一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法。本发明人通过改进构建方法，构建了一种基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组的疫苗载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的疫苗。
【专利说明】一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]腺病毒(Adenovirus)是一种无包膜、线性化的双链DNA病毒，能够高效感染各种哺乳动物细胞且易于扩增及纯化，被作为基因载体工具广泛用于分子和细胞生物学研究。腺病毒能在体内有效地诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应，被认为是目前最有应用前景的疫苗载体之一，包括用于研发HPV、HIV，乙肝、丙肝、流感、疟疾、狂犬病等疾病的疫苗。传统的腺病毒载体主要是基于人血清型AdHu2和AdHu5，其中AdHu5曾一度被应用于临床基因治疗。然而据血清型调查表明人群中约40-60%的个体中含有抗人血清型腺病毒的中和抗体，导致基于人血清型腺病毒载体的免疫效果受到体内预存的中和抗体很大程度的影口向(Singh, N.等，Molecular therapy: the journal of the American Society of GeneTherapyl6,965-971, do1: 10.1038/mt.2008.12(2008) ；Sprangers, M.C.等，Journal ofclinical microbiology41,5046-5052(2003))。
[0003]目前腺病毒载体的构建策略一般采用同源重组的方法，包括:(1)细胞内同源重组，此方法缺点是易受到亲代腺病毒的污染，必须经过2-3次的病毒空斑纯化，并通过多次的噬斑形成方法鉴定重组病毒；另外重组效率低下，产生重组的时间至少需要两周以上。
(2)位点特异性重组，缺点是同样易受亲代病毒的污染，需要经过多次病毒空斑纯化，由于引入了 Cre/loxp重组系统，会增加腺病毒发生遗传改变的几率，获得不稳定的腺病毒子代。(3)细菌内同源重组(如AdEasy? System)，其缺点是筛选阳性克隆比较繁琐，同时由于引入同源重组方法，腺病毒基因组在大肠杆菌中易发生突变。
[0004]因此，本领域技术人员还需要开发新的构建腺病毒载体的方法，以及开发免疫效果理想的腺病毒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法。
[0006]在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括:将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El的大部份编码序列；所述的连接序列中，设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce
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[0007]在一个优选例中，所述的4个片段分别是:
[0008]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第1-6025位；
[0009]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第6026-17279位；
[0010]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和
[0011]黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。[0012]在另一优选例中，各片段的氨基酸位点计算基于GenBank登录号AC_000011的核苷酸序列。
[0013]在另一优选例中，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点切除腺病毒El的大部份编码序列，大小约为3.5kb，将其替换为含有内切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。
[0014]在另一优选例中，所述的骨架载体是pNEB193载体。
[0015]在另一优选例中，所述的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El的大部份编码序列由连接序列(Linker)替换；所述的连接序列中设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
[0017]在另一优选例中，所述的连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0018]在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0019]在另一优选例中，所述表达载体的酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。
[0020]在另一优选例中，所述的外源的抗原是(但不限于)肠道病毒EV71的VPl抗原。
[0021]在另一优选例中，所述的VPl抗原的编码基因的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0022]在本发明的另一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括:
[0023](I)提供所述的腺病毒表达载体；
[0024](2)将外源的抗原编码基因插入到(I)表达载体的酶切位点1-Ceu I和P1-SceI之间；
[0025](3)将(2)的重组表达载体感染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。
[0026]在本发明的另一方面，提供一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括:前面任一所述的腺病毒表达载体。
[0027]在另一优选例中，所述试剂盒还包括:病毒生产细胞；和/或抗原编码基因。
[0028]在另一优选例中，所述的病毒生产细胞是HEK293细胞。
[0029]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1、野生型腺病毒AdC68基因组的酶切鉴定结果。
[0031]M =DNA分子量标准;1、2:Bgl II和Mfe I酶切鉴定。
[0032]图2、复制缺陷型腺病毒载体AdC68的构建及鉴定。
[0033]A、基于腺病毒AdC68基因组酶切位点分析的结果，将其分成KE，AK, XA和PX四个片段，在其末端分别添加Pac I酶切位点便于线性化。
[0034]B、构建复制缺陷型腺病毒AdC68的策略示意图:先将KE，AK，XA组装入pNEB193载体；将另一部分的PX组装入另一个PNEB193载体，其中在PX部位删除腺病毒El部分区域并连入含有1-Ceu I和P1-Sce I归位内切酶的Linker ;最后组装成完整的El部分删除的复制缺陷型腺病毒AdC68。
