对5只balb/c雌性小鼠用Q ^ -mlL-1 a 117_270进行免疫。将50 y g总蛋白质用PBS稀释到200 u 1，并在第0天、第21天对小鼠皮下注射(100 u I在腹部两侧)。在第0天、第21天和第35天，对小鼠眶后取血，使用小鼠IL-1 a 117_270特异性的ELISA分析血清。C.ELISA使用浓度为I ii g/ml的小鼠IL-1 a 117_270蛋白包被ELISA板。封闭该板,然后与第0天、第21天、第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价。抗小鼠IL_la117_2ro的平均效价是第21天1: 9252，第35天1: 736912。这表明使用与小鼠IL-la117_27(l蛋白偶联的QP免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1 a 117_270的高效价抗体。D.1L-1 a的体外中和然后测试QP -mIL-1 a 117_270免疫小鼠的血清抑制小鼠IL_1 a 117_27(|蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为I U g/ml的重组mIL-1受体1-hFc融合蛋白包被ELISA板，并与免疫小鼠的血清的连续稀释液共孵育，所述小鼠已用与QP衣壳偶联的小鼠IL-1 a 117_270免疫或者用与Q3衣壳偶联的小鼠IL-1 ^ 119_269与5ng/ml的小鼠IL-1 a 117_27(|免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-1 a抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素蛋白来检测IL-1 a 117_27Q与固定化的mIL-1受体1-hFc融合蛋白的结合。所有的针对鼠IL-1 a 117_27(|免疫的小鼠的血清在浓度为彡0.4%时完全抑制小鼠IL-1 a 117_27(|与其受体的结合，而针对小鼠IL-1 P 119_269免疫的小鼠的血清甚至在最高使用浓度(3.3%)时都没有显示明显的抑制效果。这些数据表明用偶联到QP衣壳上的小鼠IL-la117_27(l免疫能够产生能够特异性地中和小鼠IL-1 a 117_270与其受体相互作用的抗体。E.1L-1 a的体内中和然后研究了通过用QP-mIL-la117_27Q免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天用QP -mIL-1 a 117_270对4只balb/c雌性小鼠免疫两次，同时单独用Q3衣壳对4只小鼠免疫。在第21天对所有小鼠静脉注射I U g游离IL-1 a 117_27(|。作为注射的IL-1 a 117_270的炎症活性的读数，在注射3小时后分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。QP免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加8.16±2.33ng/ml，而用Q^-mIL-1 a 117_270免疫的小鼠则显示出平均增加只有0.15±0.27ng/ml (p = 0.0005)。作为对照，在第28天对所有小鼠注射I U gmIL-1 P。注射3小时后，仅用Q ^载体免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加9.52±7.33ng/ml，而用QP -mIL-1 a 117_270免疫的小鼠则显示出增加21.46±27.36ng/ml(p = 0.43)。这些数据表明用Q 3-mIL-1 a 117_2ro免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1a的促炎活性。F.Q^ -mlL-1 a 117_270对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试QP -mIL-1 a 117_270免疫的有效性。这个模型反映出人类类风湿性关节炎的免疫学和组织学的大部分方面，因而常规地用来测试抗炎剂的有效性。对DBA/1雄性小鼠通过皮下单独注射50 ug -mlL-1 a 117_270 (n = 8)或者QP (n = 8)来免疫三次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200ii g牛II型胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200 y g牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢进行实施例2F定义的临床评分。