鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺的制作方法

专利名称：鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及从鸡感染性粪便中分离、纯化艾美耳球虫卵囊并制备活卵囊疫苗的技术，特别指鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺。
背景技术：
鸡艾美耳球虫早熟弱毒疫苗的制备依赖于从感染性粪便中分离卵囊，而球虫卵囊的分离与纯化是一项十分复杂的工作。现有的生产工艺移植于实验室的分离技术，应用饱和盐水漂浮法分离卵囊。其主要原理是:由于球虫卵囊的密度(1.103 1.064)介于水和饱和盐水的密度之间，当将含有杂质的卵囊溶液放在水中离心机离心时，卵囊和少量的物质比水密度大一起下沉，由于浮力作用，比水密度小的杂质上浮，离心后，弃上清液，除去了比水密度小的杂质；当将含有杂质的卵囊溶液放在饱和盐水(蔗糖溶液、饱和硫酸镁和饱和铬硫酸)中离心时，由于浮力作用，卵囊和少量的物质比饱和盐水密度小一起上浮，离心后，弃沉淀，除去了比饱和盐水密度大的杂质。随后，分离的卵囊用次氯酸钠处理，去除细菌和卵囊表面的粘附物，配制疫苗。饱和盐水漂浮法是实验室最常用的球虫卵囊分离技术，该技术相对简单，易于掌握，可重复性好，结果可靠。但用于产业化生产有严重缺陷，主要表现为:①筛分效率低，不能实现管道化连接和机械化生产；②离心物料量过大，离心机数量要求多，离心时间长。这些原因是造成疫苗产能量小、产业化程度低的直接因素，并进一步导致疫苗的成本上升，影响了疫苗的推广与使用。艾美耳属(Eimeria)球虫(Coccidium)是寄生于鸡肠道的一类专性寄生原虫，弓丨起鸡球虫病(Coccidiosis)。据统计，全世界已报道的鸡球虫共有15种，其中，有5种具有明显的致病性，它们是:柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)及和缓艾美耳球虫(E.mitis)。这5种球虫中，有3种对雏鸡具危害性，它们是:柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫。球虫病是一种普遍存在的感染性疫病，世界上凡是有鸡的地方就会有鸡球虫及鸡球虫病的发生，而规模化鸡场是鸡球虫病易发生的适宜场所，常常出现该病的爆发。鸡球虫病是一种感染迅速，传播快而广泛，且致病率、致死率极高的烈性感染病，在防治不当的情况下，感染率和死亡率均高达50%以上。因此，鸡球虫病对养禽业造成严重的经济损失，全球每年因该病造成的经济损失高达数百亿元人民币，我国每年因该病造成的损失也不少于百亿元。在养鸡业集约化不断提高的今天，防治鸡球虫病是养鸡业疫病防控工作中不可缺少的环节。从上世纪80年代，鸡球虫病的防控取得了重大进展，主要得益于大量抗球虫药物的出现，并取得令人满意的成效。然而，大量的抗球虫药物多为化学类产品(如氯苯胍、尼卡巴嗪、二硝托胺 、地克珠利、尼卡巴嗪和磺胺类药物)和抗生素类产品(如莫能菌素、盐霉素、拉沙菌素、那拉菌素、马杜霉素、海南霉素)。这些产品的长期使用必然导致抗药性和药物残留现象的出现。而各种抗球虫药物的使用均为伴料给药。实际上在上世纪90年代抗药现象已十分普遍，在这种情况下新药的研制压力聚增，养鸡企业的防控难度日益加大。进入21世纪以来，全球范围内化学药品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越来越多的关注，发达国家已基本禁止了化学抗球虫药物的使用，抗生素类抗球虫药物的使用也受到明显的限制。