一种获得微环dna的亲本质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。该亲本质粒是在出发载体pEGFP-N1-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，所述attR片段插入出发载体限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。利用该亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合的微环DNA，后续的转基因操作方法简单易行，具有重要的生物学意义及实际应用价值。
【专利说明】-种获得微环DNA的亲本质粒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。
【背景技术】
[0002] 微环DNA载体（Minicircle DNA Vector)是一种超螺旋的DNA分子，它 是亲本质粒（Parental Plasmid, PP)发生位点特异性重组的产物。在重组酶的 作用下，亲本质粒转变为两个环状DNA，一个含有大量的细菌骨架序列，称为微质 粒（Miniplasmid，MP);另一个则是仅含有目的基因的真核表达框架，即微环DNA (Minicircle，MC)。与传统质粒载体相比，微环DNA作为载体具有安全性好、携带的目 的基因表达水平高、转基因表达持续时间长等优点（Darquet AM, Cameron B，Wils P，et al. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery:supercoiled minicircle. Gene Ther,1997, 4:1341-1319. Chen ZY,He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther, 2003, 8:495-500.Bigger Bff, Tolmachov 0, Collombet JM, et al.An araC-controlled bacterial ere expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy. J Biol Chem, 2001, 276:23018-23027.)。
[0003] 已有报道利用LR克隆酶（Invitrogen, Cat. No. 11791-020)成功获得微环DNA 载体（Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al.Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Pro Natl Acad Sci U S A, 2011，108 (19) : 7902-7907)。上述报道方法为：构建亲本质粒时连入attL和attR片段， 在体外LR克隆酶的作用下attL和attR片段发生重组，生成微质粒和微环DNA，微质粒在 限制性内切酶作用下被破坏，最后通过切胶回收获得微环DNA，然而该方法存在如下缺点： 1、LR克隆酶价格昂贵，200 μ 1体系用量大，成本较高；2、微环DNA经过胶回收纯化得到，损 失大，获得量少；3、步骤繁琐，LR反应后还要进行限制性酶切将微载体破坏，造成后续微环 DNA纯化回收的困难。因此很有必要对如何高效、快速、经济地利用LR克隆酶获得微环DNA 载体的方法进行研究。
【发明内容】
[0004] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前利用LR克隆酶获得微环DNA的步骤 较繁琐以及微环DNA获得量较低的缺陷，提供一种获得微环DNA的亲本质粒及其转基因的 方法和应用，利用本发明所述的亲本质粒可以高效、快速、经济地得到微环DNA，并且高效、 快速地获得转基因细胞株。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种获得微环DNA的亲 本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体pEGFP-Nl-attB质粒中插入attR 片段和attL片段以及OC31整合酶基因表达盒构建而成，其中所述attR片段插入 pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Spe I和Dra III的酶切位点之间，所述attL片段插入 pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III和Ase I的酶切位点之间，所述OC31整合酶基 因表达盒插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III的酶切位点。
[0006] 其中所述表达盒为本领域常规表达盒，所述表达盒较佳地包括合适的转录调节序 列，以及转录终止信号，还包括有助于实现表达或实现表达所需的其他因子，如表达增强子 元件。其中所述OC31整合酶基因表达盒较佳地为链霉菌噬菌体Φ031整合酶基因表达盒， 所述表达盒或其他外源基因表达盒在亲本质粒的位置为任何位置，只要不影响该亲本质粒 的其他功能以及外源基因的表达即可。
