毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽、含有其的表达载体、菌株及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽hepcidin基因序列，利用所述hepcidin基因或其片段构建了4种重组质粒pGAPZαA/pPICZαA-hep及pGAPZαA/pPICZαA-mhep，分别电转化到毕赤酵母GS115、KM71H宿主细胞中获得重组毕赤酵母菌株并对其进行培养表达，得到具有抗多种细菌活性的表达多肽。所述表达多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和部分鱼类致病菌(副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901)均具有较强的抑菌活性。
【专利说明】毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽、含有其的表达载体、菌株及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地，本发明涉及毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽hepcidin基因序列、含有它的表达载体、含有它的转化体以及由此表达的多肽。
【背景技术】
[0002]虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是一种鲑科冷水性鱼类,被誉为“水中人参”。它的肉味鲜美、营养丰富、蛋白质和脂肪含量高而胆固醇含量几乎为零，是联合国粮农组织向世界推广的优良四大淡水养殖品种之一。
[0003]随着我国水产养殖业的发展,高密度、集约化养殖引起了一系列的问题，如水环境的污染程度越来越严重，导致鱼类生活环境的恶化，使得鱼类发生各种疾病而大量死亡。目前我国虹鳟常见鱼病有:病毒性疾病、IPN、IHN、VHS ;细菌性疾病有疖疮病、弧菌病、鳃病、肾脏病、肠道疾病等；霉菌引起的鱼病主要是水霉病；寄生虫引起的疾病等。采用抗生素等化学药物治疗鱼病仍然是目前我国鱼病防治的重要手段，而抗生素的使用引发了耐药菌的产生、水产品中的药物残留及水体微生态系统破坏等一系列问题，因此，寻找抗生素的有效替代药物成为水产研究者的主攻目标之一。
[0004]抗菌肽(Antibacterial peptide),也称为肽类抗生素,是生物体抵御外源性病原体的防御反应中所产生的一类小分子多肽。抗菌肽分子量在2~7kDa范围内，由20~60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性、高效性及广谱抗菌活性等特点。抗菌肽作用于细菌细胞膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、杀灭细菌。由于细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的，因此，抗菌肽极大地降低了产生耐药性的可能。
[0005]2000年，Krause等人首先从人类(Homo sapiens)血液中分离纯化了一种多肽，称之为肝脏表达的抗菌多肽，Hepcidi`n (Krause A, Neitz S, Magert HJ, et al.LEAP-1,a novel highly disulfide-bonded human peptide， exhibits antimicrobialactivity [J].FEBS Lett，2000，480:147-150)。2002 年 Shike 等人首次在杂交斑纹鲈鱼鳃内分离得到鱼类H印cidin的成熟肽。
[0006]Hepcidin的成熟肽C端的8个半胱氨酸在不同动物中具有高度的保守性，不同鱼类Hepcidin前体肽C端含有保守的四个氨基酸Arg-His-Lys-Arg(R-H-K-R) (Ren HL, etal., Fish Shellfish Immunol，2006，21:221-227)。
[0007]目前，大部分Hepcidin体外表达采用的是原核表达系统大肠杆菌，但是，抗菌肽Hepcidin 对大肠杆菌也具有抑制作用(Lauth X, Babon JJ, Stannard JA, et al., J.Biol.Chem, 2005，280:9272-9282)，如果采用直接表达H印cidin成熟肽的方法，可能对大肠杆菌产生毒性，从而影响它的表达量，此外，大肠杆菌表达Hepcidin通常是包涵体的形式，产物纯化困难。另外，原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。也有利用哺乳动物细胞的真核表达系统来表达Hepcidin，但其价格昂贵，技术操作复杂，不利于推广应用。
[0008]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的单细胞真核生物，其特点包括:具有很强的醇氧化酶(Alcoholoxidase)基因AOXl基因启动子，可以严格调控异源蛋白的表达；具有完备的发酵方法，该酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；表达产物表达量较高，并且既可以在胞内积聚又可以分泌到细胞外，而其自身分泌的蛋白非常少，外源蛋白分离纯化简便；翻译后加工过程中的糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化，所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用。
[0009]典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含AOXl基因的启动子和转录终止子C AOXl和:V A0X1)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨酸脱氢酶(His4)基因选择标记及3' AOXl区。当整合型载体转化受体时，它的5' AOXl和3' AOXl能与染色体上的同源基因重组，使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5' AOXl启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。分泌表达载体主要有:PPIC9、pPIC9K、pHIL-SUpPICZ a A 及 pYAM75P 等。胞内表达载体主要有:pHIL_D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、pGAPZ、pGAPZ a (Invitrogen)及 pPIC3.5K 等。
