一种生产重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白的技术的制作方法

一种生产重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白的技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程酶【技术领域】，提供一种重组尿酸氧化酶与牛乳铁蛋白肽融合蛋白的技术，含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明所述重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白生产技术可以在大肠杆菌中发酵生产胞内可溶性尿酸氧化酶融合蛋白。制得的融合蛋白可在体外快速催化尿酸转化为尿囊素。本发明所述尿酸氧化酶生产技术，操作简便，产物生物活性良好，易于推广，具有广阔的实验检测和临床应用前景。
【专利说明】一种生产重组狒狒尿酸氧化酶融合蛋白的技术

【技术领域】
[0001] 本发明基因工程酶【技术领域】，具体涉及狒狒尿酸氧化酶基因及牛乳铁蛋白肽基因 的克隆表达方法，本发明还涉及该两种蛋白组成的融合蛋白的分离纯化方法。

【背景技术】
[0002] 尿酸氧化酶是生物体内嘌呤代谢途径中的一个酶，以氧作为受体，能够催化尿酸 氧化生成尿囊素和过氧化氢（Richette等Lancet2010, 318-328)。尿酸氧化酶在生物界广 泛存在。从古细菌、细菌、真菌、酵母、放线菌、植物、鱼类、两栖动物和大多数非灵长目哺乳 动物及少数灵长目动物体内均能找到尿酸氧化酶。但是在人类和高等灵长目动物，由于尿 酸氧化酶基因在进化过程中发生无义突变，致使这些物种，如猿类体内没有尿酸氧化酶存 在（Wu等，PNAS1989, 9412-9416)。由于缺少尿酸氧化酶，嘌呤代谢产生的尿酸不能被进 一步氧化而最终以尿酸的形式通过肾脏排出体外，导致人体内尿酸的浓度明显比其他动物 高。高浓度的尿酸存会给人体带来许多严重的疾病，如高尿酸血症，痛风，肿瘤溶解综合症 等。
[0003] 尿酸氧化酶被发现和应用于医疗始于1974年（Fam等，Currentrheumatology rep〇rts2005, 29-35)。当时使用的是从黄曲霉中提取得到的尿酸氧化酶。之后各种来源的 尿酸氧化酶陆续被发现并被用于研究。但是由于纯度不高，难于控制，在使用中产生各种各 样的副作用。八十年代，随着基因工程技术的兴起，重组表达尿酸氧化酶逐渐成为获取尿 酸氧化酶的主要途径。现今已有多个物种的重组尿酸氧化酶表达成功。Suzuki等（Suzuki 等，PlantPhysiologyl990, 384-389)于1990年成功地将大豆尿酸氧化酶基因克隆到大 肠杆菌表达。1996年，Candidautilis尿酸氧化酶在大肠杆菌中成功表达（Koyama等，J. Biochem. 1996, 969-973)oLegoux等（Legoux等，JBC1992, 8565-8570)通过将黄曲霉尿酸氧 化酶基因克隆到大肠杆菌中，发现尿酸氧化酶在细胞内以可溶性表达形式存在。Ishikawa 等（Hongoh等，InsectBiochemistryandMolecularBiology2000, 173-182)成功地将 Nilaparvatalugens尿酸氧化酶基因克隆在大肠杆菌中表达，但是表达量并未提供。
[0004] 重组尿酸氧化酶在临床上的应用则始于1995年，Rozenberg等首次利用 重组尿酸氧化酶用于心脏移植病人的痛风石治疗（Rozenberg等，Rev.Rhum.Engl. Ed. ,1995, 62(5)，392-394)，证明了重组尿酸氧化酶在医疗上的巨大前景。2001年，由 Sanofi-Synth6labo公司研发的重组黄曲霉尿酸氧化酶注射剂在欧洲成功上市，并于2003 年获准在美国上市，用于高尿酸血症的预防和治疗(肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防)。
[0005] 乳铁蛋白肽（lactoferrcin,Lfcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶水解， 从N端释放的一段多肽。分子内富含色氨酸。有关研究发现，Lfcin除了不能结合铁离子 夕卜，具备乳铁蛋白的所有生物学活性，如抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫 反应等。由于Lfcin具有普通抗生素所不具有的一系列优点，包括广谱抗菌能力和不易产 生耐药性的特点、能抑制病毒、真菌增殖和抑杀肿瘤细胞、对真核生物细胞几乎没有毒性， 再加上Lfcin不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，显示了Lfcin替代 抗生素的巨大潜能。因此，关于Lfcin的结构、功能、作用机制及基因工程已成为近年来研 究的热点[25]。
[0006] 不同来源的乳铁蛋白在动物消化道中都能释放出Lfcin。不同种类的Lfcin氨基 酸长度有所不同，但其序列具有高度同源性，总体来说均包含17-42这段小肽。
[0007] 牛乳铁蛋白肽（bovinelactoferrcin,LfcinB)是牛乳铁蛋白在胃蛋白酶水解作 用下释放出的一种含25个氨基酸残基的短肽。其分子结构如图1-5所示。其中LfcinB2Q_25 是LfcinB的活性中心。由于分子内富含大量的碱性氨基酸，其pi值大于12。在pH7时，其分 子净电荷数大于7,因而具有较强的阳离子特征，水溶性好，在水溶液中呈现反平行折 叠结构。LfcinB分子中的第6位和第8位色氨酸对其杀菌活性至关重要。此外，由于分子 中有两个半胱氨酸形成二硫键，LfcinB具有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。
[0008] 不同动物的Lfcin，例如在人源、鼠源、牛源和羊源的乳铁蛋白肽中，牛乳铁蛋白肽 活性是最高的，这也是人们将研究重点移至LfcinB的原因。