[0007] 其中所述转录调节序列是指调节与其连接的核酸序列转录的具有调控功能的核 酸序列。当转录调节序列控制并调节核酸序列的转录和/或翻译时，所述转录调节序列"可 操作地连接"于所述核酸序列。转录调节序列，或表达控制序列较佳地包括启动子、增强子、 内部核糖体进入位点、转录终止子、位于蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号以 及终止密码子。
[0008] 其中所述"转录调节序列"是指核酸序列，其功能是控制一个或多个编码序列的 转录，并且对于编码序列的转录起始位点的转录方向而言位于其上游，并且在结构上由DNA 依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列决定，包括但不限于转录因 子结合位点、阻遏和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的作用是直接或间接调节 由启动子转录的任何其他核酸序列，包括衰减子、增强子或者沉默子。其中所述启动子较佳 地包括组成型启动子，诱导型启动子和/或组织特异性启动子。其中所述组成型启动子是 在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。诱导型启动子是受到生理或 发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂进行调节的启动子。组织特异性启动子仅在 特定类型的组织或细胞中有活性。本发明所述OC31整合酶基因表达盒中的启动子为常规 启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为PGK启动子；其中所述外源基因表达盒中的启动子 为常规启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为CMV启动子。
[0009] 其中所述OC31整合酶基因为常规的OC31整合酶基因，所述OC31整合 酶基因较佳地为小鼠密码子优化的OC31整合酶基因 （Raymond CS and Soriano P. High-efficiency FLP and PhiC31site-specific recombination in mammalian cells. PLoS one, 2007, 2:el62.)或者链霉菌噬菌体OC31整合酶。其中所述attL片段与 attR片段为本领域常规核酸序列，所述attR片段和attL片段较佳地是指λ噬菌体的attP 位点和细菌基因组中attB位点发生定点重组后产生的核酸序列。所述attL片段与attR 片段的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成序列即得。
[0010] 本发明所述attR片段的制备方法较佳地为：利用attR-up引物和attR-down引 物，以attR单链序列和attRrc单链序列为模板，进行PCR反应即得。
[0011] 其中所述attR-up引物的序列较佳地如序列表中SEQ ID NO: 1所示，所述引物含 有Spe I限制性酶切位点；其中所述attR-down的序列较佳地如序列表中SEQ ID N0:2所 示，该引物含有Dra III限制性酶切位点。其中所述引物的制备方法为常规制备方法，较佳地 为人工全序列合成。
[0012] 其中所述attR单链序列为本领域常规序列，所述attR单链序列较佳地为序列表 中SEQ ID N0:3所示（125bp);所述attRrc单链序列为本领域常规序列，所述attRrc单链 序列较佳地为序列表中SEQIDN0:4所示（125bp)。本发明所述attR单链序列和attR;rc 序列的制备方法为常规制备方法，较佳地为人工全序列合成。
[0013] 其中所述的PCR反应为本领域常规的PCR反应。所述PCR反应的体系较佳地为： 模板 attR 单链和 attRrc 单链各 5ng，引物 attR-up 和 attR-down (10 μ M)各 1 μ 1，ExTaq 酶（5υ/μ 1) 0· 25μ 1，lOXExTaq Buffer5y 1，dNTP (2. 5mM) 4μ 1，加 ddH20 至 50μ 1。
[0014] 其中所述PCR的程序较佳地为：（1)94°C变性30s ;(2)55°C复性30s，（3)72°C延 伸30s，步骤（1)?（3)循环26次；（4) 72°C，延伸2min。
[0015] 其中所述attL片段为常规，所述attL片段的制备方法较佳地为：将attL单链和 attLrc单链各稀释成100?150 μ Μ的溶液，将溶液等摩尔混合，放置在100°C沸水的烧杯 中自然冷却到20?40°C即得。
[0016] 其中所述attL单链序列较佳地为序列表中SEQ ID N0:5所示（107bp，5'端含 Afllll限制性酶切粘末端）；其中所述attLrc单链较佳地为序列表中SEQ ID N0:6所示 (105bp，5'端含Asel限制性酶切粘末端）。其中所述attL单链和attLrc单链的制备方法 为常规制备方法，较佳地为人工合成全序列即得。
[0017] 其中所述获得微环DNA的亲本质粒以出发载体为基础进行构建，所述出发载体为 本领域常规载体，较佳地为真核表达载体，更佳地为pEGFP-Nl-attB质粒。
[0018] 其中所述的出发载体较佳地还包括荧光蛋白，所述荧光蛋白为常规荧光蛋白，较 佳地为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白，本发明所述出发载体包含的荧光蛋白更佳地为增强 型绿色荧光蛋白（EGFP)。