在美国、日本和欧共体已明令禁止此类产品出现在饲料中。在我国由于各种抗球虫药物不加限制的应用，抗药性已普遍产生，有的产品(如莫能菌素)已无临床使用价值。近年来我国的食品安全政策开始实施，同时消费者自身的健康意识日益增强，抗球虫药物的市场日渐萎缩，而且，我国也将在近期实施禁止或限制使用抗球虫药物的市场政策，这样鸡球虫病的防治形势骤然紧张。为了有效防治鸡球虫病，确保养鸡业的健康发展，迫切需要寻找新的防治方法，这其中疫苗接种预防是具有前途的途径之一。然而，传统的疫苗制造技术不适用于产业化生产，急切需要适于规模化生产技术工艺。发明专利“鸡艾美耳球虫卵囊批量制备方法”(专利号:2011100291271.6)公开了球虫 卵囊的批量分离纯化技术，是鸡球虫疫苗生产的关键技术之一，但不能解决疫苗制备的全部工艺，特别是疫苗固体制剂。鸡球虫疫苗的生产有赖于从感染鸡粪中分离卵囊，再将卵囊合理配比制备疫苗。现有的疫苗生产工艺简述如下:含卵囊鸡粪一稀释混合一60目筛分过滤一200目筛分过滤—离心粗分一饱和盐水细分一离心脱盐一卵囊消毒一孢子化一卵囊计数一卵囊配比一分装该生产工艺实际上是移植于实验室的常用方法，其不足之处显而易见:①筛分过滤效率低下，筛分处理分为2个工序，费时费力；而且，非机械化筛分不能产生足够的“筛分力”，筛分效果差。②离心处理所需设备数量过多或耗时过长，如前分析，常规的离心技术不适于处理大量物料，即使是使用超大容量离心设备也达不到连续流离心的效果。③缺乏对卵囊的微囊化处理，只能制备液体剂型，限制了疫苗的使用和效果。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺，这种生产工艺由高效混合、接力筛分、连续流离心粗分、饱和盐水细分和卵囊微囊化处理等技术配套组成，使疫苗的制备效率成倍提高、制备成本大幅降低。本生产工艺用于鸡艾美耳球虫弱毒多价疫苗液体和固体制剂的生产，它是在已有技术的基础上，通过改进卵囊筛分设备并与新工艺技术组合，不仅形成了完整的疫苗生产工艺，而且解决了固体制剂的生产技术。为使鸡球虫疫苗的生产工艺符合产业化要求，提高产能量、降低产品成本,必须对现有技术工艺进行升级，并实现管道化连接与机械化生产。本发明要解决的技术问题由如下方案来实现:鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺由以下步骤完成:含卵囊鸡粪一高效混合一接力筛分一连续流离心粗分离一饱和盐水细分一离心脱盐一卵囊消毒一孢子化一卵囊计数一卵囊配比一微囊化处理一分装。具体步骤为:(I)含卵囊鸡粪高效混合，取感染鸡新鲜粪便于混合机内，加3 4倍重量清水稀释，搅拌混匀后再加入上述重量0.05 0.1 %的胃蛋白酶，继续混合I 2min，静置5 6min后再加入5 7倍重量的清水，继续搅拌混匀成粪液；(2)接力筛分，筛分机分上下两层，上筛网60目、下层筛网200目，打开混合机出料口，自上层筛分机进料口一次加入所述粪液25 35升，粪液经筛分过滤后直接进入下层筛分机进行第2次筛分，第2次筛分的滤液进入储液罐，更换筛网，再加入25 35升粪液，继续进行筛分，如此直至所有粪液筛分完毕；(3)连续流离心粗分离，储液罐加料装置与离心机进料装置连接，开启离心机进料开关，离心机转速设定为4000rpm，所述筛分完毕物料由进料口进入离心机，在分离系统中受到离心力的作用，通过过滤筛网截留卵囊，上清液穿过筛网进入过滤仓由出液口排出，所述筛分完毕物料在离心过程中连续导入，卵囊沉淀留在离心仓内，上清液则不断排出，排出的上清液收集于容器中；(4)饱和盐水细分，连续离心完成后，取出离心仓，从离心仓内移出离心卵囊沉淀物称量，加5倍重的饱和盐水充分混匀，再加入离心管内以3000rpm离心10分钟；(5)离心脱盐，前一工序离心完成后取出离心管，吸取离心管表面2 