专利名称：一种核磁共振造影剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种核磁共振造影剂的制备方法，属于医用化学技术领域。
背景技术：
癌症是导致人类死亡的第二大疾病。在我国每年因癌症死亡的人数达250万，而每年新增癌症患者约350万。在人们眼中得了癌症就像被判了死刑一样，癌症之所以致死率这么高是因为大部分的癌症很难在早期时候查出，等到中、晚期的时候，往往错过了最佳治疗时机。如果癌症能够在早期被诊断出来并及时进行治疗的话，就可以在最大程度上挽救病人的生命。因此，全面的癌症早期检查显得格外重要。为实现癌症的早期诊断有以下两种方法:通过改善仪器性能来提高灵敏度；借助造影剂来提高灵敏度。就目前来讲，改善仪器性能这一种方法的实现，周期长，困难大，且国内尖端技术掌握程度不及国外。所以说我们能够较容易做且行之有效的方法就是通过合成效果好的、易于制备、价格低廉的成像造影剂。一般说来，可以作为成像造影剂的材料应满足以下几个要点:材料需具有较好的生物相容性、低的生物毒性、良好的水溶性和稳定性，其次就是要求材料能够选择性靶向到达病变细胞，同时在人体内停留的时间要适中。核磁共振成像(MRI)对人体没有游离辐射损伤；对软组织有极好的分辨力；可对人体各部位多角度、多平面成像；其分辨力高，能更客观更具体地显示人体内的解剖组织及相邻关系，对病灶能更好地进行定位定性，是目前临床最常用的疾病检测方法之一。Fe3O4纳米颗粒作为MRI成像的阴性对比剂，可明显缩短组织的T2驰豫时间，使组织T2信号减低，而对T1影响较小。当Fe3O4纳米粒粒径在50nm 54 y m之间时，在体内主要被网状内皮系统获取，主要用于肝脏等富含吞噬细胞器官的MRI成像。肝脏T2信号改变与肝实质内枯否氏细胞的数量及功能有关，肝癌等恶性肿瘤因不含或仅含少量枯否氏细胞。当注射Fe3O4纳米粒后，肿瘤的T2信号强度保持不变，而周围正常的肝实质T2信号明显减低，故可提高恶性肿瘤的检出率；而肝硬化`结节、局灶性结节增生等良性疾病则因含有枯否氏细胞而吞噬Fe3O4纳米粒，导致信号降低，故可提高疾病的诊断和鉴别诊断水平。当Fe3O4纳米粒径<30nm时，可逃避吞噬细胞的吞噬，在细胞间通透移动，适用于带有特定分子的细胞组织成像，可以将其与一些疾病的特异性标记物(如抗原、多肽、受体等)结合即可成为特异性靶向MRI成像造影剂，可实现Fe3O4纳米粒在疾病部位的特异性位点聚集，导致局部T2信号减低，从而达到特异性诊断的目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种核磁共振造影剂的制备方法。术语解释:MR1:核磁共振成像。AFP:甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein)。VEGF:血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor)。
VEGFC:血管内皮生长因子 C (Vascular endothelial growth factor C)。VEGF-Rl:血管内皮生长因子受体Rl。VEGFR-2:血管内皮生长因子受体R2。EGF:表皮生长因子(Epidermal growth factor)。CEA:癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen)。PBS:0.0lM磷酸盐缓冲液。本发明的技术方案如下:一种核磁共振造影剂制备方法，步骤如下:(I)取还原性糖与三价铁盐按摩尔比7:10-20，溶于去离子水中，用碱调节pH至10，搅拌0.5h，得混悬液；(2)将步骤(I)得到的混悬液转移至反应釜中，在120°C _210°C条件下反应12h-48h，冷却至室温；将上层液体倒掉，得到黑色沉淀；(3)将步骤(2)中得到的黑色沉淀，分别用去离子水、无水乙醇洗涤3-5次，再分散于大量的溶水中，超声处理5-10分钟，得到Fe3O4纳米颗粒分散液；(4)将步骤(3)得到的Fe3O4纳米颗粒分散液利用表面修饰剂在37°C条件下，反应12-24h，进行表面修饰，再将其与肿瘤标记物于37°C孵育12小时，冲洗离心弃上清后即得特异性核磁共振造影剂。根据本发明优选的，步骤(I)所述的还原性糖是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖或麦芽糖中的一种。步骤(I)所述的三价铁盐是氯化铁、硝酸铁、乙酸铁、硫酸铁或高氯酸铁中的一种。步骤(I)所述的碱是氨水、NaOH, KOH或LiOH中的一种。步骤(I)所述的去离子水为溶解量的去离子水。步骤(2)中的反应温度为120°C、150°C、180°C或210°C中的一种。步骤(2)中的反应时间为12h、18h、24h、32h、40h或48h中的一种。步骤(4)所述的表面修饰剂是精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种，Fe3O4纳米颗粒与表面修饰剂按摩尔比在1:100-1000范围内。步骤(4)所述的肿瘤所表达的特异性标记物是AFP、VEGF, VEGFC, VEGF-RUVEGFR-R2、EGF或CEA肿瘤或其他疾病所表达的的特异性标记物。市场可购。进一步优选的，一种核磁共振造影剂的备方法，步骤如下:
(I)称取0.524g葡萄糖溶解在25ml水中，再称取0.90g无水？冗13溶于其中；用25%的氨水调节pH至10并搅拌0.5h，得混悬液；(2)将步骤(I)得到的混悬液转移至反应釜中，在烘箱中，保持180°C反应48h，冷却至室温，将上层液体倒掉，得到黑色沉淀；(3)将步骤(2)中得到的黑色沉淀，分别用去离子水、无水乙醇洗涤3-5次，再分散于大量的溶水中，超声处理5分钟，得到Fe3O4纳米颗粒分散液；(4)将步骤(3)得到的Fe3O4纳米颗粒分散液利用精氨酸在37°C条件下，反应12h，进行表面修饰，将其与肿瘤标记物AFP37°C孵育12h，冲洗离心弃上清后即得核磁共振造影剂。
本发明的核磁共振造影剂应用于核磁共振成像。首先将该靶向性造影剂与肝癌细胞HepG2进行共培养，设置不同的浓度梯度，37°C孵育过夜，然后弃培养液，PBS充分洗涤后将细胞消化，再加入新鲜培养基进行成像。将造影剂水溶液适量尾静脉注射到患病大鼠模型体内，然后于0.5h、lh进行MRI扫描。发现在细胞实验中靶向组较非靶向组信号明显降低，信号强度随剂量的增加而降低；动物试验中注射对比剂后肝脏肿瘤T2WI信号强度明显降低。证明本发明的造影剂效果显著。扫描采用3.0T MRI扫描仪(美国GE公司，Signa EXCITE)，膝关节线圈，扫描序列为 T2WI,扫描参数为:FRFSE 序列，TR=2000ms-4600ms，TE=108.7ms，层厚=3.0mm-6.0mm，层间距=1.0，矩阵=448X256。产物的物相通过X光衍射谱(XRD )测试，采用Bruker D8X-射线衍射仪以Cu_K a射线(波长X= 1.54178 A)为衍射光源对产物作X光衍射分析。产物的形貌通过透射电子显微镜照片(TEM)显示，日本电子JEM - 1011型透射电子显微镜。产品的表面修饰的官能团通过傅里叶变换红外光谱仪测试，Bruker VERTEX-70。该造影剂通过调节还原性糖与铁源的相对含量来调控Fe3O4纳米颗粒的尺寸和磁性大小，一步即可得到人体友好、具有水溶性的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，其表面覆盖碳，带有羧基等官能团。此种方法操作简单、原料易得、处理方便，可以适用于大批量制备。制备出的材料在水中表现出良好的分散性和稳定性，粒径较大的纳米粒可直接应于肝脏枯否细胞的特异性MRI成像；而较小的纳米粒与不同疾病的靶向标记物抗体结合后即可成为靶向造影剂，从而实现该病变的特异性MRI成像，实现特异性诊断，从而显著提高了 MRI对病变的检出率、敏感性及准确性。
图1本发明实施例1制备的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的X射线衍射(XRD )。图2本发明实施例1制备的Fe3O4纳米颗粒的透射电子显微镜照片(TEM)。图3本发明实施例1制备的Fe3O4纳米颗粒红外光谱图。图4利用本发明制备的AFP靶向-Fe3O4纳米颗粒在不同剂量梯度下与HepG2肝癌细胞孵育后的T2WI信号改变情况图。图5用本发明制备的AFP靶向-Fe3O4纳米颗粒在荷瘤大鼠尾静脉注射前后进行的T2WI冠状扫描图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。肿瘤标记物AFP、CEA,北京中生利康科技有限公司有售。VEGF、VEGFC, VEGF-RUVEGFR-R2、EGF、Abcam生物制剂公司有售。肝癌细胞ItepG2上海艾研生物科技有限公司有售
实施例1:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤如下:(I)称取0.524g葡萄糖溶解在25ml水中，再称取0.90g无水？冗13溶于其中；用25%的氨水调节pH至10并搅拌0.5h，得混悬液；(2)将步骤(I)得到的混悬液转移至反应釜中，在烘箱中，保持180°C反应48h，冷却至室温，将上层液体倒掉，得到黑色沉淀；(3)将步骤(2)中得到的黑色沉淀，分别用去离子水、无水乙醇洗涤3-5次，再分散于大量的溶水中，超声处理5分钟，得到Fe3O4纳米颗粒的分散液；(4)将步骤(3)得到的Fe3O4纳米颗粒分散液利用精氨酸在37°C条件下，反应12h，进行表面修饰，将其与肿瘤标记物AFP37°C孵育12h，冲洗离心弃上清后即得靶向核磁共振造影剂。核磁共振造影剂的应用:首先将该靶向造影剂与肝癌细胞HepG2进行共培养，设置不同的浓度梯度，37°C孵育过夜，然后弃培养液，PBS充分洗涤后将细胞消化，再加入新鲜培养基进行成像。将靶向造影剂水溶液适量尾静脉注射到患病大鼠模型体内，然后于0.5h、lh进行MRI扫描。结果发现在细胞实验中靶向组较非靶向组信号明显降低，信号强度随剂量的增加而降低(见图4);动物试验中注射对比剂后肝脏肿瘤T2WI信号强度明显降低(见图5)。证明本发明的造影剂效果显著。实施例2:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用硝酸铁代替氯化铁。实施例3:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用乙酸铁代替氯化铁。