[0019] 本发明所述亲本质粒的构建方法为常规构建方法，所述构建方法较佳地 为：首先在pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Spe I和Dra III位点中插入attR序 列构建pEGFP-Nl-attB-attR载体；其次在pEGFP-Nl-attB-attR载体的限制性内切 酶Afl III和Ase I位点中插入attL序列，构建pEGFP-Nl-attB-attR-attL载体；最 后将所得pEGFP-Nl-attB-attR-attL利用限制性内切酶Af 1 III酶切后获得线性化 pEGFP-Nl-attB-attR-attL质粒，将所得线性化质粒补平后去磷酸化，与线性化OC31整合 酶基因表达盒连接，即得pEGFP-Nl-attB-attR-attL-C>C31亲本质粒。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：一种包含如上所述的亲本 质粒的重组表达转化体。
[0021] 其中所述重组表达转化体是指含有本发明所述亲本质粒的转化细胞。其中所述重 组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述亲本质粒pEGFP-Nl-attB-attR-attL-〇C31转 化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要 能满足使所述转亲本质粒稳定地自行复制，且其所携带的外源基因可被有效表达即可。其 中所述宿主微生物较佳地为：大肠埃希氏菌（E.coli)，更佳地为大肠埃希氏菌DH5ci或大 肠埃希氏菌T0P10。将前述亲本质粒转化至E.coli DH5ci中，即可得本发明优选的重组表 达转化体。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法、热激法或电转 法。
[0022] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：一种转基因方法，其中所述 转基因方法包括以下步骤：
[0023] (1)在如上述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源基因；
[0024] (2)将步骤（1)所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR重组反 应,得到包含微环DNA和表达Φ031整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反应的条 件为：20?30°C，反应3?14小时；
[0025] (3)利用所得LR重组体系转染宿主细胞。
[0026] 步骤（1)为在如上所述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源基因。 其中所述插入外源基因的方法为本领域常规方法，较佳地为通过在上述获得微环DNA的亲 本质粒的多克隆位点中选择适当的内切酶位点进行克隆插入外源基因即得插入外源基因 的亲本质粒。
[0027] 步骤（2)为：将步骤（1)所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR 重组反应，得到包含微环DNA和表达Φ031整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反 应的条件为：20?30°C，反应3?14小时。
[0028] 其中所述LR克隆酶为常规LR克隆酶，是指能够催化LR重组反应的LR克隆酶。所 述LR重组反应为常规LR重组反应，即attL序列和attR序列之间发生重组反应。其中所 述LR克隆酶的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。
[0029] 其中所述LR重组反应的温度更佳地为25°C，LR重组反应的反应时间更佳地为4 小时。
[0030] 其中所述LR重组体系中微环DNA和表达OC31整合酶的质粒的摩尔比为1:1，共 转染真核细胞时，在所述LR重组体系中可添加表达Φ031整合酶的质粒，使共转染体系中 微环DNA与表达OC31整合酶的质粒的摩尔比较佳地为1:1?1:100,更佳地为1:5。
[0031] 其中所述转染宿主细胞较佳地为真核细胞，更佳地为贴壁生长的真核细胞，优选 地为具有假attp位点的真核细胞。所述真核细胞较佳地包括来自于人、小鼠、大鼠、果蝇、 兔、羊和牛的真核细胞，更佳地包括：HeLa细胞，牛耳皮肤成纤维细胞和羊耳皮肤成纤维细 胞。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为：如上所述的亲本质粒在制 备转基因载体中的应用。
[0033] 本发明所述获得微环DNA的亲本质粒能够广泛应用于转基因技术和基因治疗领 域。所述应用较佳地为将所述获得微环DNA的亲本质粒经LR重组反应后所得的微环DNA 作为转基因载体将外来基因导入宿主细胞的基因组中。
[0034] 其中所述转基因技术是指将具有潜在应用价值的基因通过一定方式导入培养的 细胞中，使有应用价值的蛋白高效表达的一种生物工程技术，更佳地为利用本发明所述获 得微环DNA的亲本质粒携带具有潜在应用价值的基因通过一定方式导入宿主细胞，从而达 到获得有应用价值的蛋白的目的。
