一种药物组合物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物组合物及其制备方法和用途，该产物含有蒺藜苷元与黄酮的和达60-85%，其中皂苷元和黄酮的重量比例为2:1-10:1。本发明还公开了含有蒺藜苷元与黄酮的药物的制备方法及其在治疗心脏、脑动脉血管硬化或栓塞引起的心肌和脑组织缺血、缺氧及氧化脂质升高的药物中的用途。
【专利说明】一种药物组合物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有蒺藜总皂苷粗提物水解产物的药物及其制备方法，特别是所涉及的药物在预防、治疗人或动物心肌和脑组织缺血、缺氧中的应用。
【背景技术】
[0002]蔡藜Tribulus terrestris L.在植物分类学上属于蔡藜科植物蔡藜属植物。蒺藜果及茎叶均含有许多种留体皂苷，近几年来对蒺藜的皂苷成分进行了一些研究，发现蒺藜皂苷具有广泛的生物活性。
[0003]近年，人们对蒺藜的研究不断深入，从蒺藜中分离鉴定了 60余种皂苷蒺藜果实含有甾体皂苷，皂苷经水解得到已知的皂苷元:提果皂苷元、新提果皂苷元、芰脱皂苷元、新芰脱皂苷元海可皂苷元、新海可皂苷元、曼诺皂苷元、新曼诺皂苷元。从蒺藜全草中分得5种新皂苷元，25 (R)-螺甾烷-4-烯-3，12-二烯、25(R)_螺甾烷-4-烯-2β，3α 二羟基-12-丽、25 (R)_ 螺留烧-24-β 轻基-4 稀-3,12-_■丽，25(R)_ 螺留烧 _3，6，12-二酮，25 (R)-螺甾烷-4烯-3，6，12-三酮，和已知皂苷元，25 (R)-螺甾烷_3，12-二酮、25 (R)-螺留烷-3，6，12-三酮，25(1?)-螺留烷 _3，5-二酮，25 (R)-螺留烷-4-烯-3，12-二酮。本
【发明者】参与发明了“含有蒺藜果总皂苷的药物组合物及其制备方法”专利(专利号ZL02132482.4)，阐述了一类新的具有药用的以蒺藜果叶总皂苷的组合物为基本活性成分。经过多年研究证明此专利存在如下缺点:有效成分为确定为螺留皂苷和呋留皂苷，他们的总和达到50%重量比，未明确有黄酮苷存在及其含量；总皂苷成分结构在母核的3位和26位上含有多种糖，分子量比较大，一般在1000以上，不是体内真正起到作用的物质；药效作用不强，用量较大。同时发明专利88103085.6及200710019035.X专利，均存在如上缺点。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物及其制备方法，以解决蒺藜总皂苷粗提物存在的药效作用不强，物质不清楚，用量较大的问题。
[0005]我们近年研究分析了上述蒺藜总皂苷体外人肠内菌代谢和大鼠体内代谢，分析蒺藜果原形皂苷及代谢后产物的变化情况，分离鉴定蒺藜总皂苷的体外肠内菌代谢产物及大鼠血清代谢产物，探索蒺藜留体皂苷结构与代谢产物的相关性，为阐明蒺藜总皂苷在体内代谢过程和真正起药效作用的成分不是皂苷类成分，而是脱去糖分的皂苷元及黄酮成分，我们在蒺藜总皂苷粗提物人肠内菌代谢产物及动物血清中检测到9种皂苷元和3种黄酮，我们又对蒺藜总皂苷进行了水解，得到的水解成分与代谢成分相近，水解物中鉴定了 9种皂苷元和3种黄酮，与代谢产物一致，并对水解产物进行了了药效学实验，证明了蒺藜皂苷水解产物与体内真正其药效作用的物质一致，有关蒺藜皂苷水解产物的系统成分分析及药物功能开发未见报道。
[0006]本发明含有蒺藜苷元与黄酮的药物是由如下方法制成的:
取蒺藜果或地上部分水提醇沉或水醇溶液提取物水溶液，经过大孔吸附树脂柱吸附，再用醇溶液洗脱，所得到的提取物，为蒺藜总皂苷粗提物。
[0007]取蒺藜总皂苷粗提物lg，溶于10-1000 ml 1-15%硫酸乙醇溶液中，恒温60_100°C酸水解l-15h，放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用1-20%氢氧化钠溶液调PH=5-9。滤过，即得。
[0008]本发明的另一个目的是提供制备含有蒺藜苷元与黄酮的药物的方法。
[0009]本发明所述的含有蒺藜苷元与黄酮的药物在制备治疗心脏、脑动脉血管硬化或栓塞引起的心肌和脑组织缺血、缺氧及氧化脂质升高的药物中的应用。
[0010]本发明所述的含有蒺藜苷元与黄酮的药物中含有的有效成分蒺藜皂苷元和蒺藜黄酮，是体内真正其药效作用的药物，蒺藜皂苷元和蒺藜黄酮的含量达到60% 15% (w /w)，皂苷元和黄酮的比例为2:1-10:1，药效最佳，药效强于蒺藜总皂苷提取物2.5-5倍。
