一种包载抗体的长循环脂质体、其制备方法以及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，涉及一种包载抗体的长循环脂质体及其制备方法和用途。本发明中包载抗体的长循环脂质体，由治疗性抗体和脂质体成分组成，以脂质体为载体，包含长循环辅料。脂质体是以磷脂、胆固醇和长循环脂质体辅料为材料制成。本发明的长循环脂质体能够长时间、稳定的释放抗体活性成分，使玻璃体腔内的药物存在时间较单纯注射抗体延长3倍，注射后能够长期有效的治疗眼内炎症，减轻视网膜的损伤。能减少给药次数，降低治疗的风险，提高对眼部疾病的疗效，同时减少全身不良反应，具有新的临床实用价值。
【专利说明】一种包载抗体的长循环脂质体、其制备方法以及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】。具体涉及一种包载抗体的长循环脂质体、制备方法以 及其应用。
【背景技术】
[0002] 自身免疫性眼科炎症性疾病由于其病因复杂、治疗效果不一、往往伴有副作用等 现状，是目前眼科疾病的难题之一。例如，葡萄膜视网膜炎就是一类复杂的自身免疫性眼科 炎症性疾病，它多发生于青壮年，常反复发作，易导致盲目，且多为不可治盲，因此在致盲眼 病中占有重要地位。葡萄膜视网膜炎的治疗一直是眼科的难题。研究表明，肿瘤坏死因子 a (TNF-a )是炎症级联反应中重要的促炎症细胞因子，在人体正常的免疫功能和多数自身 免疫性疾病的发病机制中发挥关键性作用。很多研究表明，TNF-a在强直性脊柱炎、类风 湿关节炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎等的发病机制中发挥重要的作用。在葡萄膜视网膜 炎的研究中发现，活化的炎症细胞分泌TNF-a，而TNF-a又促进炎症细胞进一步活化，力口 速趋化因子和粘附分子的合成，促进中性粒细胞在眼内聚集，T淋巴细胞增生活跃，从而引 起眼组织的免疫病理损伤。
[0003] TNF-a是炎症级联反应中处于中心位置的细胞因子，所以，中和TNF- a可以改善 机体的炎症状态，有效的治疗疾病。抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体（Infliximab单抗）是 一种新型的生物单抗制剂，其商品名为类克（Remicade)，是人/鼠嵌合的抗TNF-a IgGl K 同型链单克隆抗体（75%为人源化，25%为鼠源化），它与巨噬细胞和T细胞的细胞膜表面 TNF-a高亲和结合，通过经典的补体激活途径和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC 作用）导致细胞溶解，从而使TNF-a丧失生物活性。另外Infliximab还可以和可溶性的 TNF-a结合，从而抑制TNF-a与其受体的相互作用。目前Infliximab主要用在治疗类风 湿关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病以及自身免疫性葡萄膜视网膜炎等疾病，自2007年9月 上市以来，以其良好的临床疗效，成为各大医院治疗这类疾病的有效用药。
[0004] 在Infliximab显示良好治疗前景的同时，其不良反应也日益受到关注。在国外的 临床研究报告中，该药常见的副作用是呼吸困难、上下呼吸道感染，其次是皮肤及其附属器 的副作用。欧洲药物评估机构报告该药物主要的皮肤及附属器不良反应包括：皮疹、瘙痒、 荨麻疹、多汗、皮肤干燥、迟发过敏性反应性皮炎伴严重脱发等。
[0005] 鉴于Infliximab全身用药的不良反应常见，对于眼内炎症性病变，可以采用玻璃 体腔内注射的方法，既增加了眼内局部药物的浓度，同时又不会产生明显的全身副作用。研 究表明，玻璃体腔内注射Infliximab可以有效的治疗眼内炎症，且不会造成毒性反应。但 是，由于眼内的炎症往往是慢性反复发作的，一次性给药后，在短期内玻璃体的药物浓度就 会下降，不能长期控制炎症；而且，在眼内炎症的过程中，血-眼屏障被破坏，血液中的成分 进入眼内，炎症细胞及细胞因子聚集，加速药物的清除。因此，要长期有效的控制炎症，往往 需要重复注射。但是，反复进行玻璃体腔内注药会增加手术带来的风险和并发症。而且， 一次性给药会造成眼内的药物浓度的即刻增高，增加药物对眼内结构的副作用，影响疗效。 因此，有必要进行长效的新型制剂的研究，以延长有效成分在眼内的滞留时间，保持玻璃体 内相对稳定的药物浓度，提高治疗效果，降低副作用，同时减轻重复注射带来的风险和并发 症。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种包载抗体的长循环脂质体制剂。