[0035] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五为：如上所述的亲本质粒在制 备基因治疗药物中的应用。
[0036] 其中所述基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入 人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的一种生物医学新 技术，更佳地为利用本发明所述获得微环DNA的亲本质粒通过LR重组反应所得的微环DNA 载体，该微环DNA载体不含细菌骨架序列，安全性较高。微环DNA能够将其携带的正常基因 或有治疗作用的基因通过一定方式导入宿主细胞以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而 达到治疗疾病的目的。
[0037] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0038] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039] 本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的获得微环DNA的亲本质粒经LR重 组反应后，该LR重组体系中的微环DNA载体对靶细胞进行转基因操作时具有较高的转基因 效率，外源基因的转染率和整合效率均大幅提高，表达量也增加。利用该亲本质粒获得的微 环DNA载体进行转基因操作无需太多昂贵的LR克隆酶，仅使用少量LR克隆酶即可；所得LR 重组体系无需纯化，可直接用于转基因操作，操作方法简单易行。利用本发明提供的获得微 环DNA的亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合外源基因的微环DNA，具有重 要的生物学意义及实际的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31亲本质粒的构建策略图。
[0041] 图2为pEGFP-Nl-attB_attR-attL-C>C31亲本质粒的LR重组反应示意图。通过 将该亲本质粒进行LR重组反应即得到微环DNA和表达Φ031整合酶的微质粒。
[0042] 图3为attR双链PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1为PCR产物，泳道2 为 100bp marker。
[0043] 图4为Pvu II酶切含有OC31整合酶基因的pPGKPhiC31obpA质粒琼脂糖凝胶电 泳图谱。其中泳道1为1Kb marker，泳道2为酶切产物。
[0044] 图5为EcoR I限制性酶切pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31亲本质粒琼脂糖凝 胶电泳图谱。其中 1-13 泳道分别为：2kl5,2kl4,2kl2,2kll，2kl0,2k8，lKbmarker，2k7， 2k6,2k5,2k3,2k2 和 2kl。
[0045] 图6为EcoR I限制性酶切LR重组反应体系琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道1为LR 重组反应体系，泳道2为1Kb marker。
[0046] 图7为微环DNA载体转染率测定结果图。其中1为微环DNA载体转染HeLa细胞， 2为pEGFP-Nl-attB质粒载体转染HeLa细胞。
[0047] 图8为微环DNA载体整合率测定结果图。其中1为微环DNA载体转染HeLa细胞， 2为pEGFP-Nl-attB质粒载体转染HeLa细胞。
[0048] 图9为OC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以"MC"表示）或pEGFP-Nl-attB 质粒载体（以"C"表示)转染HeLa细胞所得细胞克隆的基因组中EGFP部分片段PCR产物琼 脂糖凝胶电泳图谱。其中卜13泳道分别为：水，2k8 (亲本质粒，阳性对照)，100bp marker, MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, Cl，C2, C3, C4 和 C5。
[0049] 图10为OC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以"MC"表示）或pEGFP-Nl-attB 质粒载体（以"C"表示)转染HeLa细胞所得细胞克隆基因组中attB部分片段PCR产物琼脂 糖凝胶电泳图谱。其中1-13泳道分别为：水，2k8(亲本质粒，其中attB位点完整，作为PCR 反应的阳性对照），l〇〇bp marker，MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, Cl，C2, C3, C4 和 C5。
[0050] 图11为OC31整合酶载体分别与微环DNA载体（以MC表示)或pEGFP-Nl-attB质 粒载体（以C表示)转染HeLa细胞所得细胞克隆基因组中LR重组部分片段PCR产物琼脂糖 凝胶电泳图谱。其中1-8泳道分别为：MCI，MC2, MC3, MC4, MC5, LR重组体系（PCR反应的阳 性对照)，lOObp marker和C1 (其中不含LR位点，为阴性对照)。
