逐层组装纳米金复合物递药载体系统及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统，该递药载体系统包含：半胱胺修饰的纳米金核心，其表面带有氨基正电荷；带负电性的模型药物，其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面，形成模型药物层；含有二硫键骨架结构的聚合物多肽，其通过吸附包覆于模型药物层表面，形成还原响应释放层，该还原响应释放层表面还修饰有透明质酸。本发明还公开了该递药载体系统的制备方法和应用。本发明的纳米金复合物递药载体系统，具有谷胱甘肽触发智能释放、高效低毒的功效，且该纳米金复合物载体还呈现CD44介导的特异性内吞，具有体内肝靶向递送效果，对今后基因治疗中的非病毒给药载体研究以及肝脏疾病方面的治疗具有重要意义，应用前景广阔。
【专利说明】逐层组装纳米金复合物递药载体系统及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种新型的响应释放型逐层组装纳米金复合物递药载体系统及其制备方法和应用，该递药载体系统可获得理想的肝靶向递送效果。
【背景技术】
[0002]肝癌、肝炎等肝脏疾病均为当前需要重点研究的重大防治疾病。这个顽固堡垒目前没有被有效攻克的主要原因，除了治疗药物本身的药理作用尚不够理想外，就是没有将药物有效递送至肝脏或肝脏的病变部位，即药物的肝靶向性差。此外，药物不能高效智能释放，也是一个主要原因。
[0003]金是化学性质最稳定的元素之一，但纳米级别的金粒子却具有特殊的物理化学性能，由于其良好的稳定性、尺寸效应、表面效应、光学效应以及其独特的生物亲和性,使其在生物传感器、光化学与电化学催化、生物医药(药物、基因、蛋白)、生物分析化学、食品安全快速检测、光电子器件、生物体着色等领域有着极其广阔的应用。
[0004]金纳米粒子(Gold nanoparticles,AuNPs)作为一种无毒性的载体,可以运用于药物以及基因递送。目前基因治疗传递载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体通常都能展现出较理想的转染效果，其针对许多细胞类型具有天然的感染趋向性，天然的作用效果使其可有效从内涵体逃逸，进入细胞核进行表达。但是，在基因递送中病毒载体却会引起一系列问题，包括不可预知的免疫反应及毒副作用。例如，染色体插入后激活原癌基因而具有强的致癌性，较强的免疫反应致使多次注射给药受到限制。在另一方面，其具有尺寸限制，因而只能携载一定尺寸的核酸物质。如此种种，限制了其在实际的科学研究以及临床中的使用。由此，非病毒给药载体受到了科学家的广泛关注。与病毒载体相比，非病毒给药载体其免疫反应相对较低，染色体插入无风险，易于合成及质量控制。载体基本可包载任意尺寸的核酸物质。但是它也面临着许多的挑战和困难，其中，最主要的就是负载的药物不能高效智能释放、转染效果不理想及靶向性差。
[0005]目前国内纳米金体系的研究主要局限于普通金纳米粒的制备、处方优化及表征等，但对纳米金粒子的表面进行不同官能团的功能化以及基于该功能化纳米金的逐层自组装响应释放型肝靶向递药系统的研究在国内均未见报道。
[0006]虽然国外近年已出现采用逐层组装的功能化纳米金作为非病毒给药载体系统的研究报道，但是以功能化纳米金为核心采用逐层组装技术构建的含有丰富二硫键骨架结构的聚合物多肽，可利用细胞内部天然的谷胱甘肽作为药物触发释放基质并获得理想的肝靶向递送效果的研究未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统，该递药载体系统能由体内天然谷胱甘肽(GSH)触发智能释放，高效低毒，且该载体系统具有很好的祀向给药效果。[0008]此外，还需要提供一种上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法及应用。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0010]在本发明的一个方面，提供了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统，该递药载体系统包含:
[0011]半胱胺修饰的纳米金核心，其表面带有氨基正电荷；
[0012]带负电性的模型药物，其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面，形成模型药物层；
[0013]含有二硫键骨架结构的聚合物多肽，其通过吸附包覆于模型药物层表面，形成还原响应释放层。 [0014]本发明的载体系统采用金纳米粒为核心，是因为纳米粒(NPs)是一种毒性小且稳定性较好的制剂类型，经静脉注射入血后能够将包裹的药物浓集于肝、脾等部位，可降低药物在其他组织中的分布，达到被动祀向效果。纳米(nanometer, nm)是计量单位，Inm是Im的千分之一，是一个氢原子直径的10倍。当物质的特征尺寸进入到纳米尺度时，原有的很多物理和化学性质会发生巨大的改变,表现出特有的小尺寸效应、表面效应和量子效应。以纳米颗粒作为载体，可以将药物、DNA或RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过纳米粒表面修饰的靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入胞内，实现安全有效的靶向性药物治疗和基因治疗。其优点是在体内具有长循环、隐形和主体稳定等特点，能克服药物在体内输送过程中所遇到的各种生理屏障，将药物送到一定的靶位，并可以控制药物在靶向部位的释放，不良反应较小。而将NPs的表面进行修饰后，可在一定程度上避免被单核巨噬细胞细胞识别，并可通过与靶细胞表面的特异性受体结合，实现其主动靶向效果。
[0015]优选的，本发明载体系统的还原响应释放层表面修饰有透明质酸(HA)，HA作为载体系统的靶头，可以将药物特异性靶向肝脏细胞。