[0007] 本发明的第二个目的是提供所述脂质体制剂的制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供所述脂质体制剂在制备抗眼内炎症药剂中的应用。
[0009] 本发明提供的一种包载治疗性抗体的脂质体，以抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体 (Infliximab)为治疗药物举例，由磷脂、胆固醇、长循环辅料等附加剂共同组成。本发明基 于眼内炎症的免疫病理学特性，以拮抗炎症级联反应中关键性的细胞因子的特异性抗体为 治疗药物，以长循环脂质体为载体，制备一种高效、稳定、缓释的抗体脂质体。
[0010] 本发明中所述的长循环脂质体一种包载抗体的长循环脂质体，由抗体和脂质体组 成。
[0011] 其中，脂质体为载体，抗体为包封的治疗性抗体，所述的脂质体是以磷脂、胆固醇 和长循环脂质体辅料为材料制成。
[0012] 所述的治疗性抗体可以选自抗IL-17单克隆抗体、抗IFN-Y单克隆抗体、抗IL-2 单克隆抗体、抗Infliximab单克隆抗体或者抗VEGF单克隆抗体；抗体与磷脂的比值为5? IOOu g抗体=Iumol磷脂；磷脂与胆固醇的摩尔比为1. 2?4:1 ;长循环脂质体辅料占脂质 体摩尔量的3%?17%。
[0013] 在本发明的一个优选例中，所述的治疗性抗体为Infliximab单抗。
[0014] 本发明中所述的磷脂可以是大豆卵磷脂（SPC)、蛋黄卵磷脂（EPC)、二棕榈酰磷脂 酰胆碱（DPPC)等。
[0015] 本发明中所述的长循环脂质体辅料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2(DSPE-PEG-Nh2)等。
[0016] 另一方面，本发明还提供了包载抗体的长循环脂质体的制备方法，包括步骤：
[0017] 1)以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2为原料，采用薄膜水化法制备长循环脂质体；
[0018] 2)加入含标记染料的PBS溶液IOml超声水化，振荡，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜 反复挤压后得到标记的包载抗体的脂质体颗粒。
[0019] 在本发明的一个实施例中，所述的标记染料为罗丹明。
[0020] 具体而言，经过长期测试选择了脂质体，又通过反复试验优化条件，本发明最终获 得了高性能的Infliximab长循环脂质体。其制备方法包括步骤：
[0021] 1?制备Infliximab长循环脂质体
[0022] 采用薄膜水化法制备包载抗体的长循环脂质体。称取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或 二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2 (DSPE-PEG-Nh2)(磷 脂与胆固醇的摩尔比为1. 2?4:1 ;DSPE-PEG-NH2占脂质摩尔量的3%?17%)，共溶于氯仿 或三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80?120r ^irT1旋转蒸发除去有机溶剂，然后 加入含抗体（Infliximab、抗IL-17单克隆抗体、抗IFN- Y单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗体 或抗VEGF抗体）的PBS溶液（0. 3?2mg/mL)超声水化，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜反复 挤压后得载抗体的脂质体纳米粒。
[0023] 2.制备罗丹明标记的Infliximab长循环脂质体
[0024] 取大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-NH2 (磷脂 与胆固醇的摩尔比为1. 2?4:1 ;DSPE-PEG-NH2占脂质摩尔量的3%?17%)，共溶于氯仿或 三氯甲烷/甲醇中作为油相，在梨形瓶中80?120r ? min-1旋转蒸发除去有机溶剂，然后 加入含罗丹明123的PBS溶液IOml超声水化，振荡，并用0. 22微米的聚碳酸酯膜反复挤压 后得载抗体的脂质体纳米粒。
[0025] 3. Infliximab长循环脂质体的表征
