用于制备Col17-IgG1Fc融合蛋白的细胞系及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于制备Col17-IgG1Fc融合蛋白的细胞系及其应用。本发明提供了COL17NC16A-IgG1Fc质粒稳定转染的293T细胞系BPKU，其保藏编号为CGMCCNo.7801。本发明还保护BPKU在制备Col17-IgG1Fc融合蛋白中的应用，Col17-IgG1Fc融合蛋白在制备用于治疗大疱性类天疱疮的药物中的应用。现有的大疱性类天疱疮治疗药物利妥昔单抗对所有B细胞均具有杀伤作用，所以副作用较大。Col17-IgG1Fc融合蛋白具有特异性杀伤大疱性类天疱疮患者体内的COL17NC16A特异性B细胞的作用，可以避免杀伤其它B细胞，副作用极低。本发明提供的细胞系BPKU，具有高效生产Col17-IgG1Fc融合蛋白的性能。本发明对于大疱性类天疱疮的治疗具有重大价值。
CGMCC No.7801
2013.06.25
【专利说明】用于制备Co 117-1 gG1 Fe融合蛋白的细胞系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于制备Coin-IgGlFc融合蛋白的细胞系及其应用。
【背景技术】
[0002] 大疱性类天疱疮（Bullous pemphigoid, BP)是最常见的皮肤自身免疫性表皮下大 疱病，主要发生在老年人。临床表现以皮肤出现瘙痒性红斑、张力性的水疱和大疱为特征， 黏膜损害较少见。重症患者可出现严重的水电解质紊乱、低蛋白血症、感染甚至发生败血 症，可危及生命。目前该病的一线治疗是系统应用糖皮质激素和/或免疫抑制剂，长期使用 可能导致感染、血栓、骨质疏松、糖尿病、高血压、消化道溃疡穿孔出血等，严重威胁患者的 健康和生命。近年来逐渐推广的米诺环素与烟酰胺联合疗法可明显降低治疗副作用，但仍 有相当数量的病人对上述常规治疗不敏感，或者出现无明显诱因的复发。分析既往治疗手 段在疗效和副作用方面的缺陷，很大程度与其治疗靶点不特异有关；未针对BP发病的最关 键环节进行干预。故借助于对BP发病机制深入研究，筛选其中的关键环节作为特异性治疗 靶点，可能研制出更为高效、低毒的治疗药物。
[0003] 近年来以生物制剂为代表的特异性靶向治疗发展迅速，为解决目前BP治疗中 所存在的不足提供了新的思路。由于体液免疫介导了 BP的主要发病过程，B细胞合成致 病性自身抗体是BP的关键发病环节，故利用以B细胞为攻击靶点的药物--利妥昔单抗 (Rituximab)杀伤B细胞，可阻断自身抗体的产生，从而达到治疗BP的目的。利妥昔单抗 是基因重组合成的抗⑶20单克隆抗体，能够特异地结合B细胞表面特异性抗原⑶20,其Fe 段与NK细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞等细胞表面的Fe受体结合，可以诱导抗体依赖细 胞介导的细胞毒效应（ADCC)，同时通过抗体Fe段激活补体依赖的细胞毒效应（CDC)，从而 达到杀伤B细胞的功效。多个病例回顾研究已经报道了利用利妥昔单抗治疗BP的成功经 验。这种靶向治疗的疗效和特异性都较之前明显提高。但是，非特异地杀伤所有B细胞会 导致机体在一定时间内完全缺乏B细胞，增加了严重感染的风险。B细胞的完全清除和重建 还可能使病人的B细胞免疫记忆受损。部分病人对该种治疗无效或出现复发，提示产生自 身抗体的病理性B细胞可能并未被完全清除。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于制备Coll7_IgGlFc融合蛋白的细胞系及其应用。
[0005] 本发明提供了一种C0L17NC16A-IgGlFc质粒稳定转染的293T细胞系BPKU，简称细 胞系BPKU，已于2013年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No. 7801。