实施例4:一 种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用硫酸铁代替氯化铁。实施例5:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用高氯酸铁代替氯化铁。实施例6:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为0.45g。实施例7:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为0.60g。实施例8:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为0.75g。实施例9:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为1.05g。实施例10:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为1.20g。实施例11:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是无水氯化铁质量为1.35g。实施例12:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应温度为120。。。实施例13:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应温度为150。。。实施例14:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应温度为1800C o
实施例15:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应温度为210。。。实施例16:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应时间为16h。实施例17:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应时间为24h。实施例18:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应时间为32h。实施例19:一种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应时间为40h。实施例20:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是反应时间为48h。实施例21:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应时间为16h。实施例22:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应时间为24h。实施例23:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应时间为32h。实施例24:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应时间为40h。
实施例25:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应时间为48h。实施例26:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应温度为120°C。实施例27:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应温度为150°C。实施例28:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应温度为180°C。实施例29:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例10，不同之处是反应温度为210°C。实施例30:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用NaOH水溶液代替氨水。实施例31:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用KOH水溶液代替氨水。实施例32:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用VEGF代替AFP。实施例33:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用VEGFC 代替 AFP。实施例34:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用EGF-Rl 代替 AFP。实施例35:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用EGFR-2 代替 AFP。实施例36:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用EGF代替AFP。实施例37:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用CEA代替AFP。实施例38:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用赖氨酸代替精氨酸。实施例39:—种核磁共振造影剂的制备方法，步骤同实施例1，不同之处是用组氨酸代替精氨酸。实验结果发现在制备超顺磁性Fe3O4时，与铁源关系不大，还原性糖应首选葡萄糖，葡萄糖与铁源的摩尔比在2:5时效果最佳，反应温度在140°C以上时无显著差别，时间最好保证24h以上；表面修饰时，采用赖氨酸、精氨酸、组氨酸，效果相差不大；连接不同肿瘤标记物时，都明显提高 诊断准确率和鉴别诊断的水平，效果显著。
权利要求
1.一种核磁共振造影剂的备方法，其特征在于步骤如下: (1)取还原性糖与三价铁盐按摩尔比7:10-20，溶于去离子水中，用碱调节pH至10，搅拌0.5h，得混悬液； (2)将步骤(I)得到的混悬液转移至反应釜中，在120°C_210°C条件下反应12h-48h，冷却至室温；将上层液体倒掉，得到黑色沉淀； (3)将步骤(2)中得到的黑色沉淀，分别用去离子水、无水乙醇洗涤3-5次，再分散于大量的溶水中，超声处理5-10分钟，得到Fe3O4纳米颗粒分散液； (4)将步骤(3)得到的Fe3O4纳米颗粒分散液利用表面修饰剂在37°C条件下，反应12-24h，进行表面修饰，再将其与肿瘤标记物于37°C孵育12小时，冲洗离心弃上清后即得特异性核磁共振造影剂。
2.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的还原性糖是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖或麦芽糖中的一种。
3.如利要求I述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的三价铁盐是氯化铁、硝酸铁、乙酸铁、硫酸铁或高氯酸铁中的一种。
4.如利要求I述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的去离子水为溶解量的去尚子水。
5.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的碱是氨水、NaOH, KOH或LiOH中的一种。
6.如权利要求1 述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中的反应温度为 120°C、150°C、180°C或 210°C中的一种。
7.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中的反应时间为 12h、18h、24h、32h、40h 或 48h 中的一种。
8.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的表面修饰剂是精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种，Fe3O4纳米颗粒与表面修饰剂按摩尔比在1:100-1000 范围内。
9.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的肿瘤标记物是AFP、VEGF、VEGFC、VEGF-R1、VEGFR-R2、EGF或CEA肿瘤或其他疾病的特异性标记物。
10.如权利要求1述的核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于步骤如下: (1)称取0.524g葡萄糖溶解在25ml水中，再称取0.90g无水FeCl3溶于其中；用25%的氨水调节PH至10并搅拌0.5h，得混悬液； (2)将步骤(I)得到的混悬液转移至反应釜中，在烘箱中，保持180°C反应48h，冷却至室温，将上层液体倒掉，得到黑色沉淀； (3)将步骤(2)中得到的黑色沉淀，分别用去离子水、无水乙醇洗涤3-5次，再分散于大量的溶水中，超声处理5分钟，得到Fe3O4纳米颗粒分散液； (4)将步骤(3)得到的Fe3O4纳米颗粒分散液利用精氨酸在37°C条件下，反应12h，进行表面修饰，将其与肿瘤标记物AFP37°C孵育12h，冲洗离心弃上清后即得核磁共振造影剂。
全文摘要
本发明提供了一种核磁共振造影剂的制备方法，用还原性糖将铁盐在高温下还原后得到Fe3O4，处理后进行表面修饰，标记上抗体后，注射进大鼠体内一段时间后，即可进行MRI扫描成像。本方法制备的核磁共振造影剂，显著提高了MRI对病变的检出率及敏感性，既可以实现对大多数疾病的一次性核磁共振成像诊断，也可以用于实现某种特定病变的特异性核磁共振成像，显著提高诊断准确率和鉴别诊断的水平。
文档编号A61K49/08GK103191446SQ20131014809
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月25日 优先权日2013年4月25日
发明者占金华, 陈召龙, 于德新, 蒋贺纯 申请人:山东大学