[0026] 电镜照片显示，本发明制备的Infliximab长循环脂质体形态呈球形，大小均匀， 外观圆整，分散性好(如图1所示）；
[0027] Infliximab长循环脂质体平均粒径为351. 3±58nm (如表1所示）；
[0028] Infliximab长循环脂质体包封率：采用紫外分光光度法测定Infliximab长循环 脂质体对Infliximab的包封率为90. 65±2. 68% ;
[0029] Infl iximab长循环脂质体稳定性考察：将载抗体脂质体混悬液于温度 (25±2) °C、湿度（60±10)%条件下放置保存，1天、15天、30天、60天、90天后，其平均粒 径、分散指数、表面电位、磷脂含量变化(胆固醇渗漏率）和抗体渗漏率无显著性变化（P > 0. 05)，样品放置稳定（如表2所不）。
[0030] 体外释放试验结果表明，Infliximab长循环脂质体中的抗体在180小时内累计释 放百分率小于70%，表明长循环脂质体可显著减慢药物的体外释放。
[0031] 包封率和载药率的测定方法：取0. 5ml载抗体的长循环脂质体，15000r/min离心 分离30min，取上清用紫外分光光度法测定抗体含量。
[0032] 其中包封率采用如下公式计算：
[0033]
【权利要求】
1. 一种包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，由抗体和脂质体组成； 其中，抗体为包封的治疗性抗体，脂质体为载体；所述的脂质体是以磷脂、胆固醇和长 循环脂质体辅料为材料制成； 所述的治疗性抗体选自抗IL-17单克隆抗体、抗IFN- Y单克隆抗体、抗IL-2单克隆抗 体、抗Infliximab单克隆抗体或者抗VEGF单克隆抗体；抗体与磷脂的比值为5?100 y g 抗体：1 y mol磷脂； 磷脂与胆固醇的摩尔比为1.2?4:1 ; 长循环脂质体辅料占脂质体摩尔量的3%?17%。
2. 按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的磷脂选自大 豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱。
3. 按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的长循环脂质 体辅料是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-nh2。
4. 按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的治疗性抗体 为 Infliximab 单抗。
5. 按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，所述的包载抗体的 长循环脂质体的平均粒径为351. 3 ±58nm。
6. 按照权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体，其特征在于，包载抗体的长循环 脂质体对抗体活性成分的包封率为：90. 65±2. 68%。
7. 权利要求1所述的包载抗体的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，包括步骤： 1) 以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺-聚乙二醇-NH2为原料，采用薄膜水化法制备长循环脂质体； 2) 加入含标记染料的PBS溶液，超声水化，振荡，并用聚碳酸酯膜反复挤压后得到标记 的包载抗体的脂质体颗粒。
8. 按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的标记染料为罗丹明。
9. 权利要求1的所述的包载抗体的长循环脂质体的用途，其特征在于，其用途是所述 的包载抗体的长循环脂质体在制备治疗眼部疾病药剂中的应用。
10. 按照权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的眼部疾病是眼内炎、葡萄膜炎、视 网膜炎、视网膜血管炎或者眼部新生血管性疾病。
【文档编号】A61K47/34GK104415331SQ201310374570
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月25日 优先权日:2013年8月25日
【发明者】张锐, 钱江 申请人:复旦大学附属眼耳鼻喉科医院