3cm液体，力口至另一同样体积离心管中，再加入纯水至原离心管刻度混匀，离心管装入离心机转子架，开启离心机，设定转速为3000rpm，离心15分钟，离心停止后取出离心管，弃去上清液再加入纯水至原离心管刻度，在同样设置下进行第2次离心，重复上述离心操作进行第3次离心脱盐，第3次离心脱盐后的沉淀物即为卵囊；(6)卵囊除污、消毒，取出离心管弃去上清液，沉淀物卵囊中加1%次氯酸钠溶液，混匀，作用5分钟，离心管中再加入注射用水至离心管刻度，3000rpm离心15分钟，洗去次氯酸钾溶液，重复洗涤I 2次，除污消毒后的卵囊沉淀中加入2.5 %重铬酸钾水溶液，将卵囊含量调为5 X105/ml ；(7)孢子化，上述卵囊分装于大平皿中，液面高度< 7mm，置于水平摇床载物台上，启动摇床，在确保氧气供·应的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整个孢子化时间需24 72小时；(8)卵囊计数，计数孢子化卵囊数，计算每ml卵囊含量，孢子化卵囊2X5X105/ml ；(9)卵囊配比，如为多价疫苗，需按比例配制疫苗。以三价苗为例，按下表配制。鸡艾美耳球虫三价早熟弱毒苗虫株配制比例
X 1000头份/瓶 X 500头份/瓶 虫株----
__卵囊量(个) 配量(ml)卵囊量(个)配量(ml)
柔嫩艾美耳球虫早熟株 4.QX1Q5__0Λ__2.0X IO5__0.2
巨型艾美耳球虫早熟株 2.0X105__02_ 1.0X 1050.1
堆型艾美耳球虫早熟株 4.0 X IQ5__04__2.0 X IO5__0.2按卵囊数计算出各虫株的配液量，1000头份包装的装量为IOml/瓶，卵囊液1ml，加2.5%重铬酸钾9ml ;500头份包装为5ml/瓶，卵囊液0.5ml加2.5%重铬酸钾4.5ml。每ml疫苗接种100只鸡。(10)微囊化处理，第I步:卵囊混合将3%海藻酸钠加入配液罐内，按3%海藻酸钠10:孢子化卵囊液1，v/v比例将卵囊加入海藻酸钠中，边加边搅拌；第2步:反应成囊15 20分钟后，打开配液罐排液口，利用压力(或位差)使罐内液体均匀加入另一个装有5 %氯化钙溶液的配液罐中，轻轻搅拌罐内液体，使加入液体反应形成微囊，微囊直径2.0 3.0mm，每个囊内包有卵囊约60 72个，平均66个；第3步:清洗用沉降法收集微包囊，用纯水清洗，30°C风吹干燥；第4步:计数与配制计算包囊形成数，并以玉米粉作为赋形剂，调整卵囊含量为15 16个/克，以10升孢子化卵囊液(10000羽份，Iml/羽)为例，卵囊总数为I X IO7个，经上述配制后形成约15 16万个微包囊，可按比例加入赋形剂中，充分混匀；(11)分装，完成微囊化处理后直接分装。本发明的优点:通过上述方案，本生产工艺大大提高了疫苗制造的效率，能够满足规模化生产的要求，并显著降低了生产成本，有利于产品的推广应用。主要表现在以下几方面:(I)应用高效混合机和筛分机接力筛分感染性鸡粪混合处理和接力筛分均使用了自动化程度较高的设备，这比传统的人工筛分提高工作效率2倍以上。使用机械化筛分不仅缩短了筛分时间，更重要的是提高了筛分效率，试验表明，使用筛分过滤机比人工筛网的卵囊收获量提高30%以上，这是因为机械筛分产生的“筛分力”远大于人工方法。