[0010]毕赤酵母表达系统中的分泌性表达性载体含有信号肽序列，它们都属于穿梭质粒，外源基因插入质粒多克隆位点后，先在大肠杆菌中复制扩增，再导入宿主酵母菌细胞中，通过与酵母基因发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。在大肠杆菌中大量扩增后的质粒，用特定的限制性内切酶在表达载体的标记基因或者启动子区切割(转化时，载体DNA必须切成线状才能与染色体进行同源重组)，获得游离的末端。整合载体转化受体菌时，可以和染色体上的相应位点发生互换，将整个载体连同外源基因整合入酵母菌染色体。
[0011]根据利用甲醇的能力，将毕赤酵母宿主菌分为3种主要类型:①Mut+表型。多数菌株含有AOXl和Α0Χ2基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型(Mut+)，如GSl 15，Χ-33是目前最常用的宿主菌。②Muts表型。当AOXl被其它基因如酿酒酵母的ARG4基因取代时，则需依赖Α0Χ2，称为甲醇利用慢表型(Muts)，如ΚΜ71。③Mut—表型。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为甲醇利用负表型(Mut_)，如MC10023。。
[0012]2007年，张卉等人设计并合成了人的h印cidin基因序列，构建了分泌型的重组毕赤酵母表达载体pPICZ αΑ-h印，在毕赤酵母宿主菌GSl 15中诱导后的表达量达到100mg/L，对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性，但是对大肠杆菌没有明显的抑菌效果(张卉等，生物工程学报，2007，23:381-385)。
【发明内容】
[0013]本发明的一个方面在于提供一种毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽hepcidin基因序列，其如SEQ ID NO:1所示。
[0014]本发明的 一个方面在于提供一种毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽hepcidin基因序列，其如SEQ ID NO:2所示。
[0015]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pGAPZ a A_h印，其含有SEQ ID NO:1所示的序列，具有图5所示的图谱。
[0016]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pGAPZ a A_mh印，其含有SEQ ID NO:2所示的序列，具有图5所示的图谱。
[0017]根据本发明的一个实施方式，利用组成型酵母重组表达载体pGAPZ a A构建2种重组质粒 pGAPZ a A-hep/mhep。
[0018]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pPICZ αΑ-h印，其含有SEQ ID N0:1所示的序列，具有图6所示的图谱。
[0019]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pPICZ αΑ-mh印，其含有SEQ ID NO:2所示的序列，具有图6所示的图谱。
[0020]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株GS115/pGAPZ a A-hep/mhep,其含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。 [0021]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株KM71H/pPICZ a A-hep/mhep,含有SEQ ID NO:1含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。
[0022]本发明的又一方面在于提供一种制备重组毕赤酵母菌株的方法，包括:
[0023]将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的基因经过XhoI酶及XbaI酶双酶切，可操作地连接 pGAPZ a A 或 pPICZ a A 载体,得到质粒 pGAPZ a A-hep/mhep 或 pPICZ a A-hep/mhep ；
[0024]将质粒pGAPZ a A-hep/mhep 或 pPICZ a A-hep/mhep 转化到毕赤酵母 GSl 15 或KM71H 中，得到重组菌株 GS115/KM71H/pGAPZ a A/pPICZ a A_h印或 GS115/KM71H/pGAPZ a A/pPICZ αA-mhepο
[0025]根据本发明的一个实施方式，对本发明的重组菌株进行诱导表达的诱导时间为72h。
[0026]本发明的又一方面在于提供一种毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽hepcidin基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
[0027]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pGAPZ a A_hep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中中的应用。
[0028]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pGAPZ a A-mhep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中中的应用。