[0035]C、复制缺陷型腺病毒AdC68的酶切鉴定结果。M:DNA分子量标准；l_4:Xho I，Bgl II，Mfe I和Xma I分别酶切鉴定结果。
[0036]图3、含有报告基因的重组载体pAdC68-El-deleted+EGFP(即pNEB193+El-deleted AdC68_EGFP)构建及鉴定结果。
[0037]A、报告基因CMV-EGFP克隆入pAdC68-El_deleted载体示意图。
[0038]B、质粒 pAdC68-El-deleted+EGFP 的酶切鉴定结果。M =DNA 分子量标准；1_4 =XhoI，Bgl II，Mfe I和Xma I分别酶切鉴定结果。
[0039]图4、转染含有报告基因的重组载体pAdC68-El-deleted+EGFP的荧光表达情况(100X)。
[0040]图5、第 12 代重组腺病毒 AdC68-El-deleted 和 AdC68-El-deleted+EGFP 基因组的鉴定。
[0041]A、重组腺病毒AdC68-El_deleted基因组的酶切鉴定结果；M:DNA分子量标准；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分别酶切鉴定结果。
[0042]B、重组腺病毒AdC68-El_deleted+EGFP基因组的酶切鉴定结果；M:DNA分子量标准；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分别酶切鉴定结果。
[0043]图6、重组腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的酶切鉴定。
[0044]A、重组腺病毒AdC68-El_deleted+VPl质粒的酶切鉴定结果；M:DNA相对分子质量标准；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分别酶切鉴定结果。
[0045]B、重组腺病毒AdC68-El_deleted+VPl基因组的酶切鉴定结果；M:DNA相对分子质量标准；1_3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分别酶切鉴定结果。
[0046]图7、重组腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的VPl蛋白表达及抗体反应。
[0047]A、ffestern-blot 检测 VPl 基因的表达。1:阴性对照(AdC68_empty,即AdC68-El-deleted) ;2_5:分别为 108vp、109vp、IOicVp 和 10nvpAdC68-El-deleted+VPl ；6:阳性对照，EV71灭活病毒。
[0048]B、ELISA检测AdC68-El_deleted+VPl诱导的特异性抗体。图示各样本血清稀释度为1:80的OD值。
【具体实施方式】
[0049]本发明人经过深入的研究，通过改进构建方法，构建了一种基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组的疫苗载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0050]为解决现有技术的问题，本发明人选择稀有血清型或其他种属来源的腺病毒作为疫苗载体，由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果将显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。
[0051] 因此，本发明提供了一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点 1-Ceu I 和 P1-Sce I。
[0052]针对腺病毒AdC68基因组，本发明人经过细致的序列比对，最终确定了应用酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I作为外源基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。[0053]由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，使直接克隆重组腺病毒载体成为技术瓶颈。因此，本发明人开发了能通过酶切连接的快速方法直接构建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作为疫苗载体，即充分利用腺病毒基因组中存在的某些酶切位点。根据对腺病毒AdC68整个基因组序列的分析，将其分成KE，AK，XA和PX四个片段，然后通过酶切连接的方法再逐步克隆到PNEB193的载体中，最终获得一个复制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I两个酶切位点删除了与腺病毒复制相关的El部分，大小约为3.5kb，将其替换为含有归位内切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。此方法构建的复制缺陷型腺病毒AdC68经过线性化能够在HEK293细胞中成功包装并扩增出遗传稳定的重组腺病毒。
[0054]KE, AK, XA和PX四个片段之间可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。
[0055]所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0056]本发明还提供了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括:将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El编码序列；所述的 连接序列中，设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
[0057]获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID5tl)的测定可以根据本领域常规方法进行。
[0058]本发明的腺病毒表达载体作为一个表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。所述的抗原没有特别的限制。
[0059]作为本发明的优选方式，本发明人通过利用腺病毒基因组直接克隆方法构建成复制缺陷型腺病毒AdC68载体后，将肠道病毒EV71的VPl基因克隆至AdC68载体，免疫小鼠后该重组载体AdC68-VPl能诱导特异性免疫反应，证明本发明人成功获得一种基于黑猩猩型腺病毒AdC68的新型疫苗载体，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。