[0011]本发明的药效组合物并含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0012]本发明的优点是:所含有的药效物质为在体内可检测到真正起到药效作用的物质成分，蒺藜皂苷元和黄酮，且两个组分比例2:1-10:1，可测有效成分含量达60% ^85% ;本发明的另一个优点是本组合物的药效作用强于原发明蒺藜总皂苷提取物的药效作用。本组合物以20mg/kg、40mg/kg大鼠给药,可明显抑制大鼠血栓形成,作用强于100mg/Kg总阜苷提取物。本组合物以25mg/kg、50mg/kg大鼠给药，明显延长小鼠凝血时间，50mg/kg给药组作用强于140mg/Kg总阜苷提取物组。本组合物以70mg/kg、35mg/kg大鼠给药,能明显减低小鼠耗氧量，延长小鼠缺氧条件下的存活时间，高剂量组优于总皂苷提取物组。
[0013]临床上平均人口服用量135mg，每日两次，服用15_20天可用于治疗脑梗塞及冠心病心绞痛。
【具体实施方式】
[0014]本发明以下实施例和实验例中所称蒺藜总皂苷粗提物或蒺藜果总皂苷均为采用“有蒺藜果总皂苷的药物组合物及其制备方法”专利(专利号ZL 02132482.4)和88103085.6 及 200710019035.X 中所述方法获得。
[0015]实施例1
取蒺藜果总皂苷粗提物lg，溶于1ml 1%硫酸乙醇溶液中，恒温60°C酸水解lh，放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用1%氢氧化钠溶液调pH=5，滤过，即得。
[0016]实施例2
取蒺藜果总皂苷粗提物lg，溶于500 ml 8%硫酸乙醇溶液中，恒温80°C酸水解5.5 h，放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用10%氢氧化钠溶液调pH=7，滤过，即得。
[0017]实施例3
取蒺藜地上部分总皂苷粗提物lg，溶于1000 ml 15%硫酸乙醇溶液中，恒温100°C酸水解10 h,放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用20%氢氧化钠溶液调pH=9，滤过，即得。
[0018]实施例4:本发明蒺藜苷元与黄酮的胶囊剂
取实施例1、2或3所得药物10g加入适量淀粉，混匀，60°C以下干燥，装胶囊1000粒，即得本品胶囊制剂。
[0019]实施例5:本发明蒺藜苷元与黄酮的片剂取实施例1、2或3所得药物10g加入适量淀粉、润滑剂，混匀，60°C以下干燥，压片，SP得1000片。
[0020]实施例6:本发明蒺藜苷元与黄酮的颗粒剂
取实施例1、2或3所得药物10g加入适量淀粉，混匀，60°C以下干燥，制粒，即得1000袋颗粒剂。
[0021]实施例7本发明蒺藜苷元与黄酮药物的成分分析
将按实施例1所述方法提取的蒺藜苷元与黄酮组合物20g溶解于10ml氯仿中，力口等量硅胶，进行硅胶柱层析，依次用石油醚、氯仿-石油醚、氯仿、氯仿-甲醇梯度洗脱，极性逐渐由小变大,每份为100 ml, TLC跟踪检测，A试剂喷雾加热显色，合并相同分，从Fr35-53得到化合物I，Fr 56-65得到化合物II，从Fr 73-103得到化合物III，用制备液相从Fr 112-133得到化合物V- X，从Fr 134-175得到化合物IV。
[0022]结构鉴定结果:
化合物I的主要数据
白色针状结晶(氯仿)，熔点198-199°c, Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸反应显黄色。IR (KBr) CnT1:3524，1053，978，920，900，864 CnT1 ;APCI_MS正离子模式下，分子离子峰，417 [M+H]+,其他离子峰，399[M-H2CHHr51HNMR (δ, C5D5N)数据:δ:0.58 (3Η, d, / = 5.2 Hz), 0.70 (3Η, s), 0.74(3Η, s), 1.03 (3Η, d, / = 6.8 Hz), 3.46, 3.41, 3.74 (lH，m)，4.44 (lH，m) ；13C NMR37.6,32.6,70.7,39.4,45.3,29.2,32.6,35.5,54.7,36.0,21.5,40.4,41.0,56.7,32.0,81.3，63.2，16.8，12.7,42.1，15.2，109.3,32.3,29.4,30.7,67.0,17.5，鉴定为替告皂苷元。
[0023]化合物II的主要数据
白色针状结晶(氯仿)，熔点223-225°C, Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸反应显黄色。IR (KBr) CnT1:3397,1707,1058,981,919,899,863 CnT1 ;APC1-MS 正离子模式下，分子离子峰，431 [M+H]+ NMR (δ , C5D5N)数据:δ:0.58 (3H, d, / = 5.6 Hz) ,0.72 (3H, s),0.99 (3H, s)，1.24 (3 H, d, /=6.8Hz)，3.48，3.36，3.68 (1H, m), 4.36 (1H, m) ;13C NMR 数据 37.0，31.9，70.4，39.1，45.1，28.8，32.3，34.6，55.8，36.5，38.2，212.9，55.5，56.2。化合物 II 为海柯皂苷元。