(2)连续流离心技术和超大容量离心机的应用在传统的球虫卵囊分离技术中，离心分离是整体技术的核心，本生产工艺同样离不开离心分离。然而，传统的离心方法受到技术和设备的限制，不能满足产业化生产的需求。以日处理300kg鸡粪为单班产能的产业化生产为例，混合后的粪液量可达3000升，经60目和200目筛分后,90%的粪液成为滤液(粪洛< 10% ),全部滤液达2700升。目前国内最大容量的离心机为6X2400ml，I次可离心处理11升滤液(按76.4%装量计)，要处理2700升滤液，I台离心机需连续工作246次；如I台离心机I天工作10次，则需要25台大型离心机，这还不包括后续大量的离心纯化、脱盐和洗涤离心。因此，只有改进离心分离技术，才是鸡球虫疫苗规模化生产的出路。本生产工艺使用I台流速为100L/h的连续流离心机，27个小即时可处理2700升物料，若需在单班作业时间内完成2700升物料的离心，则只需增加3台设备。比较常规离心，连续流离心的效率提高6 10倍，单工序设备使用量减少20台，操作人员减少40人，极大地降低了生产成本。经过测算表明，以I个中等规模的疫苗(年产2 3亿头份)厂计，单位疫苗的生产成本可降低300%以上。此外，本生产工艺的饱和盐水细分、脱盐和脱次氯酸钠洗涤中都使用了超大容量^X2400ml)离心机，此种离心机是在近几年才面市的新机型，I次离心可处理10 12升物料，与常规离心机相比工作效率提高至少3倍。(3)卵囊微囊化处理鸡球虫疫苗的临床使用主要是通过与饲料、饮水混合后经口摄入，但在实际使用中会遇到2个问题:一是与饲料混合时，由于饲料量大性干，而疫苗量小性湿，无法做到均匀的混合，其结果导致一部分鸡没有摄入足够的卵囊使免疫失败，另一部分鸡则摄入过多卵囊，出现感染甚至发病；二是进行混饮时，卵囊由于重力作用而沉降于底部，使卵囊的摄入量大打折扣，从而影响了疫苗的免疫质量。对卵囊实施微囊化处理主要有以下好处:①实现了疫苗的固体制剂形式，固体疫苗在与饲料混合时，二者的流动性大大增加，易于混合均匀；②使卵囊的体积增大，增加了被主动摄入的机率，如通过人工改变微包囊的颜色，更容易被摄入；③微包囊对卵囊产生保护作用，提高了疫苗的质量。值得指出的是，固体疫苗使鸡在摄入卵囊的同时，还摄入了海藻酸钠，后者是一种粘性很大的高分子化合物，属植物多糖类，也是一种典型的亲水性溶胶，广泛应用于食品、印染、医药、造纸等行业。在制药领域海藻酸钠广泛用作药物制剂辅料，具有良好的稳定性、溶解性、粘性和安全性，并具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力。该品无毒性，LD5tl值>5000mg/kg,不影响疫苗的质量与安全性。


图1为本生产工艺的流程图。
具体实施例方式实施例由以下步骤完成:含卵囊鸡粪一高效混合一接力筛分一连续流离心粗分离—饱和盐水细分一离心脱盐一卵囊消毒一孢子化一卵囊计数一卵囊配比一微囊化处理一分装(I)混合机高效混合①条件

采用自动化程度较高的混合机代替原有的容器混合，不仅使混合效果更好，而且，混合机具有搅拌功能(搅拌转速<60rpm),可防止卵囊沉降,混合罐内带有正压(+0.4P)或具位差，可使混合好的粪液输送至下一工序。混合机的工作容积不少于500升。②操作取感染鸡新鲜粪便IOkg于混合均内，加30Kg清水稀释，开动搅拌器混匀，之后加入胃蛋白酶0.5g，继续混合lmin，静置5min后再加入60Kg粪量的清水，继续搅拌混匀。(2)单层振动筛分过滤机接力筛分①条件振动电机:电机产生的振动力通过连接弹簧作用于筛面，使筛网产生振动力，增加物料与筛网的接触并防止网眼堵塞；不平衡重锤:将电机的旋转运动转变成水平、倾斜、垂直的三次元运动，再把这种运动传递给筛面，使物料在筛面上产生外扩渐开、漩涡和向中央集中的多种运动形式，最大限度地提高物料的运行轨迹，从而提高网面利用率。通过调节上下两端重锤的相位角，改变物料在筛网上的运动，以实现对物料的精确分离。旋转:由于电机的转动，筛网随之发生旋转运动，转速控制在每分钟60圈内，此离心力的存在会导致物料向网面周边扩散堆积，改变筛网运动的重心夹角，使之产生向中央集中的动力，防止物料堆积。筛分机直径100cm(以筛网直径计)，上层筛网60目，下层筛网200目。②操作