[0006] 本发明还保护细胞系BPKU在制备Col 17-1 gGIFe融合蛋白中的应用；所述 C〇117-IgGlFc融合蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0007] 本发明还保护一种制备所述C〇117-IgGlFc融合蛋白的方法，包括如下步骤：培 养细胞系BPKU并收集培养上清，即为含有所述Col 17-IgGlFc融合蛋白的溶液。培养所述 细胞系时可以采用DMEM不完全培养基。所述方法还可包括如下步骤：取所述培养上清， 12000rpm离心lOmin，收集上清液并加入50kD超滤离心管中，4°C、4000g离心15min，得到 含有所述C 〇117-IgGlFc融合蛋白的蛋白浓缩液。
[0008] 本发明还保护细胞系BPKU在制备用于治疗大疱性类天疱疮的药物中的应用。
[0009] 本发明还保护一种用于治疗大疱性类天疱疮的药物，其活性成分为以上所述方法 制备得到的C 〇117-IgGlFc融合蛋白。
[0010] 本发明还保护所述Coin-IgGlFc融合蛋白在制备用于治疗大疱性类天疱疮的药 物中的应用。
[0011] 本发明还保护一种用于治疗大疱性类天疱疮的药物，其活性成分为所述 C〇117-IgGlFc 融合蛋白。
[0012] 本发明还保护所述Coin-IgGlFc融合蛋白以及编码所述Coin-IgGlFc融合蛋白 的基因。所述基因具体可如序列表的序列2所不。
[0013] 现有的大疱性类天疱疮治疗药物利妥昔单抗不能区分C0L17NC16A特异性B细胞， 对所有B细胞均具有杀伤作用，所以副作用较大。C 〇117-IgGlFc融合蛋白具有特异性杀伤 大疱性类天疱疮患者体内的C0L17NC16A特异性B细胞的作用，可以避免杀伤其它B细胞， 副作用极低。本发明提供的细胞系BPKU，具有高效生产C 〇117-IgGlFc融合蛋白的性能。本 发明对于大疱性类天疱疮的治疗具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为质粒pFUSE_hIgGle4_Fc2的结构示意图。
[0015] 图2为各个重复处理得到的蛋白浓缩液的SDS-PAGE电泳图。
[0016] 图3为实施例1中第一个重复处理步骤2得到的蛋白浓缩液的western blot结 果。
[0017] 图4为实施例2中第一位BP患者的分选阳性细胞液的流式细胞仪测定结果。
[0018] 图5为实施例3的步骤一中第一位BP患者的结果。
[0019] 图6为实施例3的步骤二中第一位BP患者的结果。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。本实验遵循《赫尔辛基宣言》，得到了北京大学第一医院伦理委员会的批准，患者及正 常志愿者均签署了知情同意书。
[0021] Lipofectamine2000 :Invitrogen( 11668-019)。50kD 超滤离心管：Sartorius。辣 根过氧化物酶标记山羊抗人IgG抗体：康为世纪。辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG抗体： 康为世纪。山羊抗人IgG (H+L)抗体：康为世纪。肝素抗凝管(绿管真空采血管）:BD公司。 D-Hank液(不含钙镁离子):北京鼎国昌盛。红细胞裂解液（B型):TIANDZ公司。血细胞计数 板：求精医用仪器厂。磁珠分选缓冲液：Miltenyi Biotec。CD19磁珠：Miltenyi Biotec。 CD19-PE :BD公司。HEK293T细胞：北京协和细胞库。LS型细胞分选柱：Miltenyi Biotec。 APEX Antibody Labling Kit :Invitrogen。利妥昔单抗：Roche。质粒 pFUSE_hIgGle4_Fc2 (结构不意图见图l):Invivogen公司，Catalog#pfc2_hgle4。DMEM不完全培养基：Gibico。 DMEM完全培养基：在DMEM不完全培养基中加入胎牛血清，使其体积百分比含量为10%。PBS 缓冲液（pH7. 4、0. Olmol/L):取 NaC18g、KC10. 2g、NaH2PO4L 44g 和 KH2PO4O. 24g，用蒸馏水溶 解并定容至1000ml。