[0060]本发明避开了传统的通过同源重组方法构建腺病毒载体，极大程度上降低了腺病毒发生突变的可能，遗传稳定性好，通过引入Stbl2大肠杆菌转化体系，使得腺病毒发生突变的概率进一步降低。因此，利用本发明获得的腺病毒载体表达外源基因将更稳定、高效。本发明利用体外直接酶切连接方法构建腺病毒载体，在细菌水平筛选获得阳性克隆更容易、更便捷，极大地缩短了腺病毒载体的构建时间。此外，本发明适用于所有腺病毒载体的构建，仅仅需要对腺病毒基因组酶切位点进行分析并加以合理应用即可，能被普遍推广应用于所有生物医学实验室，还能对腺病毒内部序列进行优化改造，构建各自特异性的腺病毒载体。综上所述，本发明不仅提供了一种新型表达载体，而且对腺病毒载体的构建提供了一种新的优异方法，将更好地促进腺病毒在生物医学基础研究领域和临床应用开发方面发挥其优异特征，为保障人类健康、提高生活质量奠定基础。[0061]基于本发明的新改进，本发明还提供了一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括所述的腺病毒表达载体。
[0062]所述的试剂盒还可包括病毒生产细胞，所欲表达的抗原的编码基因。此外，所述的试剂盒中还可包括说明疫苗制备方法的使用说明书。
[0063]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0064]1.材料
[0065]1.1动物、病毒株和细胞 [0066]雌性BALB/C小鼠(6_8周)购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；野生型腺病毒 AdC68 (GenBank 登录号 AC_000011)购于 ATCC(American Type Culture Collection,Manassas, VA) ;HEK293细胞株购自中国科学院上海生物化学和细胞生物研究所，培养液为有10%(v/v)胎牛血清DMEM。
[0067]1.2限制性内切酶、菌种与质粒
[0068]所有限制性内切酶以及pNEB193质粒购自New England Biolabs ；DH5 α和Stbl2菌种购自Invitrogen。
[0069]质粒pShuttle-CMV 购自 Clontech Laboratories, Inc。
[0070]质粒pShuttle-CMV-EGFP构建:EGFP序列(SEQ ID NO: 3)获自南京金斯瑞公司，并由该公司克隆至PUC57载体，获pUC57-EGFP。本发明人将pUC57_EGFP中EGFP克隆至pShutt Ie-CMV 载体，获 pShutt I e-CMV-EGFP。
[0071]pUC57-VPl (optimized):优化的VPl序列(SEQ ID NO:4)由南京金斯瑞公司合成，并克隆至PUC57载体，获pUC57-VPl。
[0072]2.方法
[0073]2.1扩增病毒和分离病毒基因组
[0074]在一个T175cm培养瓶中培养80-90%密度的HEK293细胞，应用野生型腺病毒AdC68感染细胞，感染24h后收集细胞，在室温与_80°C超低温之间反复冻融3次，3500rpm/min低温离心10min取上清，再次感染20个T175cm培养瓶中长至80-90%的HEK293细胞。待HEK293细胞被病毒完全裂解后收集细胞，同样反复冻融3次，然后用标准的氯化铯梯度沉降的方法纯化腺病毒AdC68。
[0075]根据DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA)试剂盒标准的说明步骤分离纯化腺病毒AdC68的基因组，并酶切鉴定。
[0076]2.2复制缺陷型腺病毒AdC68载体的构建
[0077]2.2.1 质粒 pNEB193+KE 的构建
[0078]根据pNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒AdC68基因组的序列，设计扩增KE片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物KE片段。PCR扩增体系总体积为50uL，反应循环参数为:95°C预变性 5min ;94°C变性 Imin ;退火温度 57°C 30s ;72°C延伸 2.2min。EcoR I 和 KpnI双酶切PCR扩增的KE片段，琼脂糖凝胶纯化KE片段，连接至经相同酶切的PNEB193载体，转化入DH5 α感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切和测序鉴定得到ρΝΕΒ193+ΚΕ。[0079]表1、PCR引物序列
[0080]
【权利要求】
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括:将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中El的大部份编码序列；所述的连接序列中，设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4个片段分别是: 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第1-6025位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第6026-17279位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和 黑猩猩型腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的连接序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.一种腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，El的大部份编码序列由连接序列替换； 所述的连接序列中设置酶切位点1-Ceu I和P1-Sce I。
5.如权利要求4所述 的腺病毒表达载体，其特征在于，所述的连接序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
6.如权利要求5所述的腺病毒表达载体,其特征在于，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的酶切位点1-CeuI和P1-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。
8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述的外源的抗原是肠道病毒EV71的VPl抗原。
9.一种制备疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供权利要求4所述的腺病毒表达载体； (2)将外源的抗原编码基因插入到(I)表达载体的酶切位点1-CeuI和P1-SceI之间； (3)将(2)的重组表达载体感染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。
10.一种用于制备疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 权利要求4-8任一所述的腺病毒表达载体。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括: 病毒生产细胞；和/或 抗原编码基因。
【文档编号】A61P31/14GK103937835SQ201310362225
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】周东明, 杨勇, 丁妙 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所