牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二价灭活疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明的疫苗其有效成分包括牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒灭活抗原以及牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原，可预防不同品种的牛由该两种病毒引起的感染，降低由上述病毒感染造成的经济损失。疫苗可“一针两防”，安全可靠。本发明还提供一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的制备方法，采用传代细胞系培养生产该疫苗，并对该疫苗制备方法中的病毒培养、制备工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示：使用本发明的二联灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应，所有的牛都产生了免疫保护，说明本发明的疫苗安全可靠，可达到“一针两防”的目的。
【专利说明】牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二价灭活疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品【技术领域】，更具体是涉及一种预防牛传染性鼻气管炎和牛病毒性腹泻的二联灭活疫苗及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]牛病毒性腹?写(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹?写病毒(Bovineviral diarrhea virus, BVDV)引起的以发热、黏膜糜烂溃瘍、白细胞减少、腹湾、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viraldiarrhea virus, BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae),痕病毒属(Pestivirus)。基因组为单股正链RNA，由一个开放阅读框(ORF)和5’ UTR及3’ UTR组成。1946年Olafson等首次发现并分离出BVDV。目前，该病在世界上广泛存在。李佑民等于1983年首次从流产胎儿的脾脏中分离到了 BVDV，证明该病已在我国存在。近年来从我国多个发病牛场分离到了BVDV，给我国养牛业带来巨大的经济损失。对我国部分省份的牛血清样品进行检测，结果表明，该病在我国呈上升态势。
[0003]牛传染性鼻气管炎(Infect1usbovine rhinotracheitis, IBR)是由牛疱疫病毒I型病毒(BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床表现为上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流涕等症状，还可引起脓疱性外阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜炎、乳房炎、流产等。该病于二十世纪50年代初最早见于美国，目前世界范围内流行。我国于1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、黄牛和水牛均有IBRV感染，造成较大的经济损失，疫苗是防控该病的主要措施之一。
[0004]商品化的BVD疫苗和IBR疫苗主要为弱毒活疫苗和灭活疫苗，二者各有其优点。弱毒活疫苗能诱导免疫反应快速、免疫期持久和可诱导局部粘膜免疫。灭活疫苗的最大优势在于其安全性，不存在排毒、无流产和持续性感染的风险，在某些情况下可代替弱毒疫苗进行使用，尤其是针对怀孕牛群和经济价值较高的奶牛群。对于这两种传染病，目前我国尚没有商品化疫苗投放市场，养牛业面临巨大的威胁，发生疫情无计可施，在临床病例研究中发现，BVDV和IBRV往往混合感染。因此急需研制一种能够同时预防上述疫病的有效疫苗。本发明提供了一种能同时预防牛传染性鼻气管炎和牛病毒性腹泻的二联灭活疫苗，通过该制品进行免疫接种，可有效保障牛免受BVDV和IBRV的感染，又可“一针两防”，省时、省力、节约成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种免疫力高、无免疫干扰的牛病毒性腹泻及牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗组合物，达到同时预防BVD和IBR的目的。
[0006]本发明的目的之二是提供所述的牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗在在制备预防或治疗牛传染性鼻气管炎及牛病毒性腹泻药物中的应用。
[0007]本发明的目的之三是提供一种制备牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗组合物的方法。
[0008]本发明是一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于有效成分包括牛病毒性腹泻I型病毒灭活抗原以及牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原。
[0009]在本发明中，优选的，所述的牛病毒性腹泻I型病毒灭活抗原为灭活的牛病毒性腹?写病毒NMOl株,所述的牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原为灭活的牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，所述牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株，命名为BVDV NMOl株，分类命名为牛病毒性腹泻病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.6032，保藏日期为2012年4月20日；所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，命名为IBRV LNOI/08株，分类命名为牛传染性鼻气管炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCCN0.6033，保藏日期为2012年4月20日。
[0010]本发明所用毒种IBRV LN01/08株是从发病牛鼻拭子经MDBK细胞连续传代并经克隆纯化分离所得，病毒毒价可达108_°TCID5(l/ml以上。
[0011]进一步的，本发明还提供了所述的二联灭活疫苗在制备预防或治疗牛传染性鼻气管炎及牛病毒性腹泻中的应用。
[0012]更进一步的，本发明还提供了一种制备牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻二联灭活疫苗的方法，其特征在于包括:将牛病毒性腹泻病毒I型病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、分别进行大规模培养，收获病毒液，将病毒液灭活后与免疫佐剂混合乳化，制备成灭活疫苗。
