可治疗癌症的药学组合物的制作方法

可治疗癌症的药学组合物的制作方法
【专利摘要】本文揭示一种用以治疗癌症的组合物，其包含三萜化合物的新颖组合。此新颖的三萜化合物组合至少包含灵芝酸S(ganoderic?acid?S，GAS)、灵芝酸T(ganoderic?acid?T，GAT)、灵芝酸Me(ganoderic?acid?Me，GAMe)、灵芝酸R(ganoderic?acid?R，GAR)、赤灵酸S(ganodermic?acid?S，GMAS)。所揭示组合物可用来治疗或预防直肠癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。
【专利说明】可治疗癌症的药学组合物

【技术领域】
[0001]本揭示内容是有关于一种药学性组合物，其包含一新颖的三萜化合物的组合，可用来治疗癌症，包括具有抗药性的癌症。

【背景技术】
[0002]长久以来，在东南亚地区，食用性真菌都被当作营养补充品或健康食品来使用，其中又以灵芝(Ganoderma Iucidum)为大宗，且因其具有医疗效果也被当作药材使用超过千年之久。自灵芝中分离出来的活性成分大致包括灵芝三職类(triterpenoids)、多糖体(polysaccharides)、核苷(nucleic acids)、多肽类(polypeptides)、和植物固醇类(phytosterols)等等。在这些活性成分中，又以灵芝三萜类最重要，因其具有药学活性，包括抑制胆固醇合成、抗癌、抗高血压等等。灵芝三萜类包含各式灵芝酸(ganoderic acids, GAs)、赤灵酸(ganodermic acids, GMAs)、灵芝酉享(ganodericalcohol)、灵芝酮(ganoderic ketone)、灵芝醒(ganoderic aldehyde)等化合物。在灵芝酸的相关研究中发现，灵芝酸具有可杀死癌细胞的细胞毒性和抑制其扩增的效果。举例来说，已知灵芝酸D(ganoderic acid D, GAD)可防止人类子宫颈癌细胞(即，Hela 细胞)增生(Yue et al.,Mol Cell Proteomics (2008) 7:949-961);灵芝酸 A 和H (ganoderic acids A and H;简称GAA及GAH)可抑制乳癌细胞生长或防止其侵犯其它组织(Jiang et al., Int J Mol Med(2008) 21:577-584);灵芝酸 X(ganoderic acidX，GAX)可抑制拓朴酶活性并能诱使肝癌细胞进入细胞凋亡程序(Li et al.,Life Sc1.(2005) 77，252-265);灵芝酸M除了可有效地抑制癌细胞生长外，还可抑制肺癌细胞的迁移(Wang et al., Int ImmunopharmacoI (2007) 7:864-870)，GMAS 则已知可诱发血小板聚集(Wang et al., B1chim.B1phys.Acta.(1989)986，151-160)、抑制血小板功能(Wang et al.，B1chem.J.(1991) 277 (Ptl)，189-197)和抑制由血栓素 A2 (Suet al., B1chem.Pharmacol.(1999)58, 587-595;Su et al., B1chim.B1phys.Acta.(1999b) 1437，223-234)或前列腺素 El (Su et al., Thromb.Res.(1999c) 99，135-145)在血小板中所诱发的细胞反应。
[0003]本案发明人意外地发现，一种新颖的三萜化合物的组合，具有可抑制特定种类的癌细胞的功效，包括具抗药性和的癌细胞，使其不致增生，因此，可作为治疗或预防癌症的药物或其佐剂。


【发明内容】

[0004]本揭示内容至少部分是基于发现一种新颖的三萜化合物的组合，其具有可延缓或抑制癌细胞生长的特性而来，该些三職化合物系分别自灵芝(Ganoderma Iucidum)的子实体或菌丝体中单离或纯化而来。上述发现暗示本揭示内容中的新颖的三萜化合物组合可作为能治疗或预防癌症，包括对药物具有抗性的癌症，的药物或佐剂。
[0005]因此，本揭示内容的第一目的是关于一种可治疗或预防癌症的药学组合物。此药学组合物包含一药学有效量的三職化合物，其至少包含灵芝酸S(ganoderic acidS，GAS)、灵芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、灵芝酸 Me (ganoderic acid Me, GAMe)、灵芝酸R (ganoderic acid R, GAR)和赤灵酸 S (ganodermic acid S, GMAS);及其药学上可接受的载体。