[0022] BP(Bullous Pemphigoid):大疱性类天疱疮。ADCC(Antibody Dependent Cell Cytotoxicity):抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。Q)C(Complement Dependent Cytotoxicity):补体依赖的细胞毒作用。PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell):夕卜 周血单个核细胞。
[0023] 实施例1、细胞系BPKU的获得
[0024] 一、重组质粒的构建
[0025] 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0026] 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增， 回收PCR扩增产物。
[0027] Fl :5, -CCGGAATTCGAGGAGGTGAGGAAGCTGAA-3,；
[0028] Rl :5, -GGAAGATCTTCCTCGGAGATTTCCATT-3?。
[0029] 3、用限制性内切酶EcoRI和BglII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0030] 4、用限制性内切酶EcoRI和BglII双酶切质粒PFUSE-hIgGle4-Fc2,回收约 4172bp载体骨架。
[0031] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒
[0032] PFUSE-hIgGle4-Fc2-Coll7。 根据测序结果，对重组质粒 pFUSE-hIgGle4-Fc2-Coll7 进行结构描述如下：在质粒 pFUSE-hIgGle4-Fc2 的 EcoRI 和 BglII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'末端第1至234位核苷酸所示的双链DNA 分子。序列表的序列2所示的双链DNA分子与质粒pFUSE-hIgGle4-Fc2中IgGlFc片段的 编码序列形成序列表的序列2所示的融合DNA分子，表达序列表的序列1所示的蛋白质。 序列表的序列1所示的蛋白质中，自N末端第1至78位氨基酸残基组成C 〇117片段(又称 C0L17NC16A片段或C0L17NC16A抗原表位)，第81至307位氨基酸残基组成IgGlFc片段。将 序列表的序列1所示的多肽命名为Col 17-IgGlFc融合蛋白，将序列表的序列2所示的DNA 分子命名为C〇117-IgGlFc融合基因。
[0033] BP发病机制方面的研究进展证实了针对半桥粒中C0L17分子的NC16A表位的自身 抗体是导致BP的最重要的致病性抗体。从BP患者血中分离出C0L17NC16A特异性的B细 胞，这些B细胞在体外可以分泌抗C0L17NC16A的抗体。故患者体内的C0L17NC16A特异性 B细胞可作为治疗BP的关键靶点。C 〇117-IgGlFc融合蛋白，通过C0L17NC16A抗原表位与 NC16A特异性B细胞结合，同时利用IgG分子的Fc段诱导CDC和ADCC效应，靶向性杀伤病 理性B细胞。
[0034] 二、重组细胞的获得
[0035] 设置5个重复处理，分别进行如下操作：
[0036] 1、转染前24h，通过胰酶消化收集HEK293T细胞，将6X105个细胞平铺于IOcm细 胞培养皿，加入10ml DMEM完全培养基，于37°C含5%C02的温箱中过夜培养，转染前2小时 换液(即更换培养基为5ml DMEM不完全培养基)。
[0037] 2、取 8 ii g 重组质粒 pFUSE-hIgGle4-Fc2-Coll7,与 0? 5ml DMEM 不完全培养基混 合。