[0051] 图12为OC31整合酶载体分别与微环DNA载体或pEGFP-Nl-attB质粒载体共转 染HeLa细胞所获细胞克隆中目的基因 EGFP表达量的流式细胞仪测定结果图。其中1为微 环DNA载体整合HeLa细胞克隆的平均荧光强度，2为pEGFP-Nl-attB质粒整合HeLa细胞克 隆的平均荧光强度。
【具体实施方式】
[0052] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。所述室温为20?40°C。
[0053] 以下实施例中，所用到的含有目的基因绿色荧光蛋白（EGFP)和attB位点的质粒 pEGFP-Nl-attB及含有目的基因 ΤΡ0的质粒pPlA3-hTP0由上海医学遗传研究所提供。其 中，质粒pEGFP-Nl-attB的构建方法请参考专利号为ZL200510111476. 3的中国发明专利， pPlA3-hTP0的构建参考宁云山等的方法（宁云山等，ΤΡ0内含子V可显著增强人血小板生 成素基因在乳腺细胞中的表达，中国生物化学与分子生物学报，2007,23(07) :537-541)。 含链霉菌噬菌体OC31整合酶基因的质粒pPGKPhiC31obpA购于Addgene (Addgene Plasmid#13795)〇
[0054] 使用的HeLa细胞购自中科院生化细胞所。LR克隆酶购自Invitrogen公司（Cat. No. 11791-020)。引物及attL和attR各自两条单链都合成于Invitrogen公司。PCR纯化 试剂盒、胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司。
[0055] 蛋白酶K购自Invitrogen公司；DMS0购自Sigma-Aldrich公司；Tris饱和酌·购 自上海沓玛生物科技有限公司；氯仿为无锡市东风化工厂出品；异戊醇为上海试剂一厂生 产；醋酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇由常熟市杨园化工有限公司生产。
[0056] 以下实施例中，如非特别说明，所用试剂均购自NEB公司。
[0057] 实施例1亲本质粒载体的构建
[0058] 本发明所述pEGFP-Nl-attB_attR-attL-C>C31质粒的构建策略如图1所示，在 pEGFP-Nl-attB质粒上依次连入attR序列，attL序列和OC31整合酶基因。
[0059] 1、连入attR片段
[0060] 引物设计：attR-up (含有Spel限制性酶切位点），其序列如序列表中SEQ ID NO: 1 所示；
[0061] attR-down (含有Dra III限制性酶切位点），其序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
[0062] PCR扩增获得attR双链片段。
[0063] attR 和 attRrc 单链由 Invitrogen 公司合成。
[0064] attR序列，其序列如序列表中SEQ ID N0:3所示（125bp);
[0065] attRrc序列，其序列如序列表中SEQ ID N0:4所示（125bp)。
[0066] PCR反应体系（50 μ 1):模板attR和 attRrc 单链各 5ng，引物attR-up 和 attR-down (10μΜ)各 1μ l，ExTaq 酶（5υ/μ 1)0. 25μ l，10XExTaq Buffer5y l，dNTP (2· 5πιΜ)4μ 1， 加 ddH20 至 50 μ 1。
[0067] PCR 反应程序：（1)94°C变性 30s ;(2)55°C复性 30s，（3)72°C延伸 30s，步骤（1)? (3)循环 26 次；（4)72°C，延伸 2min。
[0068] 将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。经过PCR后得到了目的 条带双链attR (144bp)。
[0069] 将扩增获得的双链attR和pEGFP-Nl-attB质粒分别进行Spe I和Dra III双酶切， 酶切条件均为：37°C，酶切2小时。酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化后再进行连接。连接产 物转化感受态细胞，挑单克隆。利用上述PCR方法验证质粒中连接上attR片段后，送博尚 生物技术有限公司测序，序列完全正确。确认pEGFP-Nl-attB质粒已连接上attR片段。
[0070] 2、连入attL片段
[0071] Invitrogen公司合成获得attL的两条单链：
[0072] attL(107bp，5'端含Afl III限制性酶切粘末端），其序列如序列表中SEQ ID N0:5 所示；
[0073] attLrc(105bp，5'端含Ase I限制性酶切粘末端），其序列如序列表中SEQ ID NO :6所示。
[0074] 将所得attL和attLrc单链各稀释成浓度为100 μ Μ的溶液，将所得溶液等摩尔混 合，放置在l〇〇°C沸水的烧杯中自然冷却到20?40°C，即可获得双链attL序列，所得attL 序列摩尔浓度为50 μ M，质量浓度为1734. 6ng/μ 1，将其浓度稀释成17. 35ng/μ 1。