打开混合机出料口，自上层筛分机进料口一次加入粪液30升，粪液经筛分过滤后直接进入下层筛分机进第2次筛分，第2次筛分的滤液进入储液罐。第I次筛分结束后，更换筛网，再加入30升粪液，进行第2次筛分，如此循环反复，至所有粪液筛分完毕。(3)连续流离心粗分离①条件储液罐容量不低于500升，具自动搅拌和加料功能；连续流离心机转速不低于4000rpm,转速控制精度±20rpm,流速> 50L/h。运行时间控制多项选择,最低连续离心时间4小时，自动锁盖与内锁系统，不平衡保护，状态自我诊断，多种电路保护。具程控功能和数字转速显示，可控温。符合制药GMP要求。②操作储液罐加料装与离心机进料装置连接，开启离心机进料开关，离心机转速设定为4000rpm。物料由进料口进入离心机，在分离系统中受到离心力的作用，通过过滤筛网截留卵囊(包括与卵囊同体积的杂质)，液体穿过筛网进入过滤仓由出液口排出。这样，物料在离心过程中连续导入，卵囊沉淀留在离心仓内，上清液则不断排出。排出的上清液收集于容器中，可进行再次连续离心，卵囊收获量可增加10%。(4)饱和盐水细分①条件饱和盐水:90°C纯水中加入化学级氯化钠(NaCl)，边加边搅拌至出现沉淀为止，冷却后使用。超大容量离心机技术参数:工作容量彡2400ml X 6，水平转子；最大转速> 4000rpm, LED数码管显示与转速设定；可控温，具内锁、不平衡保护和状态自检功能；符合制药GMP规范，转子易清洗、消毒。②操作连续离心完成后，取出离心仓，从离心仓内移出离心沉淀物，称重为3.82Kg，加19.13Kg饱和盐水充分混匀，等量加入离心管内离心(3000转10分钟)。(5)离心脱盐①条件超大容量离心机技术参数:工作容量> 2400ml X 6，水平转子；最大转速> 4000rpm, LED数码管显示与转速设定；可控温，具内锁、不平衡保护和状态自检功能；符合制药GMP规范，转子易清洗、消毒。②操作前一工序离心完成后取出离心管，小心吸取离心管表面2cm液体，加至另一离心管中，再加入纯水至原来体积，混匀。离心管装入离心机转子架，开启离心机，设定转速为3000转，离心15分钟。
离心停止后取出离心管，弃去上清液再加入纯水至刻度，在同样设置下进行第2次离心。重复上述离心操作进行第3次离心脱盐。第3次离心脱盐后的沉淀物，即为卵囊。(6)卵囊除污、消毒①条件原液浓度为5.25%次氯酸钠，使用时用蒸馏水按1:9配制成0.5%水溶液备用。②操作取出离心管弃去上清液，沉淀物(卵囊)中加I %次氯酸钠溶液，混匀，作用5分钟。离心管中再加入注射用水至刻度，3000转离心15分钟洗去次氯酸钾溶液，重复洗涤2次。除污消毒后的卵囊沉淀中加入2.5%重铬酸钾水溶液，将卵囊含量调为5X105/ml ο(7)孢子化①条件孢子化场所应符合万级净化条件，孢子化温度22 28°C ;水平摇床主 要技术参数:摇转方式:水平360度旋转；旋转频率:30 300rpm ；最大负载.》IOkg ；无级调速，数字显示，符合制药GMP标准。②操作上述卵囊分装于大平皿中，液面高度< 7mm，置于水平摇床载物台上，启动摇床，在确保氧气供应的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整个孢子化时间约48小时；(8)卵囊计数计数孢子化卵囊数，计算每ml卵囊含量，孢子化卵囊2X5X105/ml ；(9)卵囊配比如为多价疫苗，需按比例配制疫苗。以三价苗为例，按下表配制。鸡艾美耳球虫三价早熟弱毒苗虫株配制比例