[0006]依据一较佳实施方式，所述GMAS、GAMe和GAR、GAT、与GAS的量分别约为总三萜化合物含量的0.5-20%、0.5-20%、20-75%及10-30% (重量比)。适合以所述药学组合物进行治疗或预防的癌症可以是直肠癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。在一实例中，该癌症为肺癌。在另一实例中，该癌症为对吉非替尼(gefitinib)发展出抗药性的肺癌。
[0007]若以医药品或药学组合物总重量为基准，本发明的新颖三萜化合物组合约占该药学组合物总重量的0.1%至99%(重量％)。在某些实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的1%。在特定实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的5%。在其它实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的10%。在另外实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的25%。
[0008]在某些实施方式中，本发明所述医药品或药学组合物更可作为诸如外科手术、放射线治疗或化学治疗之类的其它主要癌症治疗方式外的另一种辅助性治疗，以改善该癌症治疗效果。
[0009]本揭示内容的第二目的是提供一种治疗癌症的方法。所揭示方法包括对需要治疗的个体施用一治疗有效量的三萜化合物，其包含GMAS、GAMe和GAR、GAT、与GAS。适合以本发明方法进行治疗的癌症可以是直肠癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。在一实例中，上述的癌症为肺癌。在一较佳实施方式中，该癌症是对吉非替尼具有抗药性的肺癌。该个体可以是哺乳动物，较佳是人类。
[0010]在某些实施方式中，本发明所述方法更包括在对该个体施用本发明药学组合物之前、同时或之后，额外对该个体施加外科手术、放射线治疗或化学治疗之类的其它主要癌症治疗手段，以改善对该个体的癌症治疗效果。
[0011]透过以下的详细说明与附随之权利要求书将可更了解本揭示内容的这些及其它特征。需知以上的概述及以下的详细说明仅为例示，用来阐述本揭示内容，而非用以限制本揭示内容的范围。

【具体实施方式】
[0012]为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
[0013]以下为本说明书中所用特定名词的说明:
[0014]在本文中，“治疗(treatment or treating)”一词包括可导致欲求的药学和/或生理效果的防止性(即，预防性)、治愈性或缓和性处置。该效果较佳是指医疗上可部分或完全治愈或防止癌细胞的生长。此外，“治疗”一词在此是指基于可部分或完全减轻、延迟发生、抑制进程、减轻严重性、和/或减少一种特定疾病、异常和/或医疗状况之一或多个病征出现机率的目的，而对受测个体(或患者)，尤指具有一种医疗状况、一种该医疗状况的症状、一种因该医疗状况而引起的疾病或病症、或是一种会使朝向该医疗状况发展的先期状况的个体，施用或施加本揭示内容的化合物。可对尚未出现特定疾病、异常和/或医疗状况的明显病征的个体，和/或仅对该特定疾病、异常和/或医疗状况产生早期病征的个体进行治疗，以期降低产生该特定疾病、异常和/或医疗状况相关的病理的风险。在本文中，所述病征、疾病、异常和/或医疗状况可以是原位癌或转移性癌。若能减少一或多个病征或临床指标即代表该治疗是“有效”的。
[0015]“预防(prophylaxis) ”在此是指对一种未来事件的防制手段。基于本文中预防癌细胞或因手术或诊断程序进而潜藏地增加了该些癌细胞转移的文意，因此，可在实施该手术或诊断程序之前、同时或之后，实施本文所述的预防性处置手段。
[0016]“一有效量(an effective amount) ” 一词意将对于治疗癌症的目的,此一用量在经过适当的给药期间后，能够达到减少癌细胞数目的欲求效果。
[0017]“化合物(compound) ”、“组合物(composit1n) ”、“药剂(agent) ” 或“医药品(medicine or medicament) ”等词在此可交替使用，且都是指当施用于一个体(人类或动物)时，能够透过局部和/或全身性作用而诱发所亟求的药学和/或生理反应的一种化合物或组合物。