[0075] 将pEGFP-Nl-attB-attR质粒用Af 1 III和Ase I双酶切，酶切条件为37°C，水浴加 热2小时。酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化，测浓度为82. 7ng/ μ 1，再进行连接。
[0076] 连接体系（20μ 1)为：10XT4DNA Ligase Buffer2y 1，双链 attL(17. 35ng/ μ 1)3. 1 μ 1，pEGFP-Nl-attB-attR 载体（82. 7ng/y 1)2. 4μ 1，T4Ligasel μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。反应条件：在16°C PCR仪器中过夜反应。
[0077] 连接产物转化感受态细胞，挑单克隆，送博尚生物技术有限公司测序，序列完全正 确，确认pEGFP-Nl-attB-attR质粒已连接上attL片段。
[0078] 3、连入OC31整合酶基因
[0079] ?仰11酶切含有〇〇31整合酶基因的？?6即11扣31(^4质粒，目的片段为2.91〇3。酶 切体系为：DNA (pPGKPhiC31obpA 质粒）24μ g、Pvu II酶（2〇υ/μ 1)8μ l、10Xbuffer8y 1、 加 ddH20至80 μ 1。酶切条件为37°C，水浴加热2小时。
[0080] 纯化酶切产物：胶回收试剂盒纯化Pvu II酶切产物。回收结果：产物浓度52. lng/ μ 1，产物体积40 μ 1。酶切的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。Pvu II酶可切出2907bp、 187bp、2514bp三条带（图中有一条约550bp非特异性酶切产生的条带)，将2. 9Kb条带切下 回收。
[0081] Afl III 酶切 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 质粒，目的片段 4. 4Kb。酶切体系为： DNA (pEGFP-Nl-attB-attR-attL 质粒）10 μ g、酶（5U/μ 1) 12 μ 1、10Xbufferl2 μ 1、 100XBSA1. 2μ 1、加 ddH20至120μ 1，酶切条件为37°C，水浴加热2小时。
[0082] PCR纯化试剂盒回收Afl III酶切产物，即线性化的pEGFP-Nl-attB-attR-attL质 粒。回收结果：产物浓度213. 8ng/μ 1，产物体积35 μ 1。
[0083] 补平线性化的 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 质粒，补平体系：10Xbuffer5 μ 1、 0· 1%BSA5 μ 1、dNTP (2. 5mM) 5 μ 1、DNA33. 5 μ 1、T4DNA 聚合酶 2 μ 1。
[0084] 补平反应步骤为：
[0085] a.将所述 4 个组分（10 Xbuffer5 μ 1、0· 1%BSA5 μ 1、dNTP (2. 5mM) 5 μ 1、DNA (pEGFP-Nl-attB-attR-attL 质粒）33. 5μ 1)混匀，70°C lOmin 预变性，移入 37°C水浴中降 温。
[0086] b.加入T4DNA聚合酶，混匀，37°C水浴15min。
[0087] c.用振荡器剧烈震荡使酶失活。利用PCR纯化试剂盒回收补平产物，回收结果： 产物浓度为120. lng/μ 1，产物体积为50 μ 1。
[0088] 将所得纯化的补平产物去磷酸化，去磷酸化反应体系：DNA43. 5 μ 1、CIP (牛小肠碱 性磷酸酶)2μ l、10Xbuffer35y 1，反应条件：37°C水浴lh。利用PCR纯化试剂盒回收去磷 酸化产物，回收结果：产物浓度115. 7ng/μ 1，产物体积30 μ 1。
[0089] 连接体系：回收酶切所得片段16μ 1、去磷酸化pEGFP-Nl-attB-attR-attL载体 1μ l、10Xbuffer2y 1、连接酶 1μ 1，PCR 仪中 16°C过夜。
[0090] 在卡那霉素抗性平板上得到16个克隆(编号2kl?2kl6)，抽提质粒后选 取大小合适的质粒进行EcoR I限制性酶切，检测OC31整合酶基因是否正确插入 pEGFP-Nl-attB-attR-attL 质粒载体。
[0091] 用EcoR I限制性酶切所得质粒，酶切条件为37°C，水浴加热2小时。酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。若所得片段正确插入载体，则能切出1.2Kb 和6. 1Kb的条带，从图5中可知第6泳道编号为2k8的质粒酶切结果正确，送博尚生物 技术有限公司测序。测序结果显示OC31整合酶基因无突变正确插入载体，成功获得 pEGFP-Nl-attB-attR-attL- Φ C31 质粒。
[0092] 实施例2LR重组反应
[0093] 反应体系（10μl)为以下组分：DNA(实施例l制备所得2k8质粒）200ng、10XTE bufferlyl、LR克隆酶（LR clonase)2yl、加 ddH20至10μ1。也可在质粒抽提时用1XTE buffer溶解质粒（2k8)，此时反应体系（10μ 1)为：DNA(2k8质粒）200ng、LR克隆酶（LR clonase) 2 μ 1、补加 1 XTE buffer 至 10 μ 1。
[0094] 反应条件：PCR仪中25°C保温处理3h?14h，该质粒的LR克隆反应过程如图2所 /_J、1 〇