第二次胶原注射2周后，Q3免疫小鼠显示出4.44的平均累积临床评分,而QP -mIL-1 a 117_27(|免疫小鼠显示出仅为2.31的平均累积临床评分。而且，QP免疫小鼠的后肢踝关节厚度平均增长18%，而已经用QP -mIL-1 a 117_27(|免疫的小鼠平均增长仅为7%。在第二次胶原注射I周后，测量血清IL-6水平，作为炎症反应的补充读数。QP免疫小鼠的平均IL-6血清浓度为1.92±0.36，而QP -mIL-1 a 117_270免疫小鼠的平均IL-6血清浓度仅为0.94±0.48。综合考虑，这些数据显示QP -mIL-1 a 117_270免疫保护CIA模型小鼠不出现炎症与关节炎的临床体征。实施例4
Q ^ -mlL-1 a 117_270对动脉粥样硬化小鼠模型的有效性在第O、第14、第28、第56、第105和第133天，对7到8周龄的Apoe+雄性小鼠(Jackson 实验室，Bar Harbor ME)皮下注射 50 u gQ ^ -mlL-1 a 117_270 疫苗(n = 13)或者50u g (n = 12) (5只动物，Q^ -mlL-1 a 117_270组中的3只和Q^组中的2只在第33天接受第二次加强注射)。最初对小鼠用正常饮食喂养，在第21天时用西式饮食代替(20%脂肪，0.15%胆固醇，Provimi Kliba AG，瑞士)。在实验中，对小鼠定期取血，测量血清中对IL-1 a的抗体应答。在第159天处死小鼠，基本上按照Tangirala R.K.等人(1995)J.Lipid.Res.36:2320-2328所述分离和准备主动脉。另外，基本上按照Paigen B.等人(Atherosclerosisl987 ；68:231-24)和 Zhou X 等人(Arterioscler Thromb VascBiol2001 ；21 =108-114)所述，取出心脏并在液氮中快速冷冻以备后续的组织学制备。通过心脏穿刺对动物取血,并灌注冷PBS。然后暴露主动脉，尽可能地原位去除外膜，最后从距心脏2mm处切断主动脉。将心脏从中切开，将上半部分在液氮中塑料管中的Hank平衡盐溶液中立即冷冻。用恒冷切片机穿过主动脉的起点进行连续切片(7 厚度)，在至少出现两个瓣叶收集，直到最后一个瓣叶消失。在福尔马林中固定切片，用油红0染色，使用定量图像分析评价每只小鼠的4-7个切片的斑块负荷(QP组中每只动物3个切片)。根据用于评价的每个切片的斑块面积来计算每只动物的平均斑块面积。分别计算QP -mIL-1 a 117_270和00组的组平均斑块面积。通过Student t检验来进行统计分析。认为P < 0.05在统计上有意义。为了评价整个主动脉的动脉粥样硬化，在充满冷PBS的玻璃培养皿中进一步清除残留的外膜，并从左锁骨下动脉向下5_切成拱形。纵切主动脉，别在黑蜡表面上，固定在4%的福尔马林中过夜。然后在油红0中过夜染色。用数码照相的成像软件(Motic ImagePlus2.0)对斑块定量。将取自直到髂骨分叉的主动脉的所有斑块的表面总和除以测得的直到髂骨分叉的主动脉的总表面，以百分数形式来表述斑块负荷。以斑块负荷的平均值或者中间值来分析Q P -mlL-1 a 117_270和Q P组之间的差别。使用重组IL-1 a包被的ELISA板，以经典ELISA测量抗体应答。使用山羊抗小鼠HRP偶联物来检测特异性抗体的结合。以在测试中获得半数最大结合的血清稀释度的倒数来计算抗IL-1 a效价。通过测量免疫前血清来评价应答的特异性。免疫前效价低于测试所用的最低血清稀释度，并指定它为最低血清稀释度值。QP -mIL-1 a 117_27(|免疫动物的抗体应答的测量结果如表I所示，清楚地显示出用与QP偶联的鼠IL-1a免疫产生了对IL-1a的强烈而持续的特异性抗体应答，因为在免疫前(dO)血清中几乎没有检测到效价。而且，IL-1 a特异性抗体应答的诱导导致QP -mIL-1 a 117_27(|组在主动脉起点的斑块面积比03组减少了 37% (292803±21272iim2 对 464694±36545iim2，p = 0.0005)。另外，在整个制备的主动脉“正面”观察到斑块负荷中间值减少31% (5.7对8.3，p = 0.06)。这些数据表明，-mIL-1 a 117_270疫苗对抗IL_1 a抗体的诱导抑制了动脉粥样硬化的发展，因而Q P -mIL-1 a 117_270疫苗是对动脉粥样硬化的一种有效的治疗。而且，这些数据表明IL-1 a与动脉粥样硬化的发病机理有关。表1:Qb_ILl a免疫的Apoe+小鼠中的抗ILl a抗体效价的几何平均值(几何平均效价土平均标准差) __dQ d21 d28* d56 d84 d!05 d!59