[0024]化合物III的主要数据
白色针状结晶(氯仿)，熔点251-253°C, Liebermann-Burchard反应呈阳性,与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸反应显黄色。IR (KBr) cm_1 =3413,1058,981,923,899,868 ;APCI_MS正离子模式下，分子离子峰，433 [M+H]+,其他离子峰，415[M-H2CHHr51HNMR (δ , C5D5N)数据:δ:0.58 (3Η, d, / = 4.8 Hz) ,0.72 (3H,s) ,0.74(3H, s), 1.01 (3H, ?, J = 6.8 Hz), 3.45, 3.38, 3.73 (1Η, m), 3.91 (1Η, m), 4.42 (1Η,m) ；13C NMR数据，化合物III为吉托皂苷元。
[0025]化合物IV的主要数据
白色针状结晶(氯仿)，熔点241-243°C, Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸反应显黄色。IR (KBr) CnT1:3404，1707，1059，982，922，900,866 ;APC1-MS 正离子模式下，分子离子峰，447 [M+H]+; 1H NMR (δ , C5D5N)数据:δ:0.57 (3H, d, / = 5.6 Hz)，0.76 (3H, s) ,0.97 (3H, s)，1.23 (3H, d, J = 6.8 Hz)，3.68，3.88，4.36 (1H, m) ；13C NMR 化合物IV为曼诺皂苷元。
[0026]化合物V的主要数据
化合物V为白色针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应呈阳性,与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸试剂反应显黄色。APC1-MS正离子模式下，准分子离子峰，
449 [Μ+Η]+，说明其分子量为 448。其他碎片离子峰431 [Μ_Η20+Η]+，413 [Μ_2Η20+Η]+。1H NMR (pyridine-1/5； 600 MHz) δ:1.26 (3H, d, / = 7.2 Hz) ,0.92 (3H, s) ,0.63 (3H,s), 1.10 (3H, d, / = 7.2 Hz), 3.39,4.01,3.72,4.51,13C NMR (pyridine-1/5, 150 MHz)。化合物 V 为(23S，24/?，257?) -5a-螺甾-3卢，23，24 三醇。
[0027]化合物VI的主要数据
化合物VI白色针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸试剂反应显黄色。APC1-MS正离子模式下，准分子离子峰为431 [Μ+Η]+，说明其分子量为430，其他碎片离子峰为413 [Μ_Η20+Η]+，395[M-2H20+H] + o 1H NMR (pyridine-1/5； 600 MHz) δ:0.56 (3H, s) ,0.86 (3H, s) ,0.96(3H,s), 1.08 (3H, d, / = 6.6 Hz)，3.45，3.40，3.68，3.89，4.52，13C NMR (pyridine-1/5, 150MHz)，化合物 V I 为(257?)-螺甾-5 (6)-烯-3 儿 12 σ - 二醇。
[0028]化合物YD的主要数据
化合物Vn白色针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸试剂反应显黄色。APC1-MS正离子模式下，准分子离子峰为431 [Μ+Η]+，说明其分子量为430，其他碎片离子峰为413 [Μ_Η20+Η]+，395[M-2H20+H]+o1H NMR (pyridine-1/5, 600 MHz) δ:0.57 (3H, m), 0.86 (3H, s), 0.96 (3Η,s)，1.08 (3Η, m), 3.45, 3.42, 3.89, 3.68,4.52,13C NMR (pyridine-1/5, 150 MHz)，化合物YD为(257?，S)-螺甾-5 (6)-烯-3儿 12 σ - 二醇。
[0029]化合物VDI的主要数据
