专利名称：一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种新的真菌免疫调节蛋白基因核苷酸序列的表达及其应用。
背景技术：
真菌免疫调节蛋白(fugalimmunomodulatory proteins, FIPs)是从灵芝中分离得到的继多糖和三萜类化合物后，又一类活性物质。自从1989年Kino等首次从赤芝(Ganoderma Iucidum)子实体中分离得到了这种蛋白，并命名为Ling Zh1-8 (LZ-8或FIP-glu)。到目前为止，已分别从赤灵芝(G.1ucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针恭(Flammulina velutipes)、草 (Volvariella volvacea)、紫灵芝(G.japoncium)、小孢灵芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis)中克隆得到了 7种FIPs,分别为命名为LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FlP-gja (AY987805)、FlP-gmi 和 FlP-gsi,形成了一个新的蛋白质家族真菌免疫调节蛋白(FIPs)家族[Li QZ, Wang XF, ZhouXff.Recent status and prospects of the fungal immunomodulatory protein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011，31 (4):365-375]。在这个蛋白家族中，直接从天然蕈菌中分离得到的真菌免疫调节蛋白仅有四种，它们分别是:LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫调节蛋白则是通过基因重组技术表达而来，其氨基酸序列是由基因序列翻译后得到的。Wang XF等经过比对发现，FIPs的氨基酸序列同源性较高，一般可达 60-70% 左右[Wang XF, Su KQ, Bao Tff, Cong WR, Chen YF, Li QZ, ZhouXff.Fungal immunomodulatory proteins and immunomodulation effects.CurrentTopics in Nutraceutical Research.2012, 10(I):1-11.]FIPs具有一定的免疫调节功能，在抗过敏、抗肿瘤、促进淋巴细胞的增殖、诱导细胞分泌细胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗肿瘤作用尤其引起大家兴趣。Lin JW等经MTT (四唑盐)实验和流式细胞仪检测，在毕赤酵母中表达的FIP-glu可以通过诱导细胞凋亡抑制人类白血病NB4的表达水平(32 μ g/mL FIP-glu可诱导约35%的人类白血病NB4细胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin Jff, Hao LX, Xu GX, et al.MolecularCloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatoryprotein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris.World Journal MicrobiolBiotechnol, 2008，25 (3):383-390]。Liao CH 等在大肠杆菌中表达的 FIP-gts 在人类肺腺癌A549细胞中表现出抗肿瘤活性。当FIP-gts的浓度达到4-10 μ g/mL时，可有效控制癌细胞的转移，具有很好的抗肿瘤效果[Liao CH, Hsiao YM, Lin CH.1nduction ofpremature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory proteinfrom Ganoderma tsugae.Food and Chemical Toxicology, 2008，46(5):1851-1859]。石开究认为，FIP-gts虽能显著抑制人类肺腺癌A549癌细胞的生长，但是不会影响正常MRC-5纤维原细胞的生长，它在mRNA水平下调端粒 酶催化亚基的表达，抑制端粒酶的活性并具有剂量依赖效应。端粒酶在正常的体细胞里一般不被活化，它的活性有无往往会成为决定细胞无限增殖的关键因素。同时，FIP-gts可以促进NK细胞(natural killer cell)、巨噬细胞以及活化血清抗体的生成，有效地调节免疫功能，一定程度上也可以抑制癌细胞的生长[Liao CH, Hsiao YM, Hsu CP, et al.Transcriptionally mediated inhibitionof telomerase of fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae inA549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis, 2006, 45(4):220-229] 0但由于真菌免疫调节蛋白在天然蘑菇(或蕈菌)中的含量非常低(20-80mg/Kg)[林景卫，孙非，张韧，张春玉，刘立侠.真菌免疫调节蛋白的研究进展.中华免疫学杂志.2005, 21 (6):477-480.]，人们设想通过异源表达和发酵工业过程大量生产真菌免疫调节蛋白，并开发健康产品或药物。在真菌免疫调节蛋白的异源表达中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。常用的表达载体有pET-28a、pET-28b和pET_30等，表达的宿主细胞包括有大肠杆菌TGl细胞、大肠杆菌M15细胞、大肠杆菌BL21细胞等。李奇璋等将来源于紫芝(Ganoderma sineses)的FlP-gsi转入pET_30a表达载体中同样可以在大肠杆菌BL21细胞中得到表达，获得了重组的紫芝真菌免疫调节蛋白[李奇璋，王雪飞，黄蕾，等.紫芝免疫调节蛋白基因的原核表达与功能分析.西北植物学报，2010，30(1):35-40]。