[0018]“施用(administerecUadministering或、administrat1n) ”一词在此是指直接施用所述的化合物或组合物，或施用活性化合物的前驱药(prodrug)、衍生物(derivative)、或类似物(analog)等，而可在施用个体体内形成该活性化合物的一相当用量者。
[0019]本文中交替使用“个体(subject) ”或“患者(patient) ”等词,其是指可接受所述化合物和/或方法治疗的动物(包括人类)。“个体”或“患者”在此涵盖了雄性与雌性两种性别，除非另有具体说明。因此“个体”或“患者”包含任何哺乳类动物，包括，但不限于，人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述化合物进行治疗而获益。适合接受本发明化合物和/或方法治疗的动物较佳为人类。一般来说，“患者”一词及“个体” 一词在本文中可彼此交替使用。
[0020]虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
[0021]除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
[0022]本揭示内容至少有一部分是基于单离自灵芝子实体或菌丝体之三職化合物的新颖组合，具有可对抗癌细胞(包括具抗药性的癌细胞)增生的特性，而发展出来的。因此，此三萜化合物的新颖组合是潜在可用来治疗或预防癌症的药剂或可作为癌症药物的佐剂。
[0023]因此，本揭示内容的第一方面提供一种可治疗或预防癌症的药学组合物。此药学组合物包含一药学有效量的三職化合物，其至少包含灵芝酸S (ganoderic acidS，GAS)、灵芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、灵芝酸 Me (ganoderic acid Me, GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R, GAR)和赤灵酸S (ganodermic acid S, GMAS);及其药学上可接受的载体。
[0024]本揭示内容之三萜化合物是由灵芝属菌类中分离而来，并可透过熟知的纯化方法由赤芝(Ganoderma Iucidum)的子实体或菌丝体中分离而得,例如GAS、GAT和GAMe和GAR 可利用 Xu 等人(App.Microb1l B1technol (2010) DOI10.1007/s00253-010-2576-5)所揭示的方法进行分离或纯化；GMAS则可依据Hirotani等人(Phytochemistry (1987)，26(10),2797-2803)所揭示的方法进行分离纯化，或是依据2013年I月11日授予给陈等人的台湾专利号1381844中所述方法，利用取自培养灵芝用的废弃太空包中的灵芝菌丝体作为原料来进行分离。无论原料来自灵芝子实体或是菌丝体，所用的分离纯化方法一般都包括以溶剂(较佳是醇类溶液)，在高于室温的温度下进行萃取，接着将萃取物进行管柱层析，其包括但不限于高效液相层析(HPLC)和反相液相层析(Reverse Phase LiquidChromatograpy)等，以及浓缩、干燥等步骤,直到获得该灵芝活性化合物的干燥粉末为止。
[0025]在某些较佳实施方式中，所述GMAS的量约为总三萜化合物含量的0.5-20%(重量 ％)，例如约 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20%(重量％)，这是以组合物中所含三萜化合物的总量当作100%计算而得。在一实例中，该GMAS的量约为组合物中三萜化合物总量的1.5%。在另一实例中，该GMAS的量约为组合物中三萜化合物总量的2%。在又一实例中，该GMAS的量约为组合物中三萜化合物总量的
8% ο
[0026]所述GAMe与GAR的量约为总三萜化合物含量的0.5-20%(重量％)，例如约0.5、1、
1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、
13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5 或 20% (重量 ％)，这是以组合物中所含三萜化合物的总量当作100%计算而得。在一实例中，该GAMe与GAR的量约为组合物中三萜化合物总量的4.5%。在另一实例中，该GAMe与GAR的量约为组合物中三萜化合物总量的6.5%。在又一实例中，该GAMe与GAR的量约为组合物中三萜化合物总量的15%。