几何平均值 <1000 225400± 167867± 522864士 712061± 621687士 805370士±SEM 0 93385 121345 106887 144922 184389 155764*对于5只动物，第33天获得的数值。实施例5使用Q ^ -mIL-1 a 117_270和/或Q 3^ 119_269免疫预防TNBS诱导的炎性肠病对8周龄的SJL雄性小鼠(每组5只)，以2周的间隔3次皮下注射50 ii gQ 3 -mlL-1 a 117_270 或者 50 ii g Q 3 -mlL-1 3 119-269 或者各 50 ii gQ 3 -mlL-1 a 117_270 与Q3 -mlL-1 & 119_269的混合物。以同样方案单独注射QP VLP的5只小鼠作为对照。最后一次免疫2周后，将所有的小鼠用异氟烷轻度麻醉，在距离肛门4cm处通过聚乙烯导管直肠内施用溶于100iil50%乙醇的Img三硝基苯磺酸(TNBS)。每日记录体重作为疾病进程的读数，在施用TNBS7天后处死所有小鼠。取出每只小鼠的结肠，将位于临近肛门2cm处的结肠标本固定于PBS缓冲的福尔马林中，依照Neurath M.F.等人(JEM(1995), 182 =1281-1290)所述，根据苏木精-和伊红-染色的结肠横切片对炎症程度半定量评价。与Q @免疫小鼠相比，单独用Q e -mlL-1 a 117_270或者Q @ -mlL-1 ^ 119_269或者用Q @ -mlL-1 a 117_270与Q P -mlL-1 ^ 119_269的组合免疫，降低了 TNBS诱导的体重减轻。而且，结肠横切片的组织学检查表明，与QP免疫小鼠相比，Q^-mIL-1 a 117_270和/或Q ^ _mIL_l @ 119_269免疫小鼠显不出炎症细胞向结肠组织的浸润显者减少。实施例6Q P -mlL-1 ^ 119_269免疫对于携带截短型MEFV基因的小鼠中内毒素-超敏反应的改善家族性地中海热是一种隐性遗传炎性疾病，特征为阵发性回归热以及腹膜炎、浆膜炎、关节炎和皮疹。患者携带的MEFV基因发生错义突变，导致截短型热蛋白(pyrin)的表达。MEFV基因具有类似突变的小鼠，显示出增强的半胱天冬酶-1活性，导致成熟IL-1 ^过量产生、体温过低以及施用LPS后致死率的增加。对8周龄的纯合热蛋白-截短型小鼠(每组5只)以2周的间隔每次单独使用50 ii g -mlL-1 ^ 119_269或者50 y g QP VLP进行3次免疫。最后一次免疫2周后，对所有小鼠腹膜内注射20mg D-半乳糖胺与0.01 u g/g LPS的混合物。与Q P免疫对照组相比，Q P -mlL-1 ^ 119_269免疫小鼠显示出明显减少的体温过低和降低的LPS施用引起的致死率。实施例7Q ^ -miL-1 a 117_27(1、q @ -miL-1 ^ 119_269 免疫与Kineret 治疗在类风湿性关节炎小鼠模型中的比较Kineret (Anakinra, Amgen)是一种重组的人IL-1受体拮抗剂，被批准用来治疗人类类风湿性关节炎。为了达到临床效果，必须每天通过皮下注射使用相对高的剂量(IOOmg)。用胶原诱导的关节炎模型来比较QP -mIL-1 a 117_270, Q^-mIL-1 ^ 119_269免疫与每日应用不同剂量Kineret 的有效性。对DBA/1雄性小鼠用50 y g Q^-mIL-1 a 117_270 (n =8)、Q 0 -mlL-1 ^ 119_269 (n = 8)或者单独QP (n = 32) 3次(第0天、第14天和第28天)皮下免疫，然后在第42天 皮内注射200 u g与完全弗氏佐剂混合的牛11型胶原。从第42天起，用Q ^ -mlL-1 a 117_270与Q @ -mlL-1 ^ 119_269免疫的小鼠与一组Q ^免疫的小鼠(n = 8)每日接受腹膜内注射200 ill PBS，而另外三组QP免疫的小鼠每日接受腹膜内注射37.5iig(n =8) >375u g(n = 8)或者3.75mg(n = 8) Kineret 。每只小鼠每日注射37.5u gKineret 大致相当于1.5mg/kg的剂量，这在推荐的对于人类有效的剂量范围内(IOOmg)。所有的小鼠在第63天加强注射200 u g与不完全弗氏佐剂混合的牛II型胶原，并每日检查关节炎症状的发展。