[0013]在本发明所述的方法中，优选的，所述的牛病毒性腹泻I型病毒为牛病毒性腹泻病毒NMOl株，所述的牛传染性鼻气管炎病毒为牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株,其中所述牛病毒性腹泻病毒NMOl株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.6032 ;所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.6033。
[0014]在本发明所述的方法中，更优选的，其包括以下步骤:
[0015](I)将细胞系进行传代和培养；
[0016](2)将牛病毒性腹泻病毒I型病毒NMOl株和牛传染性鼻气管炎病毒LNO1/08株分别接种长满90%?100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，制备生产种毒；
[0017](3)将所制备的生产种毒分别接种长满90%?100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，得到牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液；
[0018](4)将牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LNO1/08株病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，将两种灭活后的抗原液混合，加入免疫佐剂，乳化，即得；
[0019]其中，优选的，所述的细胞维持液为含0.5?2μ g/ml胰酶及3.5% (v/v)马血清的DMEM培养液或MEM培养液，pH值7.0?7.2。
[0020]其中，优选的，步骤(I)中所述的传代细胞系包括牛肾细胞系(MDBK细胞系)、牛睾丸细胞(BT细胞系)、牛鼻甲骨细胞系(BT细胞系)、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系(NCL-1细胞系)、兔肾原代细胞系(CRL-1414)、兔肾细胞系((LLC-RKl)。
[0021]其中，优选的，所述细胞系的传代和培养包括:将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90%?100%时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液为含有6%?8% (v/v)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0?7.2 ;所述细胞系的培养方法为以下任意一种:在转瓶中培养，使其细胞密度达到2 X 15?6XlOVml ;或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或不添加任何载体进行纯悬浮培养，使细胞密度达到2 X 16?5X 106/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。
[0022]其中，优选的，步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度为33?37°C，细胞培养环境是含5%C02左右的培养箱或生物反应器或不含CO2的转瓶；病毒培养时间为30?72小时。
[0023]其中，优选的，步骤(2)或(3)中所述的牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株的病毒接种量MOI为0.03?0.05，牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株的病毒接种量MOI为0.01?
0.03。
[0024]其中，优选的，步骤(4)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度为0.002?
0.003M ;所述的中和剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的终浓度为0.03M。
[0025]其中，优选的，步骤(4)中，每剂量疫苗内，牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液灭活前病毒含量为不低于107_°TCID5(i,牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液灭活前的病毒含量为不低于17 5TCID5tl，将两种灭活后的抗原液混合，然后按照抗原液与免疫佐剂的体积比为1-2:1-2的比例，加入免疫佐剂，混合，乳化，所述的乳化剂是206佐剂或其它矿物油佐剂，更优选的，是将54体积份数的混合抗原液与46体积份数的免疫佐剂混合。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为F4代病毒的细胞培养物的免疫荧光鉴定结果；
[0027]A.F4代病毒的细胞培养物接种细胞后使用BVDVl型单克隆抗体染色；B.F4代病毒的细胞培养物接种细胞后使用BVDV2型单克隆抗体染色；C.为阴性对照
[0028]图2为病毒液第4代细胞培养物RT-PCR扩增结果；
[0029]1、阴性对照；2、病毒液第4代细胞培养物；M、Marker DL2000
[0030]图3为BVDV NMOl株亚型分析结果；
[0031]图4为BVD、IBR 二联灭活疫苗的安全性试验首次接种疫苗后平均体温变化曲线；
[0032]图5为BVD、IBR 二联灭活疫苗的安全性试验二次接种疫苗后平均体温变化曲线；
[0033]图6为BVD、IBR 二联灭活疫苗的效力试验免疫攻毒后平均体温变化。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0035]实施例1牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株的分离鉴定
[0036](I)免疫荧光试验
[0037]发明人从临床采集牛血液中分离到一株病毒，该病毒在MDBK细胞上可产生典型病变，将第4代病毒液接种于长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板，并设不接种空白对照，置于37°C、含5%C02培养箱培养48~72小时，丙酮固定后分别加入荧光标记的BVDVl和BVDV2单克隆抗体，37°C湿盒中作用40分钟后，荧光显微镜观察。可见加有BVDVl单克隆抗体的孔内出现特异荧光，BVDV2型单克隆抗体孔和对照组无可见荧光。如图1所示。
[0038](2)RT_PCR鉴定根据BVDV5’UTR基因序列设计合成BVDV的特异性引物，用于检测BVDV病毒的特异性引物。
[0039]上游引物为:P324:5’ -ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’ ；
[0040]下游引物:P326:5’ -TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3，，