[0027]所述GAT的量约为总三萜化合物含量的20_75%(重量％)，例如约20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70、72 或 75% (重量 ％)，这是以组合物中所含三萜化合物的总量当作100%计算而得。在一实例中，该GAT的量约为组合物中三萜化合物总量的65%。在另一实例中，该GAT的量约为组合物中三萜化合物总量的70%。在又一实例中，该GAT的量约为组合物中三萜化合物总量的73%。
[0028]所述GAS的量约为总三萜化合物含量的10-30%(重量％)，例如约10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30%(重量％)，这是以组合物中所含三萜化合物的总量当作100%计算而得。在一实例中，该GAS的量约为组合物中三萜化合物总量的17%。在另一实例中，该GAS的量约为组合物中三萜化合物总量的18%。在又一实例中，该GAS的量约为组合物中三萜化合物总量的20%。
[0029]若以医药品或药学组合物总重量为基准，本发明的新颖三萜化合物组合(即，GMAS、GAMe和GAR、GAT、与GAS之组合)约占该药学组合物总重量的0.1%至99% (重量％)。在某些实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的1%。在特定实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的5%。在其它实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的10%。在另外实施方式中，本发明三萜化合物的总量至少约为该药学组合物总重量的25%。
[0030]适合以本发明所揭示的药学组合物进行治疗的癌症包括，但不限于，直肠癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。较佳是，以本发明所揭示的药学组合物来治疗具有抗药性的癌症，例如对吉非替尼具有抗药性的肺癌。
[0031]在本文中，抗药性(drug-resistance)是指癌的一种特定状态，尤指已对单一药物发展出抗性的癌的状态。举例来说，已发展出抗药性的癌包括对长春花生物碱(vinca alkaloids)(如，长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)及长春瑞宾(vinorelvine))具有抗性；对蒽环霉素(anthracyclines)(如，阿霉素(doxorubicin)、唐霉素(daunorubicin)、埃达霉素(idarubicin))具有抗性；对微管稳定药物-泰素(paclitaxel)具有抗性；和对以酪胺酸激酶(tyrosine kinase, TK)活性作为标的的药物(如，达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib))具有抗性。在一较佳实施方式中，适合以本发明药学组合物进行治疗的癌是肺癌，其是已对一种FDA核可药物-吉非替尼，发展出抗药性的肺癌。
[0032]在某些实施方式中，可将本发明所揭示的药物或药学组合物作为诸如外科手术、放射线治疗或化学治疗之类的其它主要癌症治疗方式外的另一种辅助性治疗药物，以改善该癌症的治疗效果。
[0033]可根据众所接受的药学制程来制备上述药物或药学组合物，如Remington’ sPharmaceutical Sciences (17th edit1n,ed.Alfonoso R.Gennaroj Mack PublishingCompany, Easton, Pa(1985))一书中所揭示的制程。药学上可接受的赋型剂是指可和药学制剂中其它成分兼容且与生物体兼容者。
[0034]依据本发明所揭示的实施方式，可经由任何适当的给药途径来施用本发明所揭示的药物或药学组合物，例如经过口腔服用的胶囊、悬浮液或药锭，或是以不经过肠胃道方式来施用。不经过肠胃道的施用方式包括诸如肌肉注射、静脉血管注射、皮下注射或腹腔内注射等系统性施用方式。或是，也可透过穿皮膜方式施用，如局部皮肤涂抹或是吸入性(如，支气管内、鼻腔内、口腔内或鼻滴剂等)；或是直肠内方式施用。施用时可单独给药或并同熟知的药学可接受辅剂一起给药。在较佳实施方式中，可经由口服方式(如，透过食物)将本发明化合物投予个体。