第二次胶原注射4周后，免疫的对照小鼠显示出3.75的平均累积临床评分(如实施例2F定义的)，而Q3 -mlL-1 a 117_270和Q3 -mlL-1 3 119_269免疫的小鼠分别显不出仅为0.81和1.44的平均评分(见表2)。用37.5 ii g或者375 u g Kineret 治疗的小鼠分别达到了 2.44和2.63的平均评分,而用3.75mgKineret 治疗的小鼠基本保持无症状，达到了仅为0.19的最高评分。定期测量所有动物的后踝关节厚度，作为炎症反应的附加读数。第二次胶原注射4周后，免疫的对照小鼠显示出后踝关节厚度平均增加16%，而Q0-mIL-la117_2ro免疫的小鼠显示出增加2 %，Q @ -mlL-1 ^ 119_269免疫的小鼠显示出增加6 %。用37.5u g或者375y g Kineret 治疗的小鼠分别显示出13%和10%的平均增加，而用
3.75mg Kineret 治疗的小鼠则显示出后踝关节厚度完全没有增加。总之，我们惊奇地发现二次注射-mlL-1 a 117_270或者-mlL-1 @ 119_ffi9要比每日以与人类相当的剂量或者甚至十倍于人类的剂量注射Kineret 更好地保护小鼠免于关节炎症状的发展。只有应用100倍于人类的剂量的Kineret 时才显示出对应于Q^-mIL-1 a 117_270或者Q0 -mIL-1 ^ 119_269免疫接种的增强的有益效应。表2:胶原诱导的关节炎模型中的临床疾病症状
权利要求
1.一种组合物，其包含: (a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);和 (b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原， 其中所述至少一种抗原是IL-1分子，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，且 其中优选所述IL-1分子选自IL-1 β分子和IL-1 α分子。
2.权利要求1的组合物，其中所述IL-1分子选自:(a)IL-1 蛋白； (b)IL-1成熟片段；(c)IL-1 片段；(d)IL-1 肽；和 (e)IL-l突变蛋白。
3.权利要求1的组合物，其中所述IL-1分子来源于人类。
4.权利要求1的组合物，其中所述IL-1分子是IL-1α分子。
5.权利要求4的组合物，其中所述IL-1a分子选自: (a)IL-1a 蛋白； (b)IL-1 a成熟片段；(c)IL-1 a 片段；(d)IL-1 a 肽；和 (e)IL-1 a突变蛋白。
6.权利要求4的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 a蛋白:(a)人IL-1 a (SEQ ID NO:36)； (b)SEQID NO:37 至 SEQ ID NO:48 中的任一种；和 (c)与SEQID NO:36至SEQ ID NO:48中的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95%或最优选至少99%相同的氨基酸序列。
7.权利要求4的组合物，其中所述IL-1分子是包含选自下组的氨基酸序列或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 α成熟片段:(a)人IL-1α 119—271(SEQ ID NO:63)；(b)小鼠IL-1 α 117-270 (SEQ ID NO:163);和 (c)与SEQID NO:63或SEQ ID NO:163的任一种至少80%、或优选至少90%、更优选至少95 %或最优选至少99 %相同的氨基酸序列。
8.权利要求4的组合物，其中所述IL-1分子是包含SEQID NO:63或优选地由该氨基酸序列组成的IL-1 α成熟片段。
9.权利要求1 的组合物，其中所述VLP包含或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。
10.权利要求9的组合物，其中所述外壳蛋白具有SEQID NO:3的氨基酸序列。
11.权利要求1的组合物，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP，且其中优选所述RNA噬菌体是噬菌体Q β。
12.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个共价键连接，其中优选地所述共价键是非肽键，且其中更优选所述第一附着位点包含或者优选地是氨基，优选赖氨酸的氨基，且其中再更优选所述第二附着位点包含或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