【发明内容】

[0009] 本发明通过重叠延伸法获得了狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的全序列，并对该融 合蛋白在大肠杆菌中进行发酵生产。然后利用金属螯合层析分离纯化目的蛋白。经过质谱 鉴定和酶活测定后，结果显示融合蛋白成功表达，获得的重组蛋白一级结构与设计的序列 一致。酶活力达到8. 10U/mg。融合蛋白产率达到84. 66%。显示了本发明所采用的技术具 有良好的可行性。
[0010] 尿酸是一种弱酸，pKa值为5. 75。在生理pH7. 4条件下，98%的尿酸以尿酸盐的形 式存在[14]。尿酸盐在血液中的溶解度仅为380iimol/L。当人体内尿酸盐浓度超过此值时， 尿酸盐将以晶体的形式析出，并随着血液循环而逐渐沉积在人体的关节处，由此而引发一 系列相关的疾病，如高尿酸血症、痛风等。
[0011] 痛风是一种古老的疾病。早在公元前2640年就有古埃及文献对于痛风的记载。确 切的临床记载则见于公元前400年Hippocratc的医学著作中。其病因便是由于尿酸沉积在 关节处形成所谓的痛风石而引发的一种急性关节炎。古代关于痛风患者的记载主要见于帝 王显贵，因而痛风又有帝王病之称。同时由于其发病时给病人带来巨大的痛苦又被称为疾 病之王。现今，痛风的发病率呈逐年上升的趋势，尤其以西方发达国家严重。据有关组织统 计，英国痛风的发病率1970年为0.3%，1990年为1%，到2005年，这一比例上升到了 1.4%。 美国痛风的发病率更高，1990年这一比例为2. 1%，到1999年已上升到4. 1%。随着经济快速 发展，人们生活水平和饮食习惯的改变，我国痛风的发病率也呈上升趋势，且发病年龄呈 现低龄化。目前我国痛风发病率为〇. 3%，现有400多万痛风患者，每年有200多万急性发 作，近100万人因痛风致残。因此痛风已成为严重影响人们身体健康的疾病之一。
[0012] 高尿酸血症是指血液中尿酸含量大于420i!mol/L(7. 0mg/dL)，高尿酸与糖尿病、 高血压、肥胖或高胆固醇血症等几乎所有的成人病都有密切的关系，也可能导致肾障碍、动 脉硬化、脑中风、心脏病等严重的疾病，因此是非常重大的代谢异常症状。
[0013]目前控制肿瘤高尿酸血症的办法有饮食控制、碱化酸毒症、血透、别嘌呤醇和尿酸 氧化酶利尿等手段。但是别嘌呤醇抑制黄嘌呤氧化酶的活性，阻滞了黄嘌呤和次黄嘌呤转 化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，增加了肾脏排泄尿酸前体(次黄嘌呤和黄嘌呤)的负荷， 影响肿瘤的治疗。与次黄嘌呤不同，黄嘌呤在尿中比尿酸难溶。有时别嘌呤醇治疗的病人也 可出现黄嘌呤肾病和结石。此外，对于病人体内存留的尿酸的排泄，使用别嘌醇治疗无效。 对于急性高尿酸血症病人，别嘌呤醇因为起效时间长而使病人不能及时得到治疗。
[0014] 对于痛风的治疗，目前主要使用痛风炎症干扰药物和降尿酸化学药，代表性药物 有秋水仙碱、非留体抗炎药、肾上腺皮质激素、尿酸促排药、抑制尿酸生成药。秋水仙碱具有 缓解痛风炎症的特异性，通常是小剂量多次口服用药，但该药有严重的胃肠道反应。其它抗 炎药也都起到改善症状的作用，但副作用都很大。丙磺舒、苯磺唑酮、痛风利仙是常用的促 尿酸排泄药物，别嘌呤醇抑制尿酸的形成，这些药都需要服用较长时间来维持治疗效果，它 们的副作用发生率相同，而以别嘌呤醇最严重，常发生别嘌呤过敏综合症，这些患者死亡率 达 27. 5%。
[0015] 鉴于化学药物在治疗尿酸引起的相关疾病中的种种副作用，人们开始寻找更好的 替代药物。尿酸氧化酶由于其能快速降解尿酸而受到人们的高度关注。通过补充尿酸氧化 酶将体内尿酸降解为尿囊素排出体外而降尿酸已成为治疗高尿酸血症及其相关疾病的又 一种策略。
[0016] 牛乳铁蛋白肽（LfcinB)作为一种小肽，分子量只有2. 86kDa，属于小分子活性物 质，因而不用考虑其对人体的免疫原性。其次，LfcinB本身分子结构较为简单，由26个氨 基酸组成，分子内只有一个二硫键。最近有研究报道二硫键在抗菌过程中作用不大，被破 坏后LfcinB的抗菌活性并不减弱[46]。因而不用考虑保持其二硫键完整性的问题。此外， LfcinB作为活性分子，具有多方面的优良特性，如分子具有两亲性、能耐受蛋白酶或多肽酶 的水解、广谱抗细菌真菌、抑制肿瘤细胞等。
[0017] 综合考虑上述，本发明选用了牛乳铁蛋白肽（LfcinB)作为目的蛋白的修饰分子。
[0018] 在本发明的【具体实施方式】中，首先通过密码子优化，设计了融合蛋白基因全序列， 然后通过重叠延伸的方法，获得全长基因。其次，利用TA克隆技术筛选阳性克隆。阳性克 隆在经过酶切后，与目的载体pET32a(+)连接。构建后的表达载体转化表达宿主菌E.coli OrigamiDE3.通过优化诱导条件，目的蛋白获得高效可溶性表达。经过细胞破碎，Ni+金属 螯合纯化得到纯度达93. 5%以上的目的蛋白，产量达到116. 6mg/L发酵液。经重组肠激酶 切后，经过酶活测定，目的蛋白活力达8. 10U/mg，融合蛋白收率达到84. 66%。
[0019] 附图表说明
[0020] 图1狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的克隆。1-2 :目的片段（1016bp) ;L:DNA ladder
[0021] 图2融合蛋白基因设计及表达载体的构建。
[0022] 图3融合蛋白诱导表达。M:蛋白质分子量标准1 :诱导前的全菌液；2 :诱导8小时 之后的全菌液；
[0023]图 4Ni+_NTAHis-BindResins分离纯化rbUOX-LfcinB。1:洗脱峰；M:蛋白质分 子量标准
[0024]图 5 肽段K.LGAPSITCVR.R质谱图
[0025] 表1目的蛋白表达量及收率测定。
[0026] 表2目的蛋白酶活测定。
[0027]表 3 目的蛋白MALDI-T0F-MS/MS测定。