[0016]本发明载体系统中的纳米金，作为一种传递系统载体，其易于合成及功能化，并具有良好的生物相容性。可以利用功能基团修饰的纳米金所带电荷以及疏水等表面性能作为载体系统稳定的核心。金纳米粒子具有其独特的属性，首先，可以在其表面构建复合单层膜，能被肿瘤细胞特异的识别，具有高的细胞穿透能力；第二，表面的单层膜能够在大多数的生理学环境下稳定存在；三，具有低的细胞毒性；四，为纳米级载体，粒径可控，构造出单层膜表面具有好的生物相容性，具有高的有效负载量。纳米金对蛋白质、DNA等具有很强的吸附能力。伯胺和季胺表面修饰的纳米金粒子可通过离子相互作用结合PDNA，与其它传统转染介质相比展现出了更有效的胞内传递效果。本发明的纳米金核心，进行半胱胺修饰后，被修饰的纳米金粒子表面带氨基正电荷，可以与带相反电荷的pDNA(模型药物)形成稳定的复合物。该半胱胺修饰的纳米金是由氯金酸、盐酸半胱胺氢氯化物和硼氢化钠经反应制备而成。
[0017]优选的，本发明载体系统中还原响应释放层的聚合物多肽，是由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽单体经氧化聚合反应，在多肽单体两端形成Cys-Cys连接而制成的含多个二硫键的聚TAT多肽。由聚合物多肽中的二硫键骨架结构，可利用细胞内部天然的谷胱甘肽作为药物触发释放基质，实现药物的高效智能释放，毒副作用减小。[0018]本发明还原响应型逐层组装纳米金复合物肝靶向递药载体系统的粒径为100~300nmo
[0019]在本发明的另一方面，提供了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法，包括以下步骤:
[0020]将氯金酸溶液和盐酸半胱胺氢氯化物溶液混合后，加入硼氢化钠水溶液反应，得半胱胺修饰的纳米金；
[0021]合成阳离子穿膜多肽，将该多肽溶于磷酸盐缓冲溶液，再加入二甲基亚砜反应，制得含有二硫键骨架结构的聚合物多肽；
[0022]将半胱胺修饰的纳米金原液，滴加入带负电性的模型药物溶液中，混合，得半胱胺修饰的纳米金核心包覆负电性模型药物层的纳米金复合物，再加入含有二硫键骨架结构的聚合物多肽，混合，离心洗涤，得表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物递药载体系统。
[0023]优选的，还包括步骤:在表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物中，加入透明质酸溶液，共孵育，离心洗涤，得表面修饰有透明质酸的逐层组装纳米金复合物递药载体系统。
[0024]优选的，所述阳离子穿膜多肽的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]在本发明的另一方面，还提供了上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备肝靶向药物中的应用。
[0026]在本发明的另一方面，还提供了上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备基因治疗药物中的应 用。
[0027]本发明的纳米金复合物递药载体系统，是以逐层组装为主要技术手段，以功能化的纳米级金粒子为核心，构建出的多层自组装纳米级复合物载体，其具有谷胱甘肽(GSH)触发智能释放、高效低毒、易于穿透细胞膜、有效逃逸内涵体并定位细胞核周围的功效。并且，后期在纳米复合物粒子表面修饰的靶向分子透明质酸(HA)，能使该纳米金复合物载体呈现CD44介导的特异性内吞，具有体内肝靶向递送效果，对今后基因治疗中的非病毒给药载体研究以及肝脏疾病方面的治疗具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0029]图1是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统在包覆不同层时其水化粒径变化图；
[0030]图2是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统构建时包覆不同层其电位反转图；
[0031]图3是本发明的核心材料半胱胺修饰纳米金的(A)溶液颜色、(B)紫外扫描光谱、(C)透射电镜观察粒子形貌、(D)纳米粒水化粒径分布、(E)纳米粒粒子表面电位分布图；
[0032]图4是本发明的核心材料半胱胺修饰纳米金的原子力显微镜图；
[0033]图5是本发明的半胱胺修饰纳米金核心与pDNA的最优结合比例的琼脂糖凝胶电泳图；
[0034]图6是本发明的半胱胺修饰纳米金与pDNA结合后溶液颜色变化(A)及质粒载体尺寸改变⑶示意图；
[0035]图7是本发明的含有二硫键骨架结构PTAT多肽与pDNA的结合以及释放琼脂糖凝胶电泳图；
[0036]图8是本发明的半胱胺修饰纳米金与pDNA结合后透射电镜图；
[0037]图9是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA的透射电子显微镜图；
[0038]图10是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA制备过程中包覆不同层后的原子力显微镜图；
[0039]图11是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA对三种不同细胞的细胞毒性柱状图；
[0040]图12是本发明的还原响应型纳米金复合物载体在体外细胞摄取及细胞内追踪定位激光共聚焦显微镜图；
[0041]图13是本发明的基于半胱胺修饰纳米金包覆不同层材料后其细胞摄取内部透射电镜图；
[0042]图14是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体HA竞争性抑制内吞柱形图；
[0043]图15是本发 明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体的细胞转染激光共聚焦显微镜图；
[0044]图16是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体定量细胞转染效果柱形图；
[0045]图17是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体体内分布柱形图。【具体实施方式】