[0095] 用EcoR I限制性酶切LR反应体系。若pEGFP-Nl-attB-attR-attL_〇C31质粒发 生LR重组反应，则能切出2. 1Kb (微环DNA)和5. 2Kb的(微质粒）两条带，若为原始亲本质 粒则能切出1.2Kb和6. 1Kb的两条带。酶切体系为：EcoR I酶1μ l、10Xbuffer2y 1、LR 反应体系10 μ 1、ddH20至20 μ 1，反应条件：37°C水浴2h。
[0096] 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。从电泳图可看出5. 2Kb的条 带亮度明显高于6. 1Kb的条带，而1. 2Kb条带太弱几乎看不到，说明大部分亲本质粒都发生 了 LR重组反应。
[0097] 实施例3转染HeLa细胞
[0098] 用 GenJet?Plus DNA In Vitro Tranfection Reagent 转染试剂（SignaGen Laboratories，Cat. No. SL100499)转染实施例2所得的LR反应体系到12孔板中的HeLa细 胞。
[0099] 转染步骤：
[0100] (1)用 750μ 1 无血清 DMEM (GIBCO, Cat. No. 11995-073)为 Hela 细胞换液。
[0101] (2)准备两个1.5ml EP管，分别标记为A管和B管。若为实验组，则A管中依次 加入无血清 DMEM38y 1，LR 重组反应体系 10μ 1，pPGKPhiC31obpA 质粒（200ng/y 1) 3μ 1， 吹打3?4下混匀。若为对照组，则Α管中依次加入无血清DMEM38 μ 1，pEGFP-Nl-attB质 粒（lOOng/μ 1) 1. 39μ 1，pPGKPhiC31obpA 质粒（200ng/y 1) 3· 72μ 1，吹打 3 ?4 下混匀。 实验组与对照组的Β管相同，都分别依次加入无血清DMEM38 μ 1，转染试剂4 μ 1，吹打3? 4下混勻。
[0102] (3 )将Β管混合液加到Α管中，吹打3?4下混匀。
[0103] (4)将混合液室温放置20min (小于30min即可）。
[0104] (5)将所得混合液均匀滴加入12孔板中。
[0105] (6)将12孔板放入培养箱中，于37°C，5%C02 (体积比）条件下培养24h后换液，可 测转染率。
[0106] 转染体系如表1所示：
[0107] 表1转染细胞的质粒体系 [0108]
【权利要求】
1. 一种获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体 pEGFP-Nl-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及OC31整合酶基因表达盒构建而成， 其中所述attR片段插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Spe I和Dra III的酶切位点 之间，所述attL片段插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III和Ase I的酶切位点 之间，所述OC31整合酶基因表达盒插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III的酶 切位点。
2. 如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述attR片段为λ噬菌 体attR片段，所述attL片段为λ噬菌体attL片段。
3. 如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述ΦC31整合酶基因表 达盒中的启动子片段为PGK启动子片段。
4. 一种包含如权利要求1?3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒的重组表达转化 体。
5. -种转基因方法，其特征在于，所述转基因方法包括以下步骤： (1) 在权利要求1?3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒的多克隆位点中插入外源 基因； (2) 将步骤（1)所得的获得微环DNA的亲本质粒中加入LR克隆酶进行LR重组反应，得 到包含微环DNA和表达Φ031整合酶的微质粒的LR重组体系，所述LR重组反应的条件为： 20?30°C，反应3?14小时； (3) 利用所得LR重组体系转染宿主细胞。
6. 如权利要求5所述的转基因方法，其特征在于，步骤（2)所述LR重组体系中微环DNA 与表达OC31整合酶的质粒的摩尔比为1:1?1:100。
7. 如权利要求5所述的转基因方法，其特征在于，步骤（3)所述宿主细胞为真核细胞。
8. 如权利要求1?3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒在制备转基因载体中的应 用。
9. 如权利要求1?3任一项所述获得微环DNA的亲本质粒在制备基因治疗药物中的应 用。
【文档编号】A61K48/00GK104232676SQ201310229687
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】马晴雯, 刘浏, 曾凡一 申请人:上海市儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司