同样在大肠杆菌BL21细胞中表达，徐贵雪从金针菇基因组中克隆出编码金针菇免疫调节蛋白的基因FIP-fve，构建表达载体pET-28 (+)-FIP-fve，转入大肠杆菌菌株BL21中，经过培养筛选稳定表达的重组子，有效的表达了重组金针菇免疫调节蛋白，在细菌中的表达量为30mg/L[徐贵雪.金针菇免疫调节蛋白的重组表达及生物学特性的初探[D].东北师范大学，2009]。大肠杆菌M15细胞也是目前表达真菌免疫调节蛋白基因主要宿主之一，Li QZ等把来源于红灵芝的真菌免疫调节蛋白基因LZ-8 (FIP-glu)克隆到pQE-30表达载体中，转化到大肠杆菌M15细胞中，同样获得了重组的真菌免疫调节蛋白 FIP_glu[Li QZ, Wang XF, Bao Tff, et al.1n vitro synthesis of arecombinant fungal immunomodulatory protein from Lingzhi or Reishi medicinalmushroom,Ganoderma lucidum(ff.Curt.:Fr.) P.Karst.(Aphyllophoromycetideae) andanalysis of its immunomodulatory activity.1nternational Journal of MedicinalMushrooms, 2010, 12(4):347-358]用于进一步的科学研究或产品研发。同样，Li QZ等人还把来源于紫芝(Ganoderma sinensis)的真菌免疫调节蛋白基因FlP-gsi,转入pQE-30表达载体中，同样在大肠杆菌M15细胞中表达，也获得了重组的紫芝真菌免疫调节蛋白FlP-gsi[Li QZ, Wang XF, Chen YY, et al.Cytokines expression induced by Ganodermasinensis fungal immunomodulatory proteins(FlP-gsi)in mouse spleen cells.Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010，162 (5): 1403-1413]。于此同时，在某些时候大肠杆菌TGl细胞同样也可以作为FIPs表达的宿主细胞，1997年Lin等人通过将FIP-gts基因连接到大肠杆菌细胞TGl中，获得了与谷胱甘肽S-转移酶组成融合蛋白标记物(GST)，再被凝血酶消化后FIP-gts产量高达20mg/L[Lin W H, Hung C H, Hsu C I, etal.Dimerization of the N-terminal amphipathic a -helix domain of the fungalimmunomodulatory protein from Ganoderma tsugae(Fip-gts)defined by a yeasttwo-hybrid system and site-directed mutagenesis[J].Journal of Biological Chemistry, 1997，272 (32):20044-20048]。综上述所，现有的真菌免疫调节蛋白基因在大肠杆菌中的表达，其表达量大约在约20 30mg/L[叶波平，王凡，梁亦馨，金国虔，吴梧桐.LZ-8基因在大肠杆菌中的表达.药物生物技术，2002，9 (I):21-23 ;白杰英，曾林，李彦舫，林忠平.真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备.实用医药杂志，2006，23 (10):1205-1207],表达的载体和宿主细胞不同，表达蛋白的修饰也不尽相同，因而也表现出不同的生理活性。在先前的实验中，我们利用DNA shuffling技术对不同来源的真菌免疫调节蛋白基因在DNA水平上进行重组，构建得到改组文库，利用斑点杂交技术和特异性抗体对改组文库进行筛选，分别得到属内重组菌株[周选围，王雪飞，李奇璋，苏恺琪等.灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用。申请号:201110068761.7]和属间重组菌株[周选围，王雪飞，李奇璋，苏恺琪等.灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用。申请号:201110068813.0]，在本实验中我们选择了前述属内重组中的reFIP-SN15基因，进一步研究其表达产物的制备方法及表达产物在开发抗肿瘤药物产品中的应用。在对现有文献的分析中，至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供reFIP_SN15基因表达产物的制备方法，具体包括一种针对reFIP-SN15基因有效的原核表达载体、大肠杆菌宿主细胞，利用该载体和宿主细胞表达的reFIP-SN15蛋白的分离纯化方法；另一目的是提供，reFIP_SN15基因表达蛋白在开发抗癌药物方面的应用。本发明所提供的重组真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15基因序列，是通过DNAshuf Iling技术从赤芝(Ganoderma lucidum)真菌免疫调节蛋白基因FIP-glu和紫芝(Ganoderma sinensis)真菌免疫调节蛋白基因FlP-gsi重组而来的(申请号:201110068761.7)。将通过基因重组的新的真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15基因构建成原核表达载体pET-30a-reFI P-SN15转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后，用MTT法测定了 reFIP-SN15蛋白对不同人类癌症细胞株的毒性。在体外毒性试验中选取四株人类癌细胞:肺癌细胞A549 (Lungcarcinoma)、结肠癌细胞 HT-29 (Colon cancer)、肝癌细胞 HCC-LM3 (Hepatocellularcarcinoma)、乳腺癌细胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)进行试验。本发明的具体操作方法包括如下步骤:(I)构建表达载体；(2)转化至大肠杆菌；(3)扩大培养；(4) IPTG 诱导表达；(5)分离纯化；所述属内重组真菌免疫调节蛋白为属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15的表达产物，其序列如SEQ ID N0.1所示；所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。优选地，所述步骤(I)构建表达载体的具体方法为:
a.根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15的序列，设计引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和Hind III，以构建原核表达载体；b.以reFIP_SN15基因为模板，经PCR扩增后，将reFIP_SN15基因克隆至中间载体；c.用双酶切将reFIP_SN15片断从中间载体上切下，回收相应片段，用T4连接酶16 0C连接过夜得表达载体。优选地，所述步骤b中的所述中间体为pMD18_T simple vector或pET_30a。优选地，所述步骤(2)的具体方法为:将所述表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42°C循环水浴热击90s，迅速冰浴2min。加入800 μ L LB培养液37°C慢摇复苏lh。取200 μ L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，筛选转化子并挑取阳性克隆。优选地，所述步骤(3)的具体方法为:将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37°C继续发酵。优选地，所述步骤(4)的具体方法为:当发酵液OD6tltl达到0.5 0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为ImM。优选地，所述步骤(5)的具体方法为:a.将经过IPTG诱导的菌液离心收集细胞，悬浮于缓冲液中；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化； b.将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎；c.超声处理过的菌液离心取上清，上N1-NTA柱，用缓冲液I洗柱后，用缓冲液2将目的蛋白洗脱出来；所述缓冲液I 为 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 为 8.0 的水溶液；所述缓冲液2 为 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, ρΗ8.0 的水溶液。分别培养人肺癌细胞Α549 (Lung carcinoma)、人结肠癌细胞HT-29 (Coloncancer)、人肝癌细胞 HCC-LM3 (Hepatocellular carcinoma)、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma),检测重组蛋白FIP-SN15对各细胞株的抑制效果。结果表明重组基因表达的真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15，在体外可抑制人肺癌细胞A549 (Lungcarcinoma)和乳腺癌细胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖，说明该蛋白对这两种肿瘤细胞株有抑制作用。本发明中所涉及的生物材料及试剂除特别注明外，均能够从市售获得。本发明中所述的属内真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15基因序列，见于专利:201110068761.7，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明中所涉及的大肠杆菌BL21已在[李奇璋，王雪飞，黄蕾，周选围.紫芝免疫调节蛋白基因的原核表达与功能分析，西北植物学报，2010，30 (I):0035 - 0040]中公开；BL21大肠杆菌菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如北京博迈德科技发展有限公司，公司地址:北京市海淀区西四环中路甲59号。本发明中所述金属镍离子螯合(N1-NTA)柱适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾(His Tag Protein)的具有天然结构的可溶性重组蛋白质(Native Protein)。本发明中所述纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪型号为impactQ-tof ultimate3000,购自Bruker公司和Dionex公司，为上海交通大学分析测试中心所有。本发明中所述MTT法根据SOP PL-B10002标准化流程操作。其中选用的肺癌细胞 A549 (Lung carcinoma)、结肠癌细胞 HT-29 (Colon cancer)、肝癌细胞 HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)、乳腺癌细胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)均购自澎立生物医药技术(上海)有限公司，公司地址:上市海伽利略路388号，7号楼。在本发明中，可包括含有重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15的载体、所述载体转化的宿主细胞。本发明利用重组基因表达的真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15，在体外可抑制人肺癌细胞 A549 (Lung carcinoma)和乳腺癌细胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖，说明该蛋白对这两种肿瘤细胞株有抑制作用。该基因将通过转基因技术，通过蛋白表达和纯化，在抗肺癌和乳腺癌药物的开发中有巨大的应用潜力。
图1重组灵芝属内 真菌免疫调节蛋白电泳图(A)及Western Blot检测图(B)图2重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白抗肿瘤活性测定和其对人肺癌细胞A549 (Lung carcinoma)、人结肠癌细胞 HT-29 (Colon cancer)、人肝癌细胞 HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)细胞