化合物VDI白色针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸试剂反应显黄色。APC1-MS正离子模式下，准分子离子峰为取Λ 433 [Μ+Η]+，说明其分子量为432，其他碎片离子峰为取Λ 415 [Μ_Η20+Η]+，397[Μ-2Η20+Η] +。1H NMR (pyridine-1/5, 600 MHz) δ:0.56 (3H, s) ,0.73 (3H, s) ,0.85(3H, d, /= 4.8 Hz)，1.09 (3H, d, / = 6.6 Hz), 3.41,3.47,3.68,3.84,4.53,1? NMR(pyridine-1/5, 150 MHz)，化合物VDI为(257?，5)-螺甾-3儿 12 σ 二醇。
[0030]化合物IX的主要数据
化合物IX白色针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与Ehrlich试剂反应不显色，香草醛-浓硫酸试剂反应显黄色。APC1-MS正离子模式下，准分子离子峰为431 [Μ+Η]+，说明其分子量为430，其他碎片离子峰为413 [Μ_Η20+Η]+，395[Μ-2Η20+Η] +。1HNMR (600 MHz, pyridine-1/5) δ: δ 0.57 (3H, m), 0.80 (3Η, s)，1.23(3Η, s)，0.99 (3Η, d, / = 6.6 Hz), 3.35,4.43, 3.85,4.80,13C NMR (pyridine-1/5, 150MHz)，化合物IX鲁斯可皂苷元。
[0031]实施例6.蒺藜皂苷元和蒺藜黄酮的含量的测定苷元测定
对照品溶液制备精密称取海柯皂苷元3.1 mg，用甲醇:氯仿(1:1)溶解并定容于25 ml容量瓶中，备用。
[0032]样品溶液制备
精密称取蒺藜苷元与黄酮的药物组合物12.0 mg,甲醇:氯仿(I:1)定容至25 ml容量瓶中，备用。
[0033]测定方法
取样品溶液，密量取1.0 ml，置带塞试管中，挥干溶剂，另精密量取对照品溶液2.1 ml、2.3 ml，同法挥干溶剂，分别加入5%香草醛冰醋酸溶液0.6 ml，及高氯酸0.8 ml，摇匀，以
0.6 ml的香草醛冰醋酸溶液为空白对照，将装有样品、对照品及空白溶液置60°C水浴中加热15分钟，立即取出，流水冷却，分别加入冰醋酸3 ml，摇匀，放置60分钟，照分光光度法(中国药典2010年一部附录VA)，在波长520 nm处，测定吸收度值，按外标两点法计算含量。
[0034]表1 样品含量测定结果
【权利要求】
1.一种含有蒺藜总皂苷的提取物，是由如下方法制成的: 取蒺藜果或地上部分水提醇沉或水醇溶液提取物水溶液，经过大孔吸附树脂柱吸附，再用醇溶液洗脱，所得到的提取物，为蒺藜总皂苷粗提物。
2.一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物，是由如下方法制成的:取蒺藜总皂苷粗提物lg，溶于10-1000 ml 1-15%硫酸乙醇溶液中，恒温60-100°C酸水解l_15h，放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用1-20%氢氧化钠溶液调PH=5-9，滤过，即得。
3.如权利要求1所述的一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物，其特征在于:其中含有蒺藜阜苷兀和蔡藜黄酮的含量60%?85 %(w / W)。
4.如权利要求1所述的一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物，其特征在于:蒺藜皂苷元和蒺藜黄酮的重量比例为2:1-10:1。
5.如权利要求1所述的一种含有蔡藜苷兀与黄酮的药物，其特征在于:其中含有如下九种单体皂苷元:替告皂苷元、海柯皂苷元、吉托皂苷元、曼诺皂苷元、(23& 24/?，257?) -5a-螺甾-3卢，23，24 三醇、(257?)-螺甾-5 (6)-烯-3卢，12 σ - 二醇、(257?，S、-螺甾-5 (6)-烯-3卢，12 σ-二醇、(257?，5)-螺甾-3卢，12 σ 二醇、鲁斯可皂苷元。
6.如权利要求1所述的一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物，其特征在于:其中含有如下三种单体黄酮:3，5，7，3' Λ'-五羟基黄酮、2' 3' Λ' 3，5-五羟基黄酮醇、山柰酚。
7.如权利要求1所述的一种含有蒺藜苷元与黄酮的药物的制备方法，包括下列步骤: 取蒺藜总皂苷粗提物lg，溶于10-1000 ml 1-15%硫酸乙醇溶液中，恒温60-100°C酸水解l_15h，放冷后，母液回收乙醇，至无醇味，用1-20%氢氧化钠溶液调PH=5-9，滤过，即得。
8.如权利要求1所述的含有蒺藜苷元与黄酮的药物在制备治疗心脏、脑动脉血管硬化或栓塞引起的心肌和脑组织缺血、缺氧及氧化脂质升高的药物中的应用。
【文档编号】A61P39/00GK104127461SQ201310156625
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2013年5月2日
【发明者】徐东铭, 善体强 申请人:徐东铭