[0038] 3、取20ii I Lipofectamine2000,与0? 5ml DMEM不完全培养基混合，室温孵育5 分钟。
[0039] 4、将步骤2得到的液体和步骤3得到的液相体系混合，室温孵育20分钟。
[0040] 5、将步骤4得到的液相体系加入步骤1的细胞培养皿中，于37°C含5%C02的温箱 中孵育6小时，弃上清，加入DMEM完全培养基并于37°C含5%C0 2的温箱中培养24小时。
[0041] 6、收集步骤5得到的细胞，用胰酶消化后在含有600 ii g/ml博来霉素的DMEM完全 培养基培养，每2天更换新的含有600 ii g/ml博来霉素的DMEM完全培养基，于37°C含5%C02 温箱中培养14天。
[0042] 7、收集步骤6得到的细胞，用胰酶消化后在含有400 ii g/ml博来霉素的DMEM完全 培养基中于37°C含5%C02的温箱中培养(之后的细胞传代均按照本步骤的方法进行)，细胞 长满后更换为DMEM不完全培养基并在相同条件下培养两天，收集上清液。
[0043] 三、Coll7_IgGlFc融合蛋白鉴定
[0044] 1、取步骤二的7得到的上清液，12000rpm离心IOmin,取上清。
[0045] 2、取20ml步骤1得到的上清，加入50kD超滤离心管中，4°C、4000g离心15min，得 至IJ ImL蛋白浓缩液，用NAN0DR0P2000C分光光度仪测定蛋白浓缩液中的总蛋白浓度。
[0046] 第一个重复处理得到的蛋白浓缩液中的总蛋白浓度为0? 8mg/ml。
[0047] 第二个重复处理得到的蛋白浓缩液中的总蛋白浓度为0. 42mg/ml。
[0048] 第三个重复处理得到的蛋白浓缩液中的总蛋白浓度为0? 35mg/ml。
[0049] 第四个重复处理得到的蛋白浓缩液中的总蛋白浓度为0? 26mg/ml。
[0050] 第五个重复处理得到的蛋白浓缩液中的总蛋白浓度为〇? 37mg/ml。
[0051] 第一个重复处理得到的上清液中含有的蛋白量最高。
[0052] 3、将步骤2得到的蛋白浓缩液进行SDS-PAGE电泳，电泳图见图2 (泳道1和泳道 2代表第一个重组处理得到的蛋白浓缩液，泳道3代表第二个重复处理得到的蛋白浓缩液， 泳道4代表第五个重复处理得到的浓缩蛋白液，泳道5代表第三个重复处理得到的浓缩蛋 白液)，均显示70kD左右明显条带，第一个重复处理得到的蛋白浓缩液中的蛋白浓度显著高 于其他四个重复处理得到的蛋白浓缩液。
[0053] 4、将第一个重复处理步骤2得到的蛋白浓缩液进行western blot，结果见图3。一 抗为用含5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液稀释的抗BP患者活动期血清（1:10稀释，活动期标准 为ELISA法测得抗C0L17NC16A抗体水平大于150U/mL)，二抗为辣根过氧化酶标记的山羊抗 人IgG (H+L)抗体时的结果见图3的泳道1。一抗为山羊抗人IgG (H+L)抗体，二抗为辣根 过氧化酶标记的兔抗山羊IgG抗体时的结果见图3的泳道2。一抗为辣根过氧化酶标记的 山羊抗人IgG (H+L)抗体，不加入二抗时的结果见图3的泳道3。以抗C0L17NC16A抗体阳 性的血清作为一抗，HRP标记的山羊抗人IgG (H+L)抗体为二抗，在70kDa左右显示清晰条 带。以山羊抗人IgG (H+L)抗体为一抗孵育，以HRP标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗孵育， 在70kDa左右显示清晰条带。直接以HRP标记的山羊抗人IgG (H+L)抗体孵育，未见条带。
[0054] 5、回收步骤3中70kD左右的条带，送至北京华大蛋白质研发中心，利用 MALDI-TOF/TOF质谱方法对蛋白进行质谱检测，质谱数据与C〇117-IgGlFc融合蛋白的理论 值进行比对，Mascot评分为22分（阈值为13分)，说明氨基酸序列重合度具有显著性。