[0046]为了克服目前递药载体系统靶向性差、不能高效智能释放药物的技术问题，本发明研制出了一种还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其结构包括:
[0047](I)金纳米粒核心，可对纳米金表面进行各种功能化的修饰，作为载体系统核心部件，进行半胱胺修饰后，被修饰的粒子表面带氨基正电荷可以与带相反电荷的pDNA (模型药物)形成稳定的复合物；
[0048](2)带负电性的模型药物层，为下一还原响应触发释放层的吸附提供负电性表面条件；
[0049](3)响应释放层聚TAT多肽，TAT肽(序列为RKKRRQRRR(SEQ ID N0.2))是一种细胞穿透肽，阳离子穿膜肽的共同特点是含较多荷正电的精氨酸和/或赖氨酸，由于生理环境下细胞膜带负电，静电作用介导穿膜是其重要的透膜机制。用固相法制备CTATC后，采用氧化聚合反应氧化，使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽PTAT。当载体系统经由血液循环后定位肝脏组织，进入细胞后，高浓度的谷胱甘肽可还原富含二硫键骨架结构的多肽成小单体，从而获得相应释放效果；
[0050](4)载体系统外修饰透明质酸(HA)，实验的后期为了使整个载体系统具有特异性，在治疗过程中，提高药效和减轻不良反应，获得药物定向输送和细胞特异性的治疗效果，引入了肝脏细胞特异性的HA，作为系统的靶头，其可以与肝细胞表面丰富的CD44 (cluster determinant44) > HARE(hyaluronan receptor for endocytosis)、LYVE-1、RHAMM、IVd4等受体特异性的结合，使药物的定点定向转运系成为了可能。[0051]本发明逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法，包括以下步骤:
[0052]1.表面修饰半胱胺金纳米粒的合成
[0053]用移液枪吸取一定体积的I %的氯金酸溶液，加入40mL去离子水稀释后，再精密称取一定量盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400 μ L去离子水中，加入至上述氯金酸溶液中。搅拌20min后，再将ImL新鲜配制的ImM硼氢化钠水溶液逐滴加入至上述混合液中，剧烈搅拌10-15min后，继续温和搅拌12h，反应全程注意避光操作，再于去离子水中透析纯化24h，即得表面修饰半胱胺的金纳米粒。
[0054]反应各项参数为:
[0055]
【权利要求】
1.一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其特征在于，该递药载体系统包含: 半胱胺修饰的纳米金核心，其表面带有氨基正电荷； 带负电性的模型药物，其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面，形成模型药物层； 含有二硫键骨架结构的聚合物多肽，其通过吸附包覆于模型药物层表面，形成还原响应释放层。
2.根据权利要求1所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其特征在于，所述还原响应释放层表面还修饰有透明质酸。
3.根据权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其特征在于，所述半胱胺修饰的纳米金是由氯金酸、盐酸半胱胺氢氯化物和硼氢化钠经反应制备而成。
4.根据权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其特征在于，所述还原响应释放层的聚合物多肽，是由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽单体经氧化聚合反应，在多肽单体两端形成Cys-Cys连接而制成的含多个二硫键的聚TAT多肽。
5.根据权利要求2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统，其特征在于，所述递药载体系统的粒径为100~300nm。
6.一种逐 层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将氯金酸溶液和盐酸半胱胺氢氯化物溶液混合后，加入硼氢化钠水溶液反应，得半胱胺修饰的纳米金； 合成阳离子穿膜多肽，将该多肽溶于磷酸盐缓冲溶液，再加入二甲基亚砜反应，制得含有二硫键骨架结构的聚合物多肽； 将半胱胺修饰的纳米金原液，滴加入带负电性的模型药物溶液中，混合，得半胱胺修饰的纳米金核心包覆负电性模型药物层的纳米金复合物，再加入含有二硫键骨架结构的聚合物多肽，混合，离心洗涤，得表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物递药载体系统。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤:在表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物中，加入透明质酸溶液，共孵育，离心洗涤，得表面修饰有透明质酸的逐层组装纳米金复合物递药载体系统。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述阳离子穿膜多肽的序列如SEQ ID N0.1 所示。
9.权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备肝靶向药物中的应用。
10.权利要求1或2所述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备基因治疗药物中的应用。
【文档编号】A61K47/42GK103990138SQ201310190824
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】钟延强, 于菲菲, 邹豪, 张翮, 黄景彬, 鲁莹, 俞媛, 刘俊杰, 孙治国, 张国庆, 陈琰 申请人:中国人民解放军第二军医大学