【具体实施方式】
[0028] 实施例1狒狒尿酸氧化酶融合蛋白基因的克隆。
[0029] 狒狒主要分布于非洲，个别种类也见于阿拉伯半岛，在我国野外没有分布，仅见于 相关动物园里，因此其基因样本较难获得。要获得其尿酸氧化酶基因并进行相应的改造只 有通过全基因合成的办法。目前全基因合成主要有两种途径：磷酸化补齐和重叠延伸PCR 法（splicingbyoverlapextension,SOE)。S0E因其操作简便快速而成为现今基因全合 成的首选，尤其是对于没有基因样本且序列较长的基因克隆。因此本发明采用S0E的方法 来获得rbUOX基因全序列。
[0030] 狒狒尿酸氧化酶融合蛋白（rbUOX-LfcinB)基因全长为1016bp。先通过S0E获得 rbUOXgene43-603和rbUOXgene625-897两个片段。在此基础上再加上其余序列。最后在 基因的两端加上酶切位点BglII和EcoRI。

【权利要求】
1. 一种生产尿酸氧化酶融合蛋白的技术，其特征在于，是通过基因克隆表达获得。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，含有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序 列。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包含狒狒尿酸氧化酶和牛乳铁蛋白 肽氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是通过重叠延伸法获得其基因全序 列。
5. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是利用pET32a(+)作为表达载体。
6. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是在大肠杆菌Origami (DE3)中表达。
7. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是在25°C诱导表达。
8. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，是通过Ni+金属螯合层析纯化得到。
9. 权利要求1至8任一项所述的生产技术在制备狒狒尿酸氧化酶融合蛋白中的应用。
10. 权利要求1至8任一项所述的融合蛋白在临床诊断，治疗中的应用。
【文档编号】A61P19/06GK104342413SQ201310335372
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】陈劲春, 熊润松 申请人:北京化工大学