[0055] 6、回收步骤3中70kD左右的条带，进行测序，N端15个氨基酸残基与 C〇117-IgGlFc融合蛋白N端15个氨基酸残基一致。
[0056] 四、细胞系的稳定性鉴定
[0057] 将第一个重复处理中，步骤一的6得到的细胞作为PO代细胞，将PO代细胞按步骤 一的7的方法连续传代5次，依次命名为Pl代细胞、P2代细胞、P3代细胞、P4代细胞和P5 代细胞。将Pl代细胞至P5代细胞分别按步骤一的7的方法得到上清液，然后进行步骤二 的1和2,蛋白浓缩液中的总蛋白浓度依次0? 78mg/ml、0. 81mg/ml、0. 80mg/ml、0. 81mg/ml、 0? 81mg/ml〇
[0058] 五、细胞系的保藏
[0059] 将第一个重复处理中，步骤一的6得到的细胞株命名为C0L17NC16A_IgGlFc质粒 稳定转染的293T细胞系BPKU，简称细胞系BPKU，已于2013年06月25日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号)，其保藏编号为CGMCC No. 7801。
[0060] 实施例2、外周血B细胞的分离及鉴定
[0061] 一、外周血B细胞的分离
[0062] 分别从3位知情同意的活动期BP患者(采集全血前未进行激素或免疫抑制剂等任 何治疗，无免疫缺陷相关疾病病史）和3位知情同意的健康志愿者外周血中分离B细胞，方 法如下：
[0063] 1、用肝素抗凝管采集全血，以D-Hank' s液等体积稀释。
[0064] 2、于50ml离心管中加入15ml Ficoll-Paque (美国GE公司生产的人淋巴细胞分 离液)，然后在液面处徐徐加入30ml步骤1得到的稀释液，然后18°C、400g离心30min，此时 细胞分层。
[0065] 3、吸取离心管中的血浆层（即最上层)，即为实验用血清；轻轻吸取离心管中的白 膜层（即自上向下数第二层)，移入另一离心管，加入适量PBS缓冲液洗涤，然后2000rpm离 心IOmin,收集细胞沉淀。
[0066] 4、向步骤3得到的细胞沉淀中加入ImllX红细胞裂解液，轻柔吹打，室温放置 IOmin,然后2000rpm离心IOmin,收集细胞沉淀。
[0067] 5、用适量PBS缓冲液重悬步骤4得到的细胞沉淀，用血细胞计数板计数，即为PBMC 总数。
[0068] 6、将步骤5得到的细胞悬液2000rpm离心10min，收集细胞沉淀，按照每IO7个细 胞对应80 ill磁珠分选缓冲液和20 ill⑶19磁珠的比例加入磁珠分选缓冲液和⑶19磁珠， 充分混匀后4°C孵育15min，然后按照每IO7个细胞对应2ml磁珠分选缓冲液的比例加入磁 珠分选缓冲液以进行洗涤，然后300g离心10min，收集细胞沉淀，以500ul磁珠分选缓冲液 重悬。
[0069] 7、将步骤6得到的细胞悬液上样于LS型细胞分选柱，加入9ml磁珠分选缓冲液， 保存流出液(流出液中含有总PBMC中B细胞以外的细胞，将总PBMC中B细胞以外的细胞命 名为分选阴性细胞，将该流出液命名为分选阴性细胞液)并行细胞计数，然后在LS型细胞分 选柱中加入5ml磁珠分选缓冲液，保留连同磁珠在内的悬液(悬液中含有B细胞，将其命名 为分选阳性细胞液)。
[0070] 二、外周血B细胞的鉴定
[0071] 1、取步骤一得到的分选阳性细胞液，用PBS缓冲液调至为2X IO5个细胞/ml。
[0072] 2、在Iml步骤2得到的细胞悬液中加入2 ill⑶19-PE，充分震荡后避光冰上孵育 30min，加入2ml预冷的PBS缓冲液洗漆，4°C、250g离心5min，收集细胞沉淀，加入0. 5mll% 多聚甲醛水溶液，利用流式细胞仪测定CD19阳性细胞(即B细胞）的比例。
[0073] 第一位BP患者的分选阳性细胞液的流式细胞仪测定结果见图4, CD19阳性细胞的 纯度达到92. 58%。从第一位BP患者30ml外周血中分离得到B细胞8 X IO5个，分选阴性细 胞3 X IO7个。从第二位BP患者30ml外周血中分离得到B细胞11 X IO5个，分选阴性细胞 7. 6X IO7个。从第三位BP患者30ml外周血中分离得到B细胞14X IO5个，分选阴性细胞 9. IX IO7个。从第一位健康志愿者30ml外周血中分离得到B细胞10 X IO5个，分选阴性细 胞6X IO7个。从第二位健康志愿者30ml外周血中分离得到B细胞12X IO5个，分选阴性细 胞.3X IO7个。从第三位健康志愿者30ml外周血中分离得到B细胞IOX IO5个，分选阴性 细胞5X107个。