[0035]若以口服方式施用，可将本发明三萜化合物的新颖组合配方成为内含各种辅剂(如，微晶纤维素、碳酸钙、磷酸二钙及甘胺酸)；各种崩解剂(如淀粉、藻酸及特定硅酸盐)；以及颗粒黏合剂(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶及相思树胶(acacia))的药锭。除此外，还可包含诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠及滑石等的润滑剂。与此相关的较佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。上述的固态剂型也可非必要地包括涂层或壳，例如肠衣涂层，以及用来改善任一药物活性成分释放速率的涂层。这类涂层的实例已为本领域技术人员所熟知。在一实例中，所述药学组合物是被配方成为药锭。在另一实例中，所述药学组合物是被配方成为充填在软或硬明胶胶囊内或是封装在生物可分解之药包内的颗粒。当使用方式是口服用悬浮液和/或特效药液(elixirs)时，可组合活性成分与各种甜味剂或风味剂、着色剂或染料一起配方，需要时还可加入乳化剂和/或悬浮剂，以及诸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀释剂。在某些实施方式中，本发明药学组合物是被配方成为适合口服的液体剂型。此类液体配方可更包括用来维持PH值的缓冲液。也可将此液体配方充填在软胶囊内。此液体剂型可为一种溶液，悬浮液，乳化液，微乳化液，沉淀或是可携带本发明化合物、其药学上可接受的衍生物、异构物、代谢物、盐类或溶合物的任何液体介质。此液体可被设计成能改善本发明化合物其的药学上可接受盐类的溶解度，以便形成一种含有药物的乳化液或分散液。当使用这种剂型时，是将活性化合物与至少一种药学上可接受的辅药(包括，但不限于，上述辅药)一起混合后形成。
[0036]若以肠胃外(parenteral Iy )方式施用，可将本发明三職化合物的新颖组合配方成为液态的药学组合物，其可为能以静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或腹膜内注射等方式施用的无菌溶液或悬浮液。可用来制造上述无菌注射溶液或悬浮液的稀释剂包括，但不限于，1，3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其的甘油酯衍生物，或是天然药学可接受的油(如，橄榄油或菜籽油)来制造可供注射用的溶液或悬浮液。这类油性溶液或悬浮液中也可包含用来稀释的醇类或羧甲基纤维素或类似的分散剂。也可使用其它常用的界面活性剂(如，Tweens或Spans系列)或乳化剂，或药学领域制造配方时常用来增强生物可利用性的药剂。
[0037]亦可将本发明之上述医药品或药学组合物制成多种适用于局部皮肤表面施用的剂型。在此种实施方式中，可采用多种已知、适于皮肤表面使用的惰性载体来制造适合的剂型。这类剂型包括溶液、乳液、乳霜、凝胶、软膏、喷剂、皮肤贴布等。典型的惰性载体可以是，例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇、矿物油、硬脂酸醇、和可产生凝胶的物质。以上所揭示的载体或剂型都是本领域技术人员所熟知的，适合剂型的选择与本发明药学组合物的功效两者间并不具有必然的相关性。
[0038]亦可将本发明上述医药品或药学组合物制成多种适用于黏膜给药(mucosalapplicat1n)的剂型，如经颊(buccal)和/或舌下(sublingual)药物剂型单元，以递送药物穿过口腔黏膜。可使用多种生物可降解且药学可接受的高分子辅剂，此种辅剂可使得药学组合物具有可接受的吸附效果以及所欲的药物释放模式，且可和经颊和/或舌下药物剂型单元中所含的欲施用活性成分或其它成分兼容。一般来说，上述的高分子辅剂包含亲水性聚合物，其可黏附至口腔黏膜的湿润表面。高分子辅剂的实施例包括但不限于丙烯酸聚合物与共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物与共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯批咯唳；葡萄糖(dextran);瓜胶(guar gum);果胶(pectins);淀粉；及纤维素聚合物(cellulosic polymers)。