毒性影响。
具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明的具体过程。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15原核表达载体的构建:(I)根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15的序列，设计能扩增出其基因全长的引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和Hind III，以构建原核表达载体。(2)以属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP_SN15为模板，经PCR扩增后，将reFIP_SN15基因克隆至中间载体(如pMD18_T simple vector),测序结果与所报道的属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15序列比较，一致性为100%，表明扩增没有出现错配。(3)根据引物两端设计的酶切位点，用双酶切(pET_30a载体可用Hind III和Bam HI)将reFIP-SN15片断从pMD18-T simple vector上切下，回收相应片段，用T4连接酶16°C连接过夜。(4)连接产物转化大肠杆菌BL21宿主细胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子并挑取阳性克隆，测序。(5)提取克隆质粒，即得到重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白表达载体pET30a-reFIP-SN15o实施例2灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15的诱导表达与纯化:1.重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15的诱导表达及Western blot检测(I)将实施例1中获得的单克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。(2)次日以2%接种量接种于较大体积培养液。37°C继续培养，至OD6tltl达到0.5
0.7时，加入IPTG，使IPTG的终浓度达到ImM。(3)每0、l、2、3、4、5h取出ImL至-20°C保存备用。将所取得菌液样品5，OOOrpm离心 20min 以收集菌体，去上清，菌体用 100 μ L2 X SDS-PAGE Sample buffer (IOOmMρΗ6.8Tris-Cl，4%(ff/V) SDS, 0.2%(ff/V) BPB, 20%(ff/V) glycerine, 2%(ff/V) β -ME)悬浮，并在95°C水浴锅中保 温5min。之后再分别用两块15%SDS_PAGE胶检测。一块用于考马斯亮蓝染色，另一块用于Western blot检测(图1)。图1所示，上方(A)为含有重组表达载体pET30-reFIP-SN15的大肠杆菌BL21细胞经IPTG诱导蛋白表达电泳图，下方(B)为灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的Western Blot检测。泳道M为marker,泳道1_6分别为诱导时间O、1、2、3、4、5小时的大肠杆菌细胞，箭头所示即为灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15。诱导4小时时,重组蛋白表达量为最高。经大肠杆菌发酵，重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白的产量高达35.95mg/L02.重组真菌免疫调节蛋白的分离纯化(I)将经过IPTG诱导的菌液5，OOOrpm离心20min以收集细胞，用1/10体积的Lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, ρΗ8.0)悬浮；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化；(2)将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎，200 300W超声6次，每次10s，期间间隔IOs ；(3)超声处理过的菌液于4°C下12，OOOrpm离心20 30min ;取上清,使用N1-NTA柱纯化(预先用10倍柱体积的Lysis buffer平衡);用20倍柱体积的Wash buffer (50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH8.0)洗脱出来。实施例3重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15的Q_tof MS分析1.重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP_SN15前处理(I)用干净刀片割下SDS-PAGE凝胶目的条带，转入1.5mL离心管，并用200 μ L枪头将胶片粉碎成l_2mm2大小的胶块；(2)超纯水洗胶两次，加入500 μ L脱色液(50%乙腈，25mM NH4HCO3),室温振荡15-20min,离心弃上清液。重复此步骤1_2次至胶块无色；(3)加入500 μ L50%乙腈,室温振荡10_15min,离心弃上清液；
(4)样品置于浓缩干燥仪中干燥(50-55°C 5min或室温IOmin)；(5)加入 100 μ LlOmM DTT (25mM NH4HCO3 溶解或稀释)，60°C水浴放置 20min，离心