[0074] 实施例3、C〇117-IgGlFc融合蛋白的体外功能测定
[0075] -、荧光蛋白的标记功能测定
[0076] 采用APEX Antibody Labling Kit并按说明书将实施例1的第一个重复处理的步 骤三的2得到的蛋白浓缩液进行标记，得到荧光标记蛋白液甲（即将C〇117-IgGlFc融合蛋 白标记上488nm荧光染料)。
[0077] 采用APEX Antibody Labling Kit并按说明书将利妥昔单抗进行标记，得到突光 标记蛋白液乙（即将利妥昔单抗标记上488nm突光染料)。
[0078] 按照表1进行加样，用DMEM完全培养基调整浓度，保证相应培养皿中各成分的终 浓度一致。加入实施例2制备得到的分选阳性细胞液(又称B细胞细胞液）时，其在培养体 系中的浓度为4X IO5个细胞/ml。加入实施例2制备得到的分选阴性细胞时，其在培养体 系中的浓度为2X IO6个细胞/ml。加入实施例2制备得到的实验用血清时，其在培养体系 中的浓度为50% (体积比)。加入荧光标记蛋白液甲时，总蛋白的浓度为4iig/ml。加入荧 光标记蛋白液乙时，总蛋白的浓度为4 ii g/ml。利用共聚焦显微镜系统，在37°C、5%C02培养 条件下动态观察细胞荧光及形态变化。持续观察至24小时。
[0079] 表1对于第一位BP患者和第一位健康志愿者来说各个培养体系的组成
【权利要求】
1. C0L17NC16A-IgGlFc质粒稳定转染的293T细胞系BPKU，其保藏编号为CGMCC No.7801。
2. 权利要求1所述细胞系在制备C〇117-IgGlFc融合蛋白中的应用；所述 C〇117-IgGlFc融合蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3. -种制备C〇117-IgGlFc融合蛋白的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述细胞 系并收集培养上清，即为含有所述C 〇117-IgGlFc融合蛋白的溶液；所述C〇117-IgGlFc融合 蛋白为由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
4. 权利要求1所述细胞系在制备用于治疗大疱性类天疱疮的药物中的应用。
5. -种用于治疗大疱性类天疱疮的药物，其活性成分为权利要求3所述方法制备得到 的C〇117-IgGlFc融合蛋白。 6. C〇117-IgGlFc融合蛋白在制备用于治疗大疱性类天疱疮的药物中的应用；所述 C〇117-IgGlFc融合蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
7. -种用于治疗大疱性类天疱疮的药物，其活性成分为C〇117-IgGlFc融合蛋白；所述 C〇117-IgGlFc融合蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 8. C〇117-IgGlFc融合蛋白，为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
9. 编码权利要求8所述C〇117-IgGlFc融合蛋白的基因。
10. 如权利要求9所述的基因，其特征在于：所述基因如序列表的序列2所示。
【文档编号】A61K38/16GK104293735SQ201310303122
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】王明悦, 彭洋, 王佩茹, 陈天成, 陈喜雪, 朱学骏 申请人:北京大学第一医院