[0039]当可理解，本发明三萜化合物组合的剂量会因个体而异，这不仅是因为所用的特定化合物或组合物、给药途径、化合物(单独或连同一或多种药物)于患者体内所引发之所欲反应等因素之不同，还可能受到其它因素影响，例如:欲治疗症状的疾病状态或严重程度；患者的年龄、性别或体重、患者的健康状况；以及欲治疗的病理状态的严重程度、患者于同时进行的其它医疗或特殊饮食内容；以及本领域通常知识者可想到的其它因素；而负责照料的医疗人员最终可基于这些因素而判断出适当的剂量。可调整给药剂量与形式以提供较佳的治疗反应。治疗有效量同时也是指化合物或组合物所致的毒性或有害的效果不及于其所带来的治疗利益。在较佳的情形中，本发明三萜化合物的组合在投药时，应采用适当的剂量并持续一段时间，以减少出现症状的次数和/或严重程度。
[0040]依此,本揭示内容还提供一种可治疗一患者的癌症的方法。所揭示方法包括对该患者施用一有效量的上述本发明药学组合物，且该药学组合物可经由抑制癌细胞生长和/或复制而能有效地治疗该患者的癌症。可以任何能够有效传送此药学组合物至适合的生体作用位置的途径(如，口服、鼻用、肺、穿皮膜等方式，或是诸如直肠栓剂、皮下、静脉注射、肌肉注射、眼科溶液或软膏的类的方式)来将该药学组合物施用至一哺乳动物个体上，较佳是人类身上。此外，本发明药学组合物也可与其它活性成分同时一起施用。
[0041 ] 适合以本发明方法进行治疗的癌症包括直肠癌、肝癌、乳癌或肺癌。较佳是以本发明化合物来治疗具有抗药性的癌，包括对吉非替尼具有抗药性的癌症。
[0042]当本发明药学组合物被施用至一个体身上时，所施用的有效用量约为1-100毫克/公斤个体体重间。每天可施用至该个体身上的药学组合物的用量约为10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克/公斤体重；较佳是约30-70毫克/公斤体重，例如约30、40、50、60,70毫克/公斤体重；更佳是约50毫克/公斤体重。这些剂量可以单次施用或是分成多次在一天内施用。
[0043]在某些实施方式中，本发明所述方法更包括在对该个体施用本发明药学组合物之前、同时或之后，额外对该个体施加外科手术、放射线治疗或化学治疗之类的其它主要癌症治疗手段，以改善对该个体的癌症治疗效果。
[0044]以下实施例是用来阐明本揭示内容特定方式，并帮助本领域技术人员了解并实施本揭示内容。但本揭示内容范畴并不限于这些实施例中。
[0045]实施例
[0046]材料与方法
[0047]细胞培育
[0048]本研究是使用人类乳癌细胞株MDA-MB-231、人类肝脏细胞癌株IfepG2 (humanhepatocarcinoma cell line HepG2)、人类肺腺癌(lung adenocarcinoma)细胞株A549,人类直肠癌细胞株HCT116、人类非小型肺癌细胞株PC-9、对吉非替尼具有抗性的人类非小型肺癌细胞株PC-9 (PC9-1R)、人类非小型肺癌细胞株H1650、人类骨髓性白血球细胞株K652、人类前骨髓性白血球细胞株HL-60,以及小鼠肺癌细胞株(Lewis lung carcinoma LLC)。
[0049]将MDA-MB_231、!fepG2、HCT116，以及LLC细胞分别培育在经Dulbecco氏改良过的Eagle 氏培养基(Dulbecco’ s modified Eagle，s medium, DMEM)中，PC9, PC9-1R、H1650、K562，以及HL-60培育在RPMI培养基中，并在培养基中都添加10%胎牛血清(fetal calfserum, FCS)、100 单位 /ml 的盘尼西林、100ng/ml 的链霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2mML-谷氨酸和非必要氨基酸及丙酮酸钠，并维持在37°C的潮湿环境下(5%C02及95%空气)。平时将细胞培养于10公分培养盘内，当细胞长到八分满时进行继代培养。继代培养方式是先吸去旧的培养液后，以3毫升的磷酸缓冲液(PBS)清洗培养细胞一次，接着，在37°C下以I毫升之胰蛋白酶/EDTA (0.05%/0.025%)溶液处理细胞5分钟，使细胞脱离培养盘成悬浮状态；接着，在悬浮细胞中加入2毫升新鲜的培养液，以中和胰蛋白酶的活性。然后，将细胞打散使平均分布于细胞悬浮液中，留下适当比例的细胞数后，加入新培养液补至适当体积并混匀后，放入37°C培养箱内培养。
[0050]细胞活性分析
[0051]取约3，000个细胞，将之接种在平底96孔盘中，以培养液补充每一培养孔内的培养液，使体积达180 μ L，接着将培养盘放入37°C之培养箱培养过夜。次日加入含不同浓度的三萜化合物组合、吉非替尼或是伊马替尼，于上述培养液。各培养孔内最终体积为20 μ L，每个浓度进行三重复，放入37°C培养箱培养，于48小时后测定细胞活性。