[0029]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pPICZ a A_hep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中中的应用。
[0030]本发明的又一方面在于提供一种表达载体pPICZ a A-mhep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中中的应用。
[0031]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株GS115/pGAPZ a A-hep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
[0032]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株GS115/pGAPZ a A-mhep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
[0033]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株KM71H/pGAPZ a A-hep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
[0034]本发明的又一方面在于提供一种重组毕赤酵母菌株KM7IH/pGAPZ a A-mhep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1示出虹鳟鱼h印cidin基因的序列分析图；
[0036]图2示出虹鳟鱼h印cidin优化前后在毕赤酵母中的偏爱性对比；
[0037]图3示出PCR扩增的反应条件；
[0038]图4示出PCR扩增目的基因的凝胶电泳图，其中Marker为IOObp DNA LadderMarker ；
[0039]图5示出重组质粒pGAPZ a `A-hep/mhep的构建过程示意图；
[0040]图6示出重组载体pPICZ a A-hep/mhep的构建过程示意图；
[0041]图7示出重组质粒电转化毕赤酵母过程示意图；
[0042]图8示出PCR凝胶电泳图；
[0043]图9示出蛋白电泳结果图；
[0044]图10示出4种表达多肽抑菌实验柱形图；
[0045]图11示出通过抑菌实验检测不同诱导时间对细菌的抑菌活性的结果；和
[0046]图12a和12b示出利用高效液相色谱测定的活性成分的结果。
【具体实施方式】
[0047]除非特殊说明，否则本发明所用的试剂耗材都是市售可得的。
[0048]实验仪器
[0049]
【权利要求】
1.一种毕赤酵母菌优化的虹鳟鱼抗菌肽h印Cidin基因及其片段，其如SEQ ID N0:1及SEQ ID NO:2 所示。
2.—种虹鳟鱼抗菌肽的表达载体，其含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列，所述表达载体为pGAPZ a A-hep,具有图5所示的图谱；或pGAPZ a A_mhep,具有图5所示的图谱；*pPICZa A-hep,具有图6所示的图谱；或pPICZ a A_mhep,具有图6所示的图谱。
3.一种重组毕赤酵母菌株，GS115/pGAPZ a A_h印或GS115/pGAPZ a Aih印，其含有SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。
4.一种重组毕赤酵母菌株，KM71H/pPICZ a A_h印或KM71H/pPICZ a Aih印，其含有SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。
5.一种制备重组毕赤酵母菌株的方法，包括: 将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的基因经过XhoI酶及XbaI酶双酶切，可操作地连接质粒 pGAPZ a A 或 pPICZ α Α,得到质粒 pGAPZ a A-hep/mhep 或 pPICZ a A-hep/mhep ； 将质粒 pGAPZ a A-hep/mhep 或 pPICZ a A-hep/mhep 转化到毕赤酵母 GS115 或 KM71H中，得到重组菌株 GS115/KM71H/pGAPZ a A/pPICZ α A-hep 或 GS115/KM71H/pGAPZ a A/pPICZ αA-mhep0
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转化为电转化。
7.根据权利要求5所述的方法，其中重组菌株进行诱导表达的诱导时间为72h。
8.权利要求1所述的基因或其片段在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
9.权利要求2 所述的表达载体 pGAPZ a A-hep> pGAPZ a A_mhep、pPICZ a A-hep 或pPICZ a A-mhep在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌X-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中中的应用。
10.权利要求3或4所述的重组毕赤酵母菌株GS115/pGAPZa A-hep, GSl 15/pGAPZ a A-mhep, KM71H/pGAPZ a A-hep 或 KM71H/pGAPZ a A-mhep 在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鱼类致病菌如副溶血弧菌1.2164、维氏气单胞菌乂-1-06909、嗜水气单胞菌HA-336、维氏气单胞菌CL0901活性中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK103667300SQ201310370580
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】罗琳, 姜娜, 马志宏, 李铁梁, 邢薇 申请人:北京市水产科学研究所