弃掉上清液；(6)加入300 μ L50%乙腈，震荡5-lOmin，离心并弃掉上清液；(7)加新配置的 IAA (4.62mg/mL 1doacetimide, 25mM NH4HCO3 溶解)室温避光放置15-20min,离心Imin,弃去上清液；(8)加 ΙΟΟμ L50mM NH4HCO3 震荡 5-lOmin，离心弃上清，加入 300 μ L50% 乙腈，震荡5-10min,离心去上清；(9)沉淀在浓缩干燥仪中干燥(50-55°C 5min或室温IOmin)；2.消化(I)干燥产物中加入70 μ L Trypsin酶液(常用测序级Trypsin, Promega,浓度为IOng/ μ L,溶于 50mM NH4HCO3)；(2) 37°C恒温箱中倒置过夜；3.萃取(I) 10-100 μ L 乙腈:水:甲酸(60:35:5)，超声粉碎 5min，37°C 放置 lh。(2)将液体吸净至另一干净的离心管中，加入IO-1OOyL乙腈，超声粉碎5min，37°C静置40-60min，将液体吸净转移至以上步骤离心管，合并提取液；(3)浓缩干燥仪中50_55°C干燥l_2h，干燥样品可_20°C保存；4.上样(I)干燥样品加入适量(40-60 μ L)的 solution A (98%Mi I iQ-H20, 2%CH3CN,0.1%FA)，震荡5-10min重新溶解；(2)上样溶液离心1011^11，取适量(2(^1^左右)样品加入样品瓶上样分析。Q-tof MS验证了 25条肽段。经过拼接后证实，共有3条肽段与预测序列重合，重合序列中包含102个氨基酸残基，匹配率超过90% (如下表所示，其中下划线部分为肽段碎片重合部分)。该结果证实，在大肠杆菌中表达并且纯化得到的分子量约为19kD的蛋白为重组的reFIP-SN15蛋白。
权利要求
1.一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，包括如下步骤: (1)构建表达载体； (2)转化至大肠杆菌； (3)扩大培养； (4)IPTG诱导表达； (5)分离纯化； 所述属内重组真菌免疫调节蛋白为属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的表达产物，其序列如SEQ ID N0.1所示； 所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
2.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤(I)构建表达载体的具体方法为: a.根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的序列，设计引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和Hind III，以构建原核表达载体； b.以reFIP-SN15 基因为模板，经PCR扩增后，将reFIP-SN15基因克隆至中间载体； c.用双酶切将reFIP-SN15片断从中间载体上切下，回收相应片段，用T4连接酶16°C连接过夜得表达载体。
3.如权利要求2所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的制备方法，其中，所述步骤b中的所述中间体为pMD18_T simple vector或pET_30a。
4.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的表达方法，其中，所述步骤(2)的具体方法为:将所述表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子并挑取阳性克隆； 所述转化条件为:表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42°C循环水浴热击90s，迅速冰浴2min。之后加入800 μ LLB培养液37°C慢摇复苏lh。
5.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤(3)的具体方法为:将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37°C继续发酵。
6.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤(4)的具体方法为:当发酵液OD6tltl达到0.5 0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为ImM。
7.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤(5)的具体方法为: a.将经过IPTG诱导的菌液离心收集细胞，悬浮于缓冲液中；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化； b.将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎； c.超声处理过的菌液离心取上清，上N1-NTA柱，用缓冲液I洗柱后，用缓冲液2将目的蛋白洗脱出来； 所述缓冲液 I 为 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 为 8.0 的水溶液； 所述缓冲液 2 为 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH8.0 的水溶液。
8.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用。
9.如权利要求8所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用于抗人肺癌或乳腺癌的药物。
10.如权利要求9所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用 于抗乳腺癌的药物。
全文摘要
本发明公开了一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用。该属内基因具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID NO.1。发明对该属内重组真菌免疫调节蛋白基因表达于大肠杆菌获得高表达量目的蛋白，并且证明其对乳腺癌和肺癌具有很好的抗肿瘤活性。这对于重组真菌免疫调节蛋白的大规模生产与开发成抗肿瘤新药的应用提供了一种新的应用方向和探索途径。
文档编号A61P35/00GK103243116SQ20131016720
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月8日 优先权日2013年5月8日
发明者周选围, 丛蔚然 申请人:上海交通大学