权利要求
1.鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺，其特征是由以下步骤完成含卵囊鸡粪一高效混合一接力筛分一连续流离心粗分离一饱和盐水细分一离心脱盐一卵囊消毒一孢子化一卵囊计数一卵囊配比一微囊化处理一分装，具体步骤为 (1)含卵囊鸡粪高效混合，取感染鸡新鲜粪便于混合机内，加3 4倍重量清水稀释，搅拌混匀后再加入上述重量O. 05 O. I %的胃蛋白酶，继续混合I 2min，静置5 6min后再加入5 7倍重量的清水，继续搅拌混匀成粪液； (2)接力筛分，筛分机分上下两层，上筛网60目、下层筛网200目，打开混合机出料口，自上层筛分机进料口一次加入所述粪液25 35升，粪液经筛分过滤后直接进入下层筛分机进行第2次筛分，第2次筛分的滤液进入储液罐，更换筛网，再加入25 35升粪液，继续进行筛分，如此直至所有粪液筛分完毕； (3)连续流离心粗分离，储液罐加料装置与离心机进料装置连接，开启离心机进料开关，离心机转速设定为4000rpm，所述筛分完毕物料由进料口进入离心机，在分离系统中受到离心力的作用，通过过滤筛网截留卵囊，上清液穿过筛网进入过滤仓由出液口排出，所述筛分完毕物料在离心过程中连续导入，卵囊沉淀留在离心仓内，上清液则不断排出，排出的上清液收集于容器中； (4)饱和盐水细分，连续离心完成后，取出离心仓，从离心仓内移出离心卵囊沉淀物称量，加5倍重的饱和盐水充分混匀，再加入离心管内以3000rpm离心10分钟； (5)离心脱盐，前一工序离心完成后取出离心管，吸取离心管表面2 3cm液体，加至另一同样体积离心管中，再加入纯水至原离心管刻度混匀，离心管装入离心机转子架，开启离心机，设定转速为3000rpm，离心15分钟，离心停止后取出离心管，弃去上清液再加入纯水至原离心管刻度，在同样设置下进行第2次离心，重复上述离心操作进行第3次离心脱盐，第3次离心脱盐后的沉淀物即为卵囊； (6)卵囊除污、消毒，取出离心管弃去上清液，沉淀物卵囊中加1%次氯酸钠溶液，混匀，作用5分钟，离心管中再加入注射用水至离心管刻度，3000rpm离心15分钟，洗去次氯酸钾溶液，重复洗涤I 2次，除污消毒后的卵囊沉淀中加入2. 5 %重铬酸钾水溶液，将卵囊含量调为5 X105/ml ； (7)孢子化，上述卵囊分装于大平皿中，液面高度<7mm，置于水平摇床载物台上，启动摇床，在确保氧气供应的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整个孢子化时间需24 72小时； (8)卵囊计数,计数孢子化卵囊数,计算每ml卵囊含量,孢子化卵囊2X5X105/ml ； (9)卵囊配比， 如为多价疫苗，需按比例配制疫苗。以三价苗为例，按下表配制。
鸡艾美耳球虫三价早熟弱毒苗虫株配制比例
全文摘要
本发明公开了一种鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺，由以下步骤完成含卵囊鸡粪→高效混合→接力筛分→连续流离心粗分离→饱和盐水细分→离心脱盐→卵囊消毒→孢子化→卵囊计数→卵囊配比→微囊化处理→分装。本生产工艺用于鸡艾美耳球虫弱毒多价疫苗液体和固体制剂的产业化生产，大大提高了疫苗制造效率，能够满足规模化生产的要求，有利于产品的推广应用。
文档编号A61P33/02GK103251938SQ20131016057
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者郝文华, 郑润宽, 徐勇 申请人:内蒙古神元生物工程股份有限公司