13.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点不是巯基。
14.权利要求1的组合物，其中所述VLP和所述至少一种抗原的所述连接不包含二硫键。
15.权利要求1的组合物，其中只有一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键连接，产生单一且均匀类型的所述IL-1分子与所述病毒样颗粒的结合，其中与所述第一附着位点连接的所述只有一个第二附着位点是巯基，并且其中所述IL-1分子和所述病毒样颗粒通过所述连接相互作用以形成有序且重复的抗原阵列。
16.权利要求1的组合物，其中所述抗原与噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。
17.权利要求1的组合物，其进一步包括接头，其中所述接头通过至少一个共价键与所述IL-1分子联接，且其所述接头包含所述第二附着位点或者由所述第二附着位点组成，且其中更进一步优选地所述接头是进一步包含半胱氨酸作为第二附着位点的甘氨酸接头(G)Πο
18.权利要求1的组合物，其中所述IL-1分子是SEQID NO:63或其衍生的突变蛋白。
19.一种疫苗，其包含权利要求1-10中任一项的组合物或者由该组合物组成，其中优选所述疫苗不含佐剂。
20.一种药物组合物，其包含: (a)权利要求1-18任一项的组合物或权利要求19的疫苗；和 (b)药学上可接受的载体。
21.—种制备权利要求1-18任一项的组合物或权利要求19的疫苗的方法，所述方法包括: (a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP； (b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子；和 (c)将所述VLP与所述至少一种抗原相连接以产生所述组合物或所述疫苗，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
22.权利要求1-18任一项的组合物、权利要求19的疫苗或权利要求20的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病优选地选自动物、优选人类中的: (a)血管疾病； (b)遗传性IL-1-依赖性炎性疾病； (c)慢性自身免疫炎性疾病； (d)骨和软骨变性性疾病； (e)变态反应疾病；和 (f)神经疾病。
23.权利要求22的用途，其中所述疾病是血管疾病，其中所述血管疾病是动脉粥样硬化。
24.权利要求22的用途，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖性炎性疾病，其中所述遗传性IL-1-依赖性炎性疾病是家族性地中海热(FMF)。
25.权利要求22的用途，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，其中所述慢性自身免疫炎性疾病是全身发作青少年特发性关节炎或类风湿性关节炎，优选类风湿性关节炎。
26.权利要求22的用途，其中所述疾病是骨和软骨变性性疾病，其中所述骨和软骨变性性疾病是痛风或骨关节炎。
27.权利要求2 2的用途，其中所述疾病神经疾病，其中所述神经疾病是多发性硬化。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种包含有序且重复的抗原阵列的组合物，其中所述抗原是IL-1蛋白、IL-1突变蛋白或IL-1片段。更具体地，本发明提供一种包含病毒样颗粒和与该病毒样颗粒连接的至少一种IL-1蛋白、IL-1突变蛋白或至少一种IL-1片段的组合物。本发明还提供一种制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备治疗炎性疾病和慢性自身免疫病、遗传疾病和心血管疾病的疫苗。本发明的组合物有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答。而且，本发明的组合物尤其可用于在所述环境内有效地诱导自身特异性免疫应答。
文档编号A61P37/08GK103230590SQ20131014419
公开日2013年8月7日 申请日期2006年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者M·巴克曼, G·斯庞, A·蒂索特 申请人:赛托斯生物技术公司