[0041]结果表明病毒液第4代细胞培养物经RT-PCR扩增可得到约288bp的特异性目的片段，阴性对照无条带。如图2所示。
[0042](3)全基因测序参照GenBank公布BVDV全基因序列，设计合成特异性引物，用于BVDV全基因组序列测定，引物序列见表1。经病毒RNA制备、病毒cDNA生成、PCR扩增、片段回收及测序，结果表明，该病毒全长12294bp，含5’非编码区、ORF编码区和3’非编码区，属于BVDVl型。对分离毒亚型鉴定结果表明，该毒株与BVDV-1a亚型毒株同源性较高,属BVDVla 亚型。
[0043]表1BVDV全基因序列测定引物表
【权利要求】
1.一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于有效成分包括牛病毒性腹泻I型病毒灭活抗原以及牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原，优选的，所述的牛病毒性腹泻I型病毒灭活抗原为灭活的牛病毒性腹泻病毒NMOl株，所述的牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原为灭活的牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹泻病毒NMOl株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.6032 ;所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.6033。
2.权利要求1所述的二联灭活疫苗在制备预防或治疗牛病毒性腹泻及牛传染性鼻气管炎药物中的应用。
3.一种制备牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于包括:将牛病毒性腹泻病毒I型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒分别进行大规模培养，收获病毒液，将病毒液灭活后与免疫佐剂混合乳化，制备成灭活疫苗；优选的，所述的牛病毒性腹泻I型病毒为牛病毒性腹泻病毒NMOl株，所述的牛传染性鼻气管炎病毒为牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹泻病毒NMOl株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.6032 ;所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为:CGMCC N0.6033。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将细胞系进行传代和培养； (2)将牛病毒性腹泻病毒I型病毒NMOl株和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株分别接种长满90%?100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，制备生产种毒； (3)将所制备的生产种毒分别接种长满90%?100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，得到牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液； (4)将牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，将两种灭活后的抗原液混合，加入免疫佐剂，乳化，即得； 其中，所述的细胞维持液为含0.5?2 μ g/ml胰酶及3.5% (v/v)马血清的DMEM培养液或MEM培养液，pH值为7.0?7.2。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的细胞系包括牛肾细胞系(MDBK细胞系)、牛睾丸细胞(BT细胞系)、牛鼻甲骨细胞系(BT细胞系)、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系(NCL-1细胞系)、NCL-1细胞系、兔肾原代细胞(CRL-1414)、兔肾细胞((LLC-RKl)。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述细胞系的传代和培养包括:将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90%?100%时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液为含有6%?8% (v/v)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0?7.2 ;所述细胞系的培养方法为以下任意一种:在转瓶中培养，使其细胞密度达到2X 15?6X 105/ml ;或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或不添加任何载体进行纯悬浮培养，使细胞密度达到2X 16?5X 106/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度为33?37°C，细胞培养环境是含5%左右CO2的培养箱或生物反应器或不含CO2的转瓶；病毒培养时间为30?72小时。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)或(3)中所述的牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株的病毒接种量MOI为0.03?0.05,牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株的病毒接种量MOI为0.01?0.03。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度为0.002-0.003M ;所述的中和剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的终浓度为0.03M。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)中，每剂量疫苗中，牛病毒性腹泻I型病毒NMOl株病毒抗原液灭活前病毒含量为不低于107_°TCID5(I,牛传染性鼻气管炎病毒LNO1/08株病毒抗原液灭活前的病毒含量为不低于107_5TCID5(I,将两种灭活后的抗原液混合，然后按照抗原液与免疫佐剂的体积比为1-2:1-2的比例，加入免疫佐剂，混合，乳化，所述的乳化剂是206佐剂或其它矿物油佐剂，优选的，是将54体积份数的混合抗原液与46体积份数的免疫佐剂混合。
【文档编号】A61K39/295GK104162154SQ201310184764
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】武华, 王炜, 师新川, 吴永旺 申请人:华威特（北京）生物科技有限公司, 华威特（江苏）生物制药有限公司