[0052]酸性憐酸酶活性(Acid phosphatase, ACP)分析
[0053]活细胞中有大量ACP可将其受质磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate, p-NPP)转换成对-硝基苯酌.(p-nitrophenol, p-NP), p-NP 在 405nm 波长下有最大吸光值，故可藉测定吸光值可定量出细胞中ACP活性，进而推算出细胞的活性。测定细胞活性时，先吸去培养液，以200 μ L PBS清洗一次，加入100 μ I的分析用缓冲液(内含1mM p-NPP,0.1M 醋酸钠、0.l%Triton X-100，且 pH 约为 5.5)，于 37°C反应 30-40 分钟后加A 10 μ I 的氢氧化钠(0.1N)终止反应，以 SpectraMax Μ5 Microplate Reader (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)于波长405nm测定吸光值为细胞活性，以未处理药物组的细胞活性为1，计算出不同条件处理下的细胞活性比。
[0054]诱发原位癌及活体内治疗
[0055]本试验使用6周龄的C57BL/6及N0D/SCID雄鼠，饲养在无病原菌的环境下，室温维持于22±3°C，相对湿度保持于50±20%，日夜周期维持12/12小时，并可自由取用饮水及食物。动物饲料使用实验鼠饲料5001 (Laboratory Rodent Diet5001)(购自PM I ?Nutrit1n Internat1nal, Inc., MO, USA) 0动物饮水则使用煮沸过的自来水。所有动物实验操作，皆遵循中华实验动物学会出版的“实验动物管理与使用指南”的规范。
[0056]试验前一天，将动物依体重分组，分组后确认各组间体重无统计上显著差异，然后，将动物右后大腿外侧剃毛。试验开始当天，注射肿瘤细胞于剃毛处皮下，将A549人类肺癌细胞或HCTl 16人类直肠癌细胞(0.1mL生理食盐水内含IXlO7个细胞)注射至N0D/SCID小鼠，或将LLC小鼠肺癌细胞(0.1mL生理食盐水内含IXlO6个细胞)注射至C57BL/6小鼠。注射3天后，再开始投予本发明药学组合物，投药当日定为投药试验第I天。所有投药溶液均当日配制。投药时，以喂食针对试验动物灌食投药用悬浮液；每日灌食两次，两次间隔至少三小时。C57BL/6小鼠第22天完成试验，N0D/SCID小鼠第35天完成实验，实验完成后将肿瘤取下，秤量肿瘤重量并且计算本发明药学组合物抑制肿瘤生长的比例。
[0057]实施例1抑制活体外的癌细胞活性
[0058]1.1药学组合物
[0059]本揭示内容中特定可预防及/或治疗癌症的药学组合物是透过将各活性成分依据下表所示配方混合成一均匀混合物后而制得，该些活性成分是可依据本发明揭示内容中所载明的方法，自灵芝子实体或菌丝体中分离或纯化而得。
[0060]表I本揭示内容之药学组合物配方
[0061]

【权利要求】
1.一种用于治疗癌症的药学组合物，包含一药学有效量的三萜化合物，其至少包含灵芝酸 S (ganoderic acid S，GAS)、灵芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、灵芝酸 Me (ganodericacid Me, GAMe)、灵芝酸R(ganoderic acid R, GAR)和赤灵酸S(ganodermic acid S, GMAS)；及其药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药学组合物，其中GMAS的量约为该组合物中三萜化合物总量的0.5-20% (重量 ％)。
3.如权利要求1所述的药学组合物,其中GAMe与GAR的量约为该组合物中三萜化合物总量的0.5-20% (重量％)。
4.如权利要求1所述的药学组合物，其中GAT的量约为该组合物中三萜化合物总量的20-70% (重量 ％)。
5.如权利要求1所述的药学组合物，其中GAS的量约为该组合物中三萜化合物总量的10-30% (重量 %)。
6.如权利要求1所述的药学组合物，其中该癌症可以是肝癌、直肠癌、肺癌、乳癌或血癌。
7.如权利要求6所述的药学组合物,其中该肺癌对吉非替尼(gefitinib)具有抗药性。
【文档编号】A61P35/02GK104173354SQ201310205265
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】林淑萍, 黄政博, 陈登海, 陈光地 申请人